誘因とマウス実験近視モデルの評価

要約

このプロトコルはマウス実験近視モデル新たに設計を使用してマウスで誘導眼鏡と眼のパラメーター測定の安定性と再現性のある結果を達成するために必要な技術の完全なプロセスをについて説明します。

要約

近視のマウスモデルでは、比較的簡単な遺伝的操作のため近視研究の強力なツールをすることができます。動物で近視を誘発する 1 つの方法は、週間 (レンズによる近視、LIM) 明確なマイナス レンズを目の前に置くことです。ただし、研究所から研究所する誘因と評価の現存するプロトコルによって異なります。ここでは、新たに設計を使用してマウスの LIM 眼鏡を誘導する、実践的な再現性のある方法について述べる。安定しながらマウスの目の前に、レンズにより、レンズ洗浄用または局所にメソッドの修正は薬剤管理です。表現型は、堅牢で効率的との差異は小さい。ここで説明した方法は、実験のため可能な限りの期間を拡張する離乳直後後のマウスに適用できます。我々 はまた与えた技術屈折と軸の長さの測定で再現性のある結果を達成するためのアドバイスします。ここで説明した手順のプロトコルと思います、詳しい記事は近視と近視実験をよりスムーズに行う研究室データに匹敵する研究者を助けることができます。

概要

近視の有病率が近年、その発症と進行のメカニズムはまだほとんど知りませんが¹。近視の最も特徴的な表現型は、網膜の合併症や²も失明のリスクを増加させる軸長さ (AL) の伸びです。近視の病態を理解し、効果的な治療法の開発、堅牢な近視眼的な動物モデルと安定した表現型の評価が必要です。

動物で近視状態を誘導するため簡単に、2 つの方法が存在する: フォーム剥奪の近視 (FDM) とレンズによる近視 (LIM)³。前者は目の前にディフューザーを配置または近視の表現型の結果、眼球の正常な発展に影響を与えるイメージをあいまいにする眼瞼縫合糸します。後者の場所は、網膜の後ろに焦点を移動する目の前にレンズを引いた。網膜は、フォーカスのシフトを検出し、網膜とフォーカル ポイントを再配置する眼球の伸長します。FDM、まぶたが閉じているか、目の前にディフューザーを修正されています後ほとんどないさらにメンテナンスが必要です。林は、レンズがそれを透明に保つために洗浄するため取られる必要があります。したがって、FDM は誘導されることが技術的には比較的簡単です。FDM と LIM のメカニズムが異なるし、どの方法を模倣人間で近視よりはまだ議論³中。LIM の強みの一つは、FDM、少なくともマウス⁴の場合に比べてより強い表現です。

近視を誘導するために使用されている動物は、マウス⁴モルモット⁸、木ジネズミ目⁷サル⁶雛⁵に含まれます。繁殖のため低コスト、豊富なの入手可能な抗体遺伝子操作の可能性を考慮したマウスことができた最初の選択肢近視の動物モデルとして。しかし、他のより大きい動物と比較して、レンズまたはマウスの目の前にディフューザーを修正は比較的困難など若いマウスの特に離乳後。局所投与または複数の中間アイ測定を必要とする実験、またリムーバブル フレームに必要なとしてます。もう一つの課題は、洗練された技術とデバイスを評価する必要がありますマウスの眼球の小さな形態変化です。までに、異なる誘導と異なる研究チームで使用されるプロトコルを測定を比較し、研究所全体の結果を繰り返すは難しいです。詳細で標準的なプロトコルが必要です。

以前の作品は、レンズまたは接着する⁹、¹⁰とヘッド マウント型ゴーグル フレーム^11,12のステッチなど、マウスの目の前にディフューザーを修正する複数の方法を説明します。我々 は堅牢で効率的なマウス実験近視を誘発する ameliorated プロトコルを開発する当社の新設計フレームと存在するヘッド マウント型ゴーグル テクニクス^11,12,13を組み合わせます。プロトコルは、生後 21 (p21) 離乳後すぐに若いマウスに適用できます。我々 も屈折や AL などの表現型の安定性と正確な評価プロセスの最適化。我々 はこの標準化されたプロトコルは、近視眼的なマウスの近視研究のより簡単にアクセス可能なモデルを作成する助けることができる願っています。

プロトコル

すべてのプロシージャは、動物研究慶應義塾大学医学部の倫理委員会が承認した眼科と視覚に関する研究、慶應義塾大学で動物実験に制度のガイドラインにおける動物の使用の ARVO 声明を遵守大学、および動物の研究: 研究の動物の使用のためのレポートので生体実験 (到着) ガイドライン。

1. マウスの眼鏡を組み立てる

1. 眼鏡 (図 1 a) の組み立てに必要なパーツを準備します。各マウスのすべて以下の準備: ヘッド マウント型ナイロン樹脂棒、1 つ大きく、1 つ低いチタン フレーム、1 プレーン、M1.4 ネジの 1 つのナット、1 つ M1.4 ネジ長さ 10 mm の実験の目的に応じて適切な力を持つ 2 つのレンズ0.3 mm の厚さで M1.4 ネジのワッシャーと 2 つの人工爪ヒント (材料表)。
   注意: 異なる高さにフレームの 2 種類が存在します。1 つのマウスの 1 つの高いフレームと 1 つ下のフレームがセットとして使用されます。高いフレームは、ビジョンのフィールドを左右対称にするために低いものの上置いてください。フレームとレンズは特別に設計され、著者らの研究グループによって製造されました。これらは、この記事の対応する著者に連絡して利用できます。他の部分は、工具の小売店で見つけることが。
2. 右と左の目のフレームを個別に組み立てます。
   1. 最高の保護効果を達成するために外方向に直面する爪の先端を配置します。爪の先端とフレーム マウス視界 (図 1 b) をマスキングを避けるために約 130 ° の間の角度を調整します。シアノアクリ レート系接着剤を使用してフレームに人工爪のヒントを遵守します。
      注: 爪のヒントはマウスで引っかかれてからレンズを保護するために助けることができます。爪の先端の方向を反対にする必要があります高いフレームと下部フレームで使用されるため右目と左目それぞれ。
   2. 接着剤を使用して爪の形を調整する爪切り、完全に乾燥をさせて、少なくとも 12 時間待機は 1 cm × 1 cm カットしてトリミングするヒントします。
   3. シアノアクリ レート系接着剤を使用して、フレームにレンズを接着します。手でフレームにレンズを入れて、フレームを水平に保持します。レンズの端からシアノアクリ レート系接着剤を注入し、表面張力によって接着剤の普及。
      注:、接着剤がレンズをむしばむし透明度に影響を与える、とても接着剤はレンズの周辺部を触れるだけを確認します。近視を誘発するのに制御とレンズ マイナス 0 ディオプター (D) プラノ レンズを使用します。マイナス レンズ (–50 D、–10 D) のさまざまな力の効果はずっと⁴を他の場所で説明されています。近視の誘導を最大化、–30 D レンズを近視を誘発する推奨します。FDM は、ディフューザーとして 1.5 mL マイクロ チューブのキャップにレンズを変更するだけで、同じデバイスを誘起することができます。
3. 一緒に棒の平らな側面からワッシャー ナイロン棒にネジを締めます。それぞれ眼鏡や、実験の前に棒を準備し、さらに使用 (図 1 c) の在庫します。
   注: プロトコルはここで一時停止することができます。

2. 屈折および AL のベースラインの測定。

1. 瞳孔を散大させるのに 5 mg/mL トロピカミドと眼球の両側に 5 mg/mL フェニレフリン塩酸塩を含む mydriatic のエージェントの一滴を適用します。全身麻酔の前に少なくとも 5 分を待ちます。
   注: [全般] 瞳孔を散大させる麻酔後の測定に影響を与えるリバーシブルの白内障の原因となります。常に全身麻酔瞳孔を散大させるし、少なくとも 5 分待ちます。一滴 (約 0.05 mL) mydriatic エージェントは、エージェントは次の手順に害をしないしながらマウス眼の瞳孔を拡大のために十分です。
2. 全身麻酔下にマウスを置きます。それは麻酔が完全にまで眼をぶつけてからマウスを保つためにそっとマウスの背中の皮膚を把握します。マウスは、テーブルの上で自由に置いたとき、は移動しない場合、十分にする麻酔の深さを判断します。
   メモ: ミダゾラム (40 μ g/100 μ L)、メデトミジン (7.5 μ g/100 μ L) およびブトルファノール酒石酸 (50 μ g/100 μ L) の組み合わせは、0.01 mL/g 腹腔内投与のボリュームを持つマウスのため全身麻酔のためここで使用されます。一般的に、5 分以内で眠りに落ちるマウスが必要です。全身麻酔の長い時間は、低体温、徐脈を引き起こします。測定では、麻酔薬の注射後 10 分以内のすべての測定値を仕上げに全身麻酔の潜在的な影響を避けるためにお勧めします。麻酔薬のカクテルは、ブトルファノールは鎮痛効果が約 4 時間を提供します。全身麻酔のための適切なレシピは、機関によって異なる場合があります。
3. 赤外線 photorefractor^4,9,14を使用してマウスの目の屈折率を測定します。瞳孔の中心に最初のプルキンエ イメージを維持し、光軸に沿って屈折を測定マウスの目の一つの方向を調整します。測定後反対側の目と同じ手順 (図 2 a) を測定します。
   注: 屈折のため測定値は光軸に沿ってマウスの目の位置によって強く影響されます。瞳孔の中心から ± 3 度以内である最初のプルキンエ イメージを揃うようにします。スペクトル領域光干渉 (SD oct) システムのワークベンチは、屈折測定⁴生の方向の微調整に使用かもしれません。
4. SD OCT システム^4,15,16を使用してマウスの目のアルを測定します。角膜頂点から光神経 (図 2 b) に近い明るい境界までの距離として AL を定義します。
   注: 屈折の測定と同様に、マウスの目の方向によって、アルを影響強く。角膜の頂点は、角膜の表面に点のようなリフレクションによって確認できます。網膜側の境界と光神経の時点で非常にぼんやりとなります。境界を測定するため十分に明確が光神経からあまり遠くないように少しの方向を調整します。

3. マウス頭蓋にフレームの固定。

1. それぞれの目の乾燥を防ぐために 0.1% 精製されたナトリウム ヒアルロン酸目薬の一滴を適用します。
   注: 点眼薬目の表面で屈折と軸の長さの測定値に影響します。すべての測定が終了するまで点眼麻酔後に使用しないでください。
2. 粘土製の斜面に麻酔下のマウスのあごを置くまたは頭蓋の先行のために枕が水平になるように、何かが使えます。
3. 髪の毛を殺菌し、耳と目の 70% エタノール綿棒を使用しての頭皮。
4. 耳と約 0.8 cm²外科はさみとピンセットを使用してために、頭蓋骨を公開するための目の間の皮膚をカットします。歯科用エッチング液と綿棒を使用して、骨膜を削除します。外科はさみとピンセット各マウスの手術の前に 70% エタノールで消毒します。
   注: 髪の毛をクリッピングと滅菌手袋を着用して必要があります。 この手順の前に関連する動物の世話委員会の規定を確認してください。ほとんどの場合、歯科用エッチング液は自己治癒の歯科用接着システムでの添付ファイルの 1 つとして見つけることが。歯科エッチング液を使用できない場合は、代わりに 70% のエタノールを使用します。
5. 右の位置に棒を固定するためのレンズなしフレームのセットを組み立てます。マウスの頭の上にフレームを配置します。慎重に両方の目は空のフレームの真ん中にいるようにフレームの位置を調整します。
6. 自己を治す歯科用接着システムを使用して、マウスの頭の上にスティックを添付します。マウスの目に重要システムの流れの液体を聞かせしないように注意します。
   注: 自己を治す歯科用接着システムを使用する方法は製品間で異なるです。慎重に指示を参照してください。
   注意: 歯科用接着システムで試薬のいくつかは有害である可能性があります。
7. 約 5 分間待ってから、スティック (図 3 a) の位置を変更することがなく慎重にフレームとナットを取る。
8. 腹腔内にマウスを麻酔から回復するよりすばやく 0.75 mg/kg アチパメゾール塩酸を注入します。マウスを完全に回復するまで、個々 のケージに入れます。放置しないでください、マウスまでそれは胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻しました。プロトコルはここで一時停止することができます。

4. 近視誘導やその後のメンテナンスの開始

1. マウスの麻酔から完全に回復させる手術後少なくとも 24 時間待ちます。棒を持ち、レンズとフレームをつけます。この時点 (図 3 b) で誘導を開始します。
   注: 麻酔からの回復の間に不快感を最小化し、凝固する歯科用接着システムの十分な時間を与える、強くお勧めマウスは完全に麻酔から回復後、フレームにかける。接着システムのレジン セメントは完全に頭皮のカットをカバーします。したがって、感染の予防、手術後の痛みの改善のため特定の手術後の治療は必要ありません。フレームに置くことの最初の時間の直後にマウスがレンズの存在を意識している以上になるし、多くはそれを傷つけます。総行動は、数時間後普通に帰れます。レンズを持つマウスは通常のマウス同じ密度と保つことができます。
2. フレームを取り外して、きれいなレンズと綿棒と指の爪のヒント、少なくとも週に 2 回レンズの透明度を維持するために。
   注: 削除、フレームに入れて麻酔下マウスを置く必要はありません。苦痛を減らすことができる彼らと働いている間にハングそれらを持ってではなく、座ってマウスのためのサポートを提供します。
   1. 中間測定が必要な場合、麻酔下マウスを置くし、前述したようにマウスを測定します。マウス麻酔からの回復の後の誘導を継続できます。
3. 週に少なくとも 2 回、ケージをきれい。
   注: このヘルプをレンズの透明度を維持するために。マウスと生ゴミを濾液にケージ下部の間ネットを置くこともできます。
4. 体重と総行動を監視します。実験全体のプロセス中にそのままマウスを年齢と同じ、それらを比較します。
   注: いくつかの掻破行動を除いて体重を含む重要な変更はありませんでした未処理のねずみで実験マウス。

結果

なら、すべての必要な部品 (図 1 a) で最初に、チェックしてください。図 1 bに組み立てられた眼鏡の部分の例を示します。フレームとナットが本体を除いて他のすべての部分、それぞれのマウスの使い捨て。図 1 cに完成した眼鏡のセットを示します。年齢別でマウスに合わせて 2 つのフレーム間の角...

ディスカッション

このプロトコルのいくつかのステップは確実にマウスの頭に安定して固定するのに眼鏡を偉大な注意を払われる必要があります。骨膜は、歯科用接着システムを使用する前に完全に削除する必要があります。頭蓋骨には、血液も注意してクリーンアップする必要があります。接着剤のアプリケーションの直後に若干の調整は受け入れ、頻繁系接着剤が乾燥する前にスティックを移動しないで?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
screw	NBK	SNZS-M1.4-10
washer	MonotaRO	42166397
nut	MonotaRO	42214243
stick	DMM Make	none	designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make.
frame	DMM Make	none	designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make.
lenses	RAINBOW CONTACT LENS	none	customized for mice use by the company
cyanoacrylate glue	OK MODEL	MP 20g
dental adhesive resin cement	SUN MEDICAL	super bond	contains the etching liquid used for removing the periosteum of the mouse skull
infrared photorefractor	Steinbeis Transfer Center	none	designed and offered by Dr. Frank Schaeffel from university of Tübingen
Spectral domain OCT	Leica	R4310
Tropicamide, Penylephrine Hydrochloride solution	Santen	Mydrin-P
midazolam	Sandoz K.K.	SANDOZ	components for the anesthetic
medetomidine	Orion Corporation	Domitor	components for the anesthetic
butorphanol tartrate	Meiji Seika Pharma	Vetorphale	components for the anesthetic
0.1 % purified sodium hyaluronate	Santen	Hyalein
atipamezole hydrochloride	Zenoaq	antisedan