MRNA の構造変化を誘導培養と細胞の形で使用して小分子を調査するには

要約

RNA を対象とした小分子の存在下で興味の mRNA シーケンスの二次構造を決定するプライマー拡張 (形状) を用いて分析両方生体外でそして細胞の選択的 2'-水酸基のアシル化の詳細なプロトコルします。この記事で紹介しました。

要約

RNA を対象とした低分子化合物の医薬品開発の過程でターゲット RNA シーケンスとの相互作用によって構造変化の解明が望まれます。我々 ここの提供、詳細な体外とセルの選択 2' ヒドロキシル アシル化はプライマー拡張によって脊髄性筋萎縮症 (SMA) の生存の実験的な薬の存在下で RNA の構造変化を研究する (形状) プロトコル分析運動ニューロン (SMN)-C2 と SMN2 遺伝子の mRNA のエクソン 7。体外形 SMN2 エクソン 7 を含む 140 のヌクレオチドの RNA シーケンスは T7 RNA ポリメラーゼによる転写、召-C2 の存在下で折り返されているおよび軽度 2'-ああアシル化試薬 2-methylnicotinic 酸 imidazolide (NAI) によって後で変更します。この 2'-オハイオ-NAI 付加がさらに³²P 標識プライマー拡張による、ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) による解決。逆に、細胞の形で 2'-オハイオ州のアシル化では、細胞が召 C2 バインド細胞 RNA をその場で行われます。PCR と次世代シーケンスが、形状による突然変異のプライマー拡張と共に、SMN2 遺伝子のエクソン 7 の mRNA シーケンスはそれから増幅されます。2 つの手法を比較すると、体外の形状はよりコスト効果の高い方法で、結果を可視化する計算力を必要としません。ただし、in vitro RNA の SHAPE 派生モデルは、RNA 結合タンパク質とのすべての相互作用の損失の可能性が高いため、携帯電話のコンテキストの二次構造から逸脱するが時々。セルの形状は放射性物質職場を必要としないし、携帯電話のコンテキストでより正確な RNA 二次構造が得られます。さらに、細胞の形状は通常適用体外に比べると次世代シーケンサーを利用してより大きな範囲の RNA シーケンス (~ 1,000 ヌクレオチド) 形状 (~ 200 のヌクレオチド)、通常のページの分析に依存しています。SMN2 mRNA のエクソン 7 の in vitro およびセル内の図形が派生した場合に備えて RNA モデルは互いに似ています。

概要

プライマー拡張 (形状) を用いて選択 2'-水酸基のアシル化は、興味の RNA シーケンス中の各ヌクレオチドの動態を測定し、単一ヌクレオチド分解能¹二次構造の解明の方法です。図形の方法論の in vitro 条件^2,3,4 (定義されたバッファー システムで浄化された RNA) の両方生きている哺乳類セル^5,6セカンダリを調査するために開発されています。中程度の長さの RNA シーケンスの構造 (通常 < セル内の図形の 1,000 ヌクレオチドと < 体外形の 200 のヌクレオチド)。これは RNA と相互作用する低分子代謝物^2,4,7,8が結合する受容体 RNA の構造変化を評価し、機械的操作の研究特に便利RNA を対象とした薬剤開発^9,

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プロトコル

1. 体外の形状

注:プロトコルは、公開されたプロトコル¹から変更されます。

1. RNA テンプレートを準備してください。
   注:T7 転写用のテンプレートには、合成二本鎖 DNA (dsDNA)、EcoRI/病原制限の endonuclease の部位、PCR、pET28a などの一意のペアを運ぶ大腸菌ベクトルどちらか挿入によって増幅を命じられました。Pcr のためのプロトコルを次に示します。
   1. 以下の材料を混ぜて: 50 μ L の PCR マスター ミックス (材料の表を参照)、10 μ M の各プライマーの 2 μ L (シーケンスの表 1を参照)、200 2 μ L とジメチルスルホキシド (DMSO) の 3 μ L H₂o. 因数 2 PCR に 41 μ dsDNA テンプレートの ngチューブ (各チューブは、50 μ L の反応混合物を含んでいる)。
   2. 熱 cycler を次のように設定: ステージ 1) 95 ° C、30 秒。段階 2) 95 ° C、20 s;ステージ 3) 56 ° C、20 s;ステージ 4) 72 ° C、20 s;30 ....

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結果

以前、変調器をスプライシング RNA、召 C2、SMN2 遺伝子の mRNA のエクソン 7 の AGGAAG をモチーフにした対話し、召 C2⁶存在下で RNA の構造変化を評価するために図形を使用しました。召 C2 の結合部位は、FDA が承認したアンチセンス オリゴヌクレオチド (阿蘇) sma の nusinersen と縛りがイントロン 7^27,28 (

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ディスカッション

体外形で質の高い均一な RNA テンプレートを使用するが重要です。しかし、T7 転写、しばしば異種シーケンス³⁶が得られます。特に、非取るにたらない利回り³⁶と 3' 末端に ± 1 ヌクレオチドのシーケンスは、通常ポリアクリルアミド ゲルの浄化による除去が困難。異種の RNA テンプレートは、時々 難しく結果を解釈するプライマー拡張製品のシーケンス ゲ?.......

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNA oligonucleotide	IDT		gBlock for >200 bp DNA synthesis
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix	Thermo Fisher	F566S
NucleoSpin gel and PCR clean-up kit	Takara	740609.50
MegaScript T7 transcription kit	Thermo Fisher	AM1333	Contains 10x reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase
DEPC-treated water	Thermo Fisher	750023
2x TBE-urea sample buffer	Thermo Fisher	LC6876
40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1)	Bio-Rad	1610146
10x TBE buffer	Thermo Fisher	15581044
Nalgene Rapid-Flow™ Filter Unit	Thermo Fisher	166-0045
Kimwipe	Kimberly-Clark	34133
TEMED	Thermo Fisher	17919
SYBR-Safe dye	Thermo Fisher	S33102
6% TBE-urea mini-gel	Thermo Fisher	EC6865BOX
ChemiDoc	Bio-Rad
T4 PNK	NEB	M0201S
γ-32P-ATP	Perkin Elmer	NEG035C005MC
Hyperscreen™ Intensifying Screen	GE Healthcare	RPN1669	calcium tungstate phosphor screen
phosphor storage screen	Molecular Dynamics	BAS-IP MS 3543 E
Amersham Typhoon	GE Healthcare
NAI (2M)	EMD Millipore	03-310
GlycoBlue	Thermo Fisher	AM9515
SuperScript IV Reverse Transcriptase	Thermo Fisher	18090010	Contains 5x RT buffer, SuperScript IV
dNTP mix (10 mM)	Thermo Fisher	R0192
ddNTP set (5 mM)	Sigma	GE27-2045-01
large filter paper	Whatman	1001-917
Gel dryer	Hoefer	GD 2000
QIAamp DNA Blood Mini Kit	Qiagen	51104	Also contains RNase A and protease K
SMN2 minigene34	Addgene	72287
Heat inactivated FBS	Thermo Fisher	10438026
Pen-Strep	Thermo Fisher	15140122
Opti-MEM I	Thermo Fisher	31985062
FuGene HD	Promega	E2311
TrpLE	Thermo Fisher	12605010
DPBS without Ca/Mg	Thermo Fisher	14190250
TRIzol	Thermo Fisher	15596018
RNeasy mini column	Qiagen	74104	Also contains RW1, RPE buffer
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254	Contains DNase I and RDD buffer
Deionized formamide	Thermo Fisher	AM9342
MnCl2•4H2O	Sigma-Aldrich	M3634
random nonamer	Sigma-Aldrich	R7647
SuperScript First-Strand Synthesis System	Thermo Fisher	11904-018	Contains 10x RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase
AccuPrime pfx DNA polymerse	Thermo Fisher	12344024
NextSeq500	Illumina
NucAway column	Thermo Fisher	AM10070	for desalting purpose