マウスの消化管吻合の作成

要約

吻合部リークまたは手術後の内訳は、術後合併症と死亡率の主要な原因です。結腸吻合を作成するための手術は、吻合部の治癒のメカニズムを研究するため信頼性が高く、再現性のある方法です。

要約

腸管吻合は、一般科目と創発的操作に実行されます。それでも、吻合部リークは大腸手術の非常に恐れられていた合併症、外科的吻合の 26% までの死亡率 39% まで患者このようなリークをされていると発生する可能性が。現在、吻合部治癒の分子機構の詳細データの少なさが残っています。予防戦略と吻合部リークのための治療法を工夫することは、適切な吻合部の治癒のよりよい理解によって大幅増強する。

マウスモデルはマウスの吻合が他の動物と比較して人間のケースに臨床的に最も似ている以前の研究が示したように最適です。我々 は結腸吻合術吻合部治癒のさらなるイラストは、マウスで簡単に再現できるマウスモデルを提供しています。

概要

腸の外科的吻合の高い恐ろしい合併症は吻合部の内訳や漏れです。腹腔内に管腔内内容の流出を引き起こす、腹部敗血症; に迅速につながる生命脅かすとすることができますは、吻合部のリーク衝撃率 0.3% から 5.5% 次の小腸吻合に変わるや結腸吻合^1,226% と 0.5% の間に上昇します。次のリークの死亡率は、敗血症と腹腔内汚染³の死に急速な進行の迅速な発症のための 39% と高いことができます。予防戦略と治療現在、十分に理解されていない病態に基づいています。

現在、吻合部の治癒は、しばしば比較より広く研究皮膚創傷治癒には比較的貧しいファクシミリをあると証明します。癒しに一連の lag phase で始まる重複のフェーズで発生します。腸吻合の作成後 0-4 日間遅れ相は細胞の残骸の傷を消去する急性炎症反応によって定義されます。次に、3-4 日間で、線維芽増殖とコラーゲンの産生が fibrophasia 相を象徴します。最後に、10 日後コラーゲンリモデ リングの長期間は成熟フェーズと呼ばれます。コラーゲンが堆積⁴まで縫合吻合部の強度は非常に低く、外科的に置かれたステープルの外因性のサポートに依存することが重要です。役割を理解し、タイミング各吻合部創傷治癒および吻合部の故障を予知する解明のサロゲート マーカーと同様に、マクロファージなどによる炎症性細胞型の関与に果たしている腸の壁の層または成功の可能性があります。罹患率、死亡率、およびコロンの操作⁵医療費を大幅に削減します。

マウスのモデルは模倣人間吻合⁶で役に立つ以前の研究で示されています。マウスの結腸吻合モデル、特にコーメンらによって記述方法の例は人気、実績のある、よく研究しながら⁷、これらのモデルを支持する盲または昇順 colocolonic 吻合技術⁸。人間の患者の以前の研究では、回盲部、colocolonic、解剖学的位置の変化でさらに実験モデルの必要性を強調、大腸吻合間リーク率に有意差を示しています。通常の吻合部創傷治癒の⁹に必要な細胞メカニズムを解明するのではなく、意図的に吻合部のリークを作成するモデルの開発を目指しているを追加、一般に使用されるメソッド。ラット モデルは過去に試行されているが、吻合部裂開の料金やリーク (すなわち、膿瘍形成) 人間およびマウス^6,7有意の兆候があります。さらに、ラットよりマウスより遺伝子組み換え実験線があります。これはラットのモデルを吻合部モデルのより少なく有用になります。さらに、ブタとイヌのモデルは、マウスモデル^6,7よりも少ない臨床調査があった。

吻合部の創傷治癒^{10 の過少申告の機構をさらに調査する必要があります促進するマウスモデルにおける大腸吻合の作成のため安全、技術的に簡単な簡単かつ迅速に再現可能な手順を提案します。}.

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プロトコル

次のプロトコルは、オクラホマ大学健康科学センター施設動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) によって承認されているし、研究の動物の使用に関するすべての制度的倫理的なガイドラインに準拠しています。さらに、動物実験に関する制度、州および連邦の規制に従ってすべての実験を行った。

注: このプロトコルの 72 に 12 週齢で女性と男性コンジェニックで飼育された C57BL6/J マウスを使いました。この手順で使用されるすべてのマウスは、ローカルのバイオームに適応する操作の前に、少なくとも 1 週間の私たちの非バリア施設で保たれました。操作の時間供給する動物、経口機械的腸管もプロシージャ前に直腸洗浄を使いました。

1) 吻合の作成

1. オートクレーブ手術用器具、生理食塩水灌漑解決を暖めるし、70% のエタノールで手術表面を徹底的に掃除します。
2. 麻酔を誘導して、気化器に接続されている誘導ボックスにマウスを配置します。マウスを鎮静するまで 1-2 L/分で 2-3% イソフルランを提供します。
3. 低体温症を防ぐために、加熱パッドなど、地球温暖化のデバイスに動物を配置します。
4. 1 つを皮下注入術前抗菌薬予防投与のエンロフロキサシンの 10 mg/kg の線量 0.1 mg/kg ブプレノルフィン (30 g マウス 3 μ g) の術後鎮痛のための時間投与量と 1 つの時間。
   注: 術前・術後の抗生物質がこの操作に必須ではないが制度のガイドラインや動物ケアおよび使用委員会私たちの施設での使用をお勧めします私たちの機関で。
5. マウスの鼻周り麻酔の鼻の円錐形を配置します。操作の間慎重に動物の呼吸を監視し、必要に応じて麻酔の流量を調整します。1 分あたり 30 40 呼吸で呼吸を維持します。
6. 腹部の全体の皮膚の表面から毛を削除するのに後脱毛剤にバリカンを使用します。徹底的に水または 70% エタノールで湿らしたガーゼで脱毛のエージェントを削除します。動物を徹底的に乾燥させます。
7. 腹部を準備中、前に加熱パッドやマウスが手術中にシフトすることを防ぐために各脚の終わりに手術面にマウスの手足をテープします。クロルヘキシジンと腹部を消毒します。剃毛エリアの端に髪の毛と同様、全体の剃毛エリアが含まれます。マウス (図 1 a) に滅菌ドレープを置きます。
   1. ドレープ、前に準備中の腹部を公開するドレープに卵形または長方形の小窓をカットします。
      注: ウィンドウがマウスの腹部全体を公開する必要があります、手足、尻尾、頭、胸郭をカバーします。私たちの操作 (図 1 b) 4 × 3 cm²ウィンドウをカットします。
   2. プロシージャ (図 1) の間に直腸へのアクセスを許可するように、卵形または長方形窓に向かって下端からのドレープの正中線に沿って小さなスリットを作る。
8. 皮膚切開を行います。下腹部の正中線に沿って起動し、剣を縦にハサミで皮膚を切開します。皮膚のみを切開し、腹壁筋肉 (図 2 a) を切断しないでください。
9. 腹壁の正中線を鉗子でつかんで持ち上げて腹部の内容から。世話をしないように腹腔内構造物を傷つける、鋭いハサミで正中線腹部筋の長さを縦に切開します。皮膚切開 (図 2 b) の長さを拡張します。
10. 腸が公開されると、盲腸や小腸、検索、降順と s 状結腸を公開する内側左サイド内臓を回転させます。潤滑ゼリーと鈍プローブ先端をコートし、降順/s 状結腸結腸 (図 3) の識別に役立つ直腸にプローブを慎重に進めます。
    注: 人間と違って、腹部の左上腹部には一般的にマウス盲腸が見つかった。この手順でプローブと腸の壁に穴を開けるように注意してください。腸の壁に穴があいて、プロシージャを終了し、マウスを安楽死させます。
    1. 歯や尖ったピンセットで盲腸を把握しないでください。代わりに非外科的鉗子を使用、綿の先端アプリケータや内臓を回転する穏やかな指操作。
    2. 使用は、露出した腸を保湿し、プロシージャ全体を確実に滅菌生理食塩水を温めた。
    3. コロンは、正中線の左側になります、腸間膜で後腹膜に接続されています。識別後、colotomy を容易にするために部分的に鈍的プローブを撤回します。
11. S 状結腸の横 colotomy を実行します。
    1. 優しく非外科的鉗子 (図 4 a) で骨盤の入口に優れた s 状結腸を把握します。
    2. コロンとコロンの幅に 80-90% の間で及ぶ方向に垂直な s 状結腸の間でカットをする鋭いマイクロはさみを使用して。これは大腸外科の分野のうちの一方の端の収縮を防ぎ、修理 (図 4 b) を助けます。
    3. 腸間膜血管が内臓回転または colotomy の過程で負傷されている場合そっとガーゼや綿の先端アプリケータまで 2 分間圧力を保持します。出血が続くこの時間後場合、は、8の字の出血の点 8-0 モノフィラメント縫合糸を配置します。
       注: 腸壊死やこの後の損傷の兆候を示している場合、プロシージャを終了して人道的な方法あなたの制度上の動物の使用委員会の承認を使用してマウスを安楽死させます。
12. S 状結腸の colotomy を修復します。
    1. カストロヴィーホー針ドライバーを使用、人工肛門を修復する 5-6 簡単な中断 8-0 裁断ポリプロピレン ステッチを配置します。縫合 0.5 mm 刺され互いから離れて 1 mm を配置します。
       1. それぞれのステッチ粘膜よりわずかにより多くの漿膜を取って修理に腸の端を圧延を避けるために注意してください。5 mm 長い尾を残します。縫合糸 (図 4) に誤って周囲腸をキャッチしないように注意してください。
          注: で縫合を開始すると便利です、最後の colotomy の反 mesenteric ほとんどの部分を保存、colotomy の腸間膜の国境近きます。
       2. 修理の進行により、最終的な縫合線を配置する前に、修理にまたがる事前トランス アナル郭清の鈍い先端プローブ。これは狭すぎる修理を防止し、吻合部狭窄率を減らすを助けます。
13. 温めた生理食塩水で満たされた 10 mL の注射器を使用して、何度も腹部に水を引きます。マウス下の表面がずぶぬれになると、マウスを乾燥または乾燥表面に低体温症を避けるためにマウスを移動します。
    1. 過剰なかんがいを吸収する切開部に滅菌ガーゼを使用します。
    2. 最終的な洗浄で滅菌生理食塩水で腹部を埋めます。慎重に直腸に潤滑 18 G 血管カテーテルを進めるし、膨らませる 0.5 - 1 cm³の空気の。これは別ポリプロピレン縫合と吻合部にまたがる滅菌プローブを使用して修復することができますより吻合部に任意のリークを示します。
    3. コロンの除去の前に血管カテーテルを使用して空気を抜きます。
14. 活動性出血がないことを確認します。ある場合、出血が続く場合は、上記のように 1 ~ 2 分位止血縫合の出血の点に直接穏やかな圧力を適用します。
15. Medialized の内臓を正常な解剖学的位置 (図 5 a) にゆっくり戻ります。
16. 腹部切開 (図 5 b) を閉じます。
    1. 4-0 吸収性の編みこみ縫合糸を使用して、腹壁切開の上部に開始し、切開部の下面に仕上げの筋層に沿って実行縫合を配置します。ネクタイをインストールし、5 mm の尾を残して縫合糸をカットします。
       注: は、腹壁閉鎖で腸を誤って含めないようにします。
    2. (図 5) 皮膚を閉じます 4-0 モノフィラメント縫合糸で繰り返します。
17. 全体の動物が暖かく、乾燥、術後低体温症を防ぐためにことを確認します。
18. それが麻酔から回復するように、動物を注意深く監視します。疼痛コントロールのため、手術後 2 〜 3 日のブプレノルフィン 0.1 mg/kg ごと 72 時間を管理します。 回復期間中にマウス検討すべき慎重に毎日膿瘍や敗血症腹膜の兆候。 痛みや苦痛の術後観察を含める必要があります: ハンチング姿勢、食べるか飲む、適切ではないグルーミング, 切開のサイトで正常に治癒の欠如、傷周囲の過剰な炎症の欠如の種類を含む運動の制限や正常ではないネスト。 これらの動作のいずれかを示すすべての動物は、両側開胸下に続いて 10 分の最低 CO₂窒息によりすぐに安楽死する必要があります。
19. 腹腔内感染症や、操作に関連付けられた糞便汚染による敗血症を防ぐために術後 7 日間のマウスの飲料水とエンロフロキサシンの 0.1 mg/mL を混ぜます。

2) 収穫の吻合部組織

1. 吻合部組織を切除、直前には、制度上の動物の使用委員会によって承認された動物愛護法を用いたマウスを安楽死させます。
   両側開胸下を実行する前に、5 分の 2 L/分 100% 二酸化炭素ガス注入型炭酸ガス室にそれらを置くことによって私たち動物の安楽死制度政策に基づいて注意してください: 我々。
2. クロルヘキシジン 70% エタノールが続くと腹部を滅菌します。
3. 再元の正中切開を鋭いハサミで切開します。前の切開の下極でスタートし、(図 6 a) 剣状に上方にこのカットを拡張します。
4. はさみを使用して、カットの筋層、腹膜腔を入力した後、切開部の上下にカットを拡張します。腸切開吻合する付着した可能性があるので、腹部を入力するときに、腸を傷つけるや吻合部を中断することを避けるために注意してください。
5. 慎重に修復された s 状結腸 (図 6 b) を公開する左の内側の内臓回転を実行します。おそらく修理を取り巻く腸に腸の癒着があります。ゆっくりとにべもなく修理のサイトから離れてこれらの癒着を解剖します。吻合部を妨害しないように細心の注意を取る。
   1. 修理のために使用されるポリプロピレン縫合糸のツインテールを配置することによってサイトの修復を識別します。はさみを使用して、開始 1 cm 修理、近位結腸を通じてトランセクト横。この手順 1 cm 遠位吻合部を繰り返します。
6. S 字状のセグメントを削除するには、大幅高級ハサミ (図 7) コロンの後縁に沿って取り付けられている腸間膜からコロンを解剖します。
7. 結腸標本の腸間膜の境界を識別し、縦ファッションで腸間膜の境界線の長さに沿ってカットする高級はさみを使用します。これは、円柱供試体以前に削除 (図 8) からコロンの正方形または長方形のセクションを作成します。
8. コロンのセグメントの削除する前にコロンの抗腸間膜の国境を画定するのにマーキング ペンを使用します。除去した後、マーキングの反対側結腸の長さに沿って縦のカットにします。修正、埋め込み、組織および免疫染色に必要なサンプル組織をカットします。

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結果

7 日術後、吻合する必要がありますも癒されます。吻合部は後より 7 日間は、吻合部の治癒の段階を示して前に、時点で収穫することができます。図 9、組織学的分析の結果、線維 (コラーゲン ヒアリンの汚損によって視覚化) 平滑筋 α アクチン陽性芽によって仲介される応答。ただし、マウス、特に再上皮化および吻合部に芽の濃度の程度間組...

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ディスカッション

確実に成功し、この手順に関連する罹患率/死亡率を最小限に抑えるいくつか主要な手順があります。まず、腸組織の慎重な取扱いの確保し、コロンを公開する内臓を回転させるときに牽引損傷に気をつけましょう。腸や腸間膜に過度の緊張は、吻合部から腸や血管原因腸壊死の損傷をことができます。また、シャープな鉗子または歯の鉗子をいない使用腸を処理します。

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL6/J mice	Jackson Labs	#00664
Fisherbrand Absorbent Underpads, 20" x 24"	Fisher Scientific	14-206-62
Polylined Sterile Field, 18" x 24"	Busse Hospital Disposables	696	Cut a rectangular hole
Isothesia isoflurane	Henry Schein	50033
Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4" x 4"	Fisher Scientific	22-415-469
Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Nair depilatory cream	Church & Dwight Co.	22339-05
Buprenex buprenorphine  0.3 mg/ml	Reckitt Benckiser Pharma Inc	NDC 12496-0757-5
1 cc insulin syringe, 27 G	Becton Dickinson	329412
Chloraprep Shampoo	Medline	APL82287
Webcol alcohol prep swabs	Covidien	6818
BioGel PI surgical gloves	Mölnlycke Health Care	ALA42675Z
Micro Forceps with teeth	Roboz	RS-5150
Fine scissors- sharp	Fine Science Tools	14060-09
Straight serrated forceps	Fine Science Tools	11050-10
Castro-Viejo needle driver	Fine Science Tools	12565-14
0.9% Sodium Chloride Irrigation	Baxter	BHL2F7121	Warm to 37 °C prior to use
10 ml syringe	Becton Dickinson	309604
4-0 Vicryl absorbable braided suture, 18", PS-2 needle	Henry Schein	6546037
Blue monofilament suture 24” BV-1 needle	Henry Schein	8305H	Usually comes double-armed. Cut the suture at the midway point to generate two usable sutures.
Cole-Parmer Microscissors, Standard Grade, Straight, 4".	Cole- Parmer	EW-10818-06
Medline Sterile lubricating jelly	Medline	MDS032273H