車 T 細胞スフェロイド殺害アッセイ

要約

このプロトコルは、リアルタイムで 3 D 構造化癌細胞 (スフェロイド) に対する免疫療法のリダイレクトされた T 細胞 (T 細胞車) の細胞毒性を評価するために設計されています。

要約

免疫療法場合治療不可能な癌との闘いの関心の高まりのフィールドとなっています。免疫療法のすべてのメソッドの間では、キメラ抗原受容体 (車) は、B 急性リンパ性白血病小児 (B オール) で特に最も壮観な結果を得られた T 細胞をリダイレクトされます。車 T 細胞の古典的な検証方法は、特異性の利用と標的細胞懸濁液および異種移植モデルに対して車の T 細胞の機能アッセイに依存しています。残念ながら、体外の観察はしばしば生体内で得られた結果から分離され、多くの努力および動物は別のステップを追加することによって倹約できる: 3次元培養を使用。彼らは動物モデルにしみ込んでいるときに腫瘍細胞の 3次元構造を模倣する潜在的な標的細胞のスフェロイドの生産は、理想的な選択肢を表します。(ここでは CD19 車 T 細胞による例示) 養子細胞療法の検証ツールとして導入された大腸細胞ラインから回転楕円体を生成する、信頼性の高い手頃な価格と簡単な方法を報告する.このメソッドは、回転楕円体の成長が続くことができる高度のライブ イメージング システムと相まって、エフェクター細胞の細胞毒性および腫瘍細胞のアポトーシス。

概要

養子のセル転送 (ACT) は、次世代のがん治療法を表します。それはエフェクター細胞 (T または NK 細胞) の患者への注入に依存します。これらの細胞は、彼らの目標は、腫瘍にそれらを導くし、それを破壊する受容体と遺伝子組み換えできます。最近このアプローチは B 細胞のマーカー CD19 に対するキメラ抗原受容体 (CAR) は彼/彼女の癌の¹を殺すために患者 T 細胞に導入されたときに可能であること示した。人工レセプターである車の場合デザインは特異抗体フラグメントの抗原結合ドメイン エンティティ指定された単一鎖可変フラグメント (scFv) に減少 T 細胞シグナル伝達ドメインにリンクされます。いくつかのデザインがありますが、最も一般的に使用されるバージョンは TCR シグナリングのための CD3z と共刺激の 1 つのドメインから成っている第二世代の車のデザインとして呼ばれます (CD28、4-1 bb, OX40 など)。^1,2。 免疫療法フィールド CD19 車 T 細胞が B 細胞悪性腫瘍^3,4多くの患者を効果的扱われたとき法律のこの新しいフォームへの注意のほとんどの監督。この成功に続いて研究者は限られた成功と固形腫瘍に対する他のエピトープをターゲットに似たようなデザインを悪用しようとします。残念ながら、腫瘍特異抗原とレンダリング車 T 厳しい腫瘍微小の希少性細胞腫瘍⁵に向けて以下の効果的なの。

現在、最も一般的に使用される生体外で検証の戦略は、すでに述べたように固形腫瘍の課題の一部にしか対応二次元 (2 D) システムに依存します。古典的な 2次元培養システムは、機能とこれらのエフェクター細胞の特異性を評価する分子として車 T 細胞とターゲット癌細胞の混合物を含みます。これらの戦略の研究の重要かつ不可欠な部分ですが、とることはありません考慮複雑な形態と癌細胞⁶三次元 (3 D) 構造。回転楕円体と呼ばれる 3 D のシステムで培養された細胞は、遺伝子発現プロファイルで⁷、リダイレクトされたエフェクター細胞による認識に影響を与える可能性があります変更を介して新しい形質を取得します。Birgersdotter と同僚は、3次元培養モデルでのみ栽培におけるホジキン リンパ腫 (HL) セルラインが原発腫瘍サンプル⁸のような遺伝子発現プロファイルを取得を例示します。したがって、回転楕円体または似たような 3 D 培養モデル標準的な 2 D システムとは対照的に関連性の高い方法論提供の文化.このようなシステムは、特定の車の検証プロセスの最後のステップとして見られている生体内での研究に似ています。がんのクラスターの形態を模倣する 2 D システムが失敗することを考えると、回転楕円体を提供する前に車の T 細胞の機能を評価するために同じような形成体内モデル。1 つの調査、Picklらは、ひと上皮成長因子受容体 (HER2) 癌細胞を過剰発現の回転楕円体モデルがインビボ モデル⁹に同様の信号プロファイルを示した識別。これはさらに回転楕円体が車の T 細胞の生体内評価をより関連性の近くでを提供することをサポートします。さらに、回転楕円体に対する T 細胞車検証がもっと批判的にその有効性を評価して、途中で生体内での研究への移動を防ぐデザインの一部を助けるかもしれない¹⁰;したがって、少ない動物を犠牲にして倫理的関係の研究に貢献します。また、回転楕円体を使用してプロトコルはより高価な古典的な 2 D システムよりも、はるかに高速古典的な生体内での研究と比較しています。一緒に取られて、1 つは、回転楕円体研究の包含の場合、in vitro および in vivo の研究をリンクする標準的な方法すぐになる予測できます。

大腸癌細胞株 HCT 116 から回転楕円体の作製を紹介します。この細胞株は、CD19 車 T 細胞に敏感なそれをレンダリングし、臨床的に検証された車の構造を使用して殺害の明確な評価を提供する人間の CD19 分子を表現に変更されました。

プロトコル

1. 大腸癌細胞ラインから回転楕円体の生成

1. (クラスターの分化 19 (CD19) と緑色蛍光タンパク質 (GFP) を表現する安定導入) を洗う HCT 116 セル単分子膜リン酸バッファー生理食塩水 (PBS; 5 mL² 25 cm または 75 cm²フラスコ 10 mL) です。トリプシン (0.5 mL² 25 cm または 75 cm²フラスコ 1 mL) を追加し、37 ° C、5 分で細胞を孵化させなさい。
2. 顕微鏡下で細胞の剥離を確認し、完全なロズウェル パーク記念研究所 160 媒体 (RPMI 1640) 細胞解離酵素を中和 (RPMI 1640 + 10 %fcs + ゲンタマイシン; 10 mL 25 cm²または 75 cm²フラスコ 20 mL)。
3. 500 x gで 5 分間の遠心分離細胞懸濁液上清にピペットを使用して削除し、上下に数回完全 RPM1 1640 培地 5 mL をピペットで再懸濁します。
4. トリパン ブルー色素排除を使用して互換性のあるセルのカウンターの上のセルをカウントします。
5. 500 x gで 5 分間の遠心分離細胞懸濁液上清にピペットを使用してを削除、5 x 10³セル/mL を取得する RPMI 培地で再懸濁します。
6. 細胞懸濁液を滅菌タンクに転送し、マルチ チャンネル ピペットを使用して底板ラウンド 96 ウェルに 200 μ L/ウェルを分配します。
7. プレートをインキュベータ (37 ° C、5% CO₂、湿度 95%) 内自動化イメージング装置に転送します。
8. 集録ソフトウェアにログインしてスケジュールを取得する|船の追加を起動|スケジュール スキャン|容器を作成する: 新しい。
9. スキャンの種類を選択: 回転楕円体。興味のあるチャネルを選択: フェーズ + (回転楕円体成長に) し、明視野、緑 (腫瘍の信号に従う、集録時間 300 ms) と赤 (アポトーシスに従う、集録時間 400 ms)。
   1. 目的の倍率を選択: 10 x。
   2. プレート モデルと引き出しの中にその位置を選択します。画像に井戸の位置を選択します。実験の説明を入力: 名前、細胞の種類、細胞の数。
10. 解析セットアップを延期解析まで後を選択します。タイムラインを右クリックして、選択スキャン グループ間隔の設定] オプションを選択し、設定スキャンを追加すべて4 h との合計は24 h (自動化イメージング装置で培養後、少なくとも 1 h) 目的の開始時間を設定します。
11. イメージング ソフトウェアにログインして回転楕円体の成長のため 2 日ごとにチェックします。
    1. ビュー最近スキャンオプションを選択し、目的の実験にダブルクリックします。画像チャンネル パネルで明視野観察を選択し、楕円の直径を測定する測定イメージ機能ツールを使用します。希望のサイズに到達する回転楕円体に 6 日ほどかかります: 直径の 0.5 mm。追加 50 μ L/ウェル完全 RPMI 培地の培地の蒸発の効果を制限する 4 日目。

2. CD19 車 T 細胞の生成

1. CD19 車 T 細胞の拡大
   注:CD19 車 T 細胞を安定に発現は、前述の¹⁶として健康なドナー PBMCs の一括レトロ ウイルス伝達によって買収されました。CD19 車レトロ ウイルス構造符号化第二世代車は、fmc63 scFv チェーン、CD8 ヒンジと膜貫通ドメイン、4-1 bb 共刺激ドメインおよび最終的に CD3ζ ドメインで構成されています。
   1. 展開して、文化導入された T は、10-11 日のビーズの比が 1:1 にセル抗 CD3/28 磁気ビーズの存在下で細胞します。拡大に伴い中のセルがある完全培地 (VIVO X 15, 5% 血清交換と 100 U/mL 組換えヒト IL-2)。
      注:効率的な拡張のための理想的な密度は 1 に 2 × 10⁶セル/mL です。初期の数に応じて (25 cm²フラスコ 20 ml、40 ml 容量の 75 cm²フラスコ) のフラスコ細胞文化のインキュベーター (37 ° C、5% CO₂、湿度 95%) でセルを拡張できます。
   2. 次の試金のための否定的な制御グループとして非導入 PBMCs (モックと呼ばれる) CD19 車 T 細胞に平行拡張プロトコルが含まれます。
   3. 3 日目以降、毎日新鮮な媒体を追加し、必要に応じてより多くの培養フラスコにセルを分割します。
   4. 日 10-11, 500 x gで 5 分間遠心分離細胞の上清を除去し、すべてのセルを結合して 1 つの 50 mL チューブに新鮮な完全なメディアの ~ 30 mL の細胞を再懸濁します。
   5. 磁気ビーズを培地から分離する磁気スタンドに再懸濁細胞を含む 50 mL のチューブを配置します。
   6. チューブの側面に収集するビーズの 2-3 分待ちます。
   7. 磁気ビーズ コレクション ゾーンに触れることがなく培養ピペットと新しい管への転送を削除します。
   8. 最終培地のビーズの数を制限するもう一度ビード除去 (2.1.5–2.1.7) に関する手順を繰り返します。
   9. 再懸濁しますとセルをカウント、2 x 10⁶セル/mL の完全培地では、1 を密度を調整します。
   10. 少なくとも 4 一晩まで h の細胞を休ませます。その後、直接-80 ° C でフリーズし、長期保存のため次の日にバイアルを液体窒素タンクに転送します。また、1 つを延ばすことが残りの部分まで一晩即座の使用のため。
2. 主な T 細胞の CD19 車式コントロール
   1. 数字は若干異なるかもしれませんまたはフリーズ/フリーズ解除後適度に一晩かけて培養後、増殖させた T 細胞の数をカウントします。
   2. 5 x 10 両方 CD19 車から⁵セルと流れ cytometry チューブを分離するモック主な T 細胞を転送します。
   3. 洗浄フロー バッファーの 200 μ L のセル (2 %pbs で FBS) と遠心チューブ 500 x gで 5 分間で、培養培地によるアーティファクトの解消を取得する洗浄手順を繰り返します。
   4. (ビオチン ヤギ抗マウス igg 抗体, F(ab') ₂、おフラグメント特定) 一次抗体を準備するには、フロー バッファーで希釈 1: 200 を実行します。
   5. チューブあたり抗体ミックスの 100 μ l 細胞を再懸濁し、15 分二度余分な抗体を削除する前の洗浄のステップを繰り返すため氷の上を孵化させなさい。
   6. 1: 400 フロー バッファーで希釈、二次抗体 (ストレプトアビジン-PE) を準備します。
   7. チューブあたり抗体ミックスの 100 μ l 細胞を再懸濁し、15 分余分な抗体を取り除くために、二度前の洗浄のステップを繰り返すため氷の上を孵化させなさい。
   8. チューブあたり 200 μ L フロー バッファーので細胞を再懸濁し、流れの cytometer で分析します。
   9. 正および負のゲートを設定し分析 CD19 車使用モック T 細胞は、T 細胞をそれに応じて導入。

3. 3D 腫瘍回転楕円体殺害アッセイ

1. 希望のサイズに到達後 6 日または一度回転楕円体、インキュベーターからプレートを取り外します。マルチ チャンネル ピペットを使用して、優しく回転楕円体プレートから完全 RMPI 1640 培地の 100 μ L/ウェルを削除します。
   1. この手順では、内部の方のヒントを角度、回転楕円体の乱れを最小限にするために井戸の底との接触を避けること、96 ウェル プレートの壁。残りのボリュームは、約 100 μ L をする必要があります。
2. 完全 RPMI 1640 培地の 9.95 ml アネキシン V 赤の 50 μ L を混合することによってアネキシン V 赤の 1: 200 ソリューションを準備します。
3. アネキシン V 赤ソリューション 1: 200 の 100 μ L/ウェルを追加します。
4. プレートを 15 分間インキュベーター (37 ° C、5% CO₂、湿度 95%) に転送します。
5. 15 mL チューブの遠心分離機 500 x gで 5 分間でそれらはピペットを使用して上澄みを除去し、上下完全 RPM1 1640 培地 2 mL で数回ピペッティングによる再懸濁します導入された車 CD19 T 細胞を収穫します。
6. トリパン ブルー色素排除を使用して互換性のあるセルのカウンターの上のセルをカウントします。
7. 500 x gで 5 分間の遠心分離細胞懸濁液上清にピペットを使用してを削除、2 x 10⁵セル/mL を取得する RPMI 培地で再懸濁します。
8. 細胞懸濁液を滅菌タンクに転送、マルチ チャンネル ピペットを使用して下部の回転楕円体プレート ラウンド 96 ウェルに 100 μ L/ウェルを調剤します。
9. プレートをインキュベータ (37 ° C、5% CO₂、湿度 95%) 内自動化イメージング装置に転送します。
10. 集録ソフトウェアにログイン、取得するスケジュールを選択します。
    1. スキャン タイムラインを右クリックし、タイムラインの編集を選択します。スキャン グループを右クリックし、それを削除します。タイムラインを右クリックし、選択スキャン グループ間隔の設定] オプションを選択し、設定のスキャンを追加すべて1.5 h との合計は24 h。
    2. (自動化イメージング装置で培養後、少なくとも 1 h) 目的の開始時間を設定します。スキャンのスケジュールを保存を選択します。

4. 自動画像解析

1. 買収にログインし、表示最近のスキャンオプションを選択を起動の解析オプションを選択します。新しい解析の定義を作成するを選択 |解析タイプ: 回転楕円体。画像チャンネル (相 + 明視野、緑と赤) を分析するを選択します。
2. 少なくとも 10 の代表的な画像を選択: 通常、条件と少なくとも 3 時間のポイント (初め、中間、終了、獲得の) あたり 1。
3. デフォルトのプレビューは、全体画像のスタック上のプロシージャを分析します。
4. 明視野マスクのパラメーターを変更します。代表的なパラメーターです: 感度 10、穴埋める 1,000 μ m²、最小面積 1,000 μ m²。全体画像のスタックをプレビューし、選択したパラメーターが、回転楕円体を正確に検出を確認します。
5. 緑のマスク (GFP) のパラメーターを変更します。代表的なパラメーターです: 半径 200 μ m としきい値 3 シルクハット セグメンテーション GCU、エッジは切り離し、穴を埋める 5,000 μ m²、調整サイズ-2 ピクセル エリア分 3,000 μ m²。全体画像のスタックをプレビューし、選択したパラメーターが、回転楕円体を正確に検出を確認します。
6. 赤のマスク (アネキシン V) のパラメーターを変更します。代表的なパラメーターです: 半径 150 μ m としきい値 2 シルクハット セグメンテーション GCU、エッジは切り離し、穴を埋める 5,000 μ m²調整のサイズを 0 ピクセル、エリア分 1,000 μ m²。全体画像のスタックをプレビューし、選択したパラメーターが、回転楕円体を正確に検出を確認します。
7. アナライザーを起動します。
   1. 分析が完了すると、興味の測定を抽出します。解析ファイルをクリックし、グラフ メトリックスオプションを選択します。関心・ スキャン ・井戸のメトリックを選択します。通常、明視野の境界内の総赤と緑の強度は、明視野観察マスク (図 3) によって決定されます回転楕円体の境界に蛍光信号を制限することによって最も正確な測定を与えます。「データ エクスポートの」をクリックしてしていくつかのファイル形式で選択したメトリックを抽出します。
8. 分析対象のファイルを選択して画像や動画の抽出に進むし、画像を書き出し、ムービーのオプションを選択します。2 つのオプションがあります、どちらか「として表示」取得画像と映画としてどちらか「として保存」サード パーティ ソフトウェアを介して外部解析用の生データを取得するためには、イメージング ソフトウェア (通常合成画像) に見られます。

結果

図 1に見られる、フローサイトメトリーによる T 細胞 (図 1 a) 上 CD19 車の表現と HCT116 腫瘍細胞株 (図 1 b) に CD19 のレベルのレベルをチェックすることが重要です。図 2は、典型的な回転楕円体実験の結果を示すものです。自動化イメージング装置は 4 つの異なるチャンネルで写真...

ディスカッション

将来のがんの治療法を検証する革新的なツールとして回転楕円体の使用年の関心の高まりのフィールドとなっています。回転楕円体は、古典的な 2 D の in vitro 解析および生体内の評価間の中間ステップを表しています。さらには、遺伝子発現プロファイル⁷だけでなく、腫瘍微小環境の模倣の面でその効力についての約束の多くを保持しています。この文書で示されるプロト...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	SIGMA-ALDRICH	D8537-500ML	Lot Number: RNBG7037
75 cm² growth area flasks	VWR	430639	Lot Number: 2218002
75 cm² growth area flasks	VWR	734-2705	Lot Number: 3718006
Trypsin-EDTA	SIGM-ALDRICH	T3924-100ml	Lot Number: SLBTO777
RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 mL	Life Technology (Gibco)	21875-091	Lot Number: 1926384
Fetal Bovine Serum	Gibco	10500064	Lot Number: 08Q3066K
Gentamicin	Thermo Fischer	15750060	Lot Number: 1904924A
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fischer	15250061	Lot Number: 1886513
96 well plate, round bottom	VWR	734-1797	Lot Number: 33117036
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	Thermo Fischer	11132D	-
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L	BioNordika	BE02-060Q	Lot Number: 8MB036
CTS Immune Cell Serum Replacement	Thermo Fischer	A2596102	Lot Number: 1939319
IL-2 Proleukin	Novartis		Lot Number: 505938M
IncuCyte Annexin V Red Reagent	Essen Bioscience	4641	Lot Number: 17A1025-122117
Reagent Reservoir	VWR	89094-672	Lot Number: 89094-672
15 mL tubes	VWR	734-1867	Lot Number: 19317044
anti-human CD19-PE	BD Biosciences	555413	Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-066-072	Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583
Streptavidin-PE	BD Biosciences	554061	Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328
HCT 116 Colorectal Carcinoma Line	ATCC	CCL-247	-
Incucyte S3	Essen Bioscience