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要約

ここで説明は、動物組織細胞レベルでの細菌の遺伝子発現解析の方法です。このメソッドは、組織環境への応答で感染症に細菌の人口の内で発生する表現型の多様性を研究するためのリソースを提供します。

要約

細菌の病原性遺伝子は多くの場合転写レベルで異なる環境シグナルに応答する複数の要因によって調整されます。いくつかの要因は病原性遺伝子に直接作用します。他の人は下流のレギュレータの式やレギュレータの活動に影響を与える信号の蓄積を調整することによって病態を制御します。規制は、生体外で成長中広く研究されている、しながら比較的感染時に遺伝子発現を調整する方法について少し知られています。そのような情報は、特定の遺伝子産物の治療的介入の候補であるときに重要です。転写のアプローチのように量的なリアルタイム RT-PCR 法と RNA シーケンスは、グローバル レベルでの遺伝子発現を調べるが、ホストの RNA とサンプルと比較して細菌の RNA の低い豊富を含む多くの技術的な課題に苦しむの強力な方法RNases による劣化。蛍光レポーターを使用して規制の評価は比較的簡単とユニークな波長特性を持つ蛍光タンパク質を用いた多重することができます。メソッドは、単一セル、時空間細菌制御ネットワークに影響を与える複雑な三次元アーキテクチャと物理化学的勾配を示す組織における遺伝子発現解析のためことができます。データは一括人口平均化と、このような情報は失われます。ここで、細菌性病原体の場で遺伝子の発現を定量化するための手法について述べる。メソッドは、単純なティッシュの処理と蛍光レポーター蛋白質からの直接観察に基づいています。黄色ブドウ球菌thermonuclease (nuc)、その遺伝子産物は免疫回避と ex vivo および in vivo における病原性に必要な発現を調べることによってこのシステムの有用性を示す.そのnuc gfpは強く腎膿瘍で表され、免疫応答による完全に従事して膿瘍におけるnucプロモーター活性の明白な空間規制の一部による異種遺伝子発現を明らかに示します。このメソッドは、操作可能な遺伝的システムに任意の細菌および前臨床研究と医薬品開発のための貴重な情報を提供する、任意の感染モデルに適用できます。

概要

細菌は、適応や生存に必要な遺伝子の差動表現で生理学的な条件と環境の栄養状態の変化の変化に対応します。例えば、日和見病原体には、ボディ表面は比較的低密度で無害なことが多いが植民地化します。ただし、細菌には、物理的・化学的障壁が浸透して、一度、ホスト免疫細胞カウンター防御と栄養アベイラビリティの制限1主張する必要があります。例として、黄色ブドウ球菌性感の人口の約 3 分の 1 の定着が、壊滅的な皮膚および軟部組織感染症、骨髄炎、心内膜炎、菌血症と2の原因でもあります。黄色ブドウ球菌の病原体としての成功は、その代謝の柔軟性だけでなく、細菌を血流を脱出し、末梢組織の複製を有効にする表面関連と分泌の病原因子の武器といわれる3,4,5。ブドウ球菌性疾患によるホスト死は進化の行き止まりと新しいホスト6伝送が制限、病原性因子産生へのコミットメントを慎重に制御する必要があります。

非コーディング RNAs 反応する様々 な環境刺激とタンパク質の複雑な規制のネットワークを含む細胞密度、成長期、好中球関連要因と養分可用性、病原性遺伝子がで表されることを確保するため、正確な時間、ホスト組織7,8,9,10、11,12,13内の場所。例えば、サエル/S の 2 つのコンポーネント システム (TCS) は、センサー キナーゼ (サエス) と応答レギュレータ (サエル)14を介していくつかの病原因子の発現を調節します。サエスはホスト信号 (例,ひと好中球ペプチド [HNPs] カルプロテクチン)8,,1516レスポンスで節約されたヒスチジン残基の自己です。サエル、DNA 結合タンパク質としてそれをアクティブにするのにはアスパラギン酸残基にリン酸化グループ、転送されます (サエル ~ P)17。サエル/S TCS は、フィブロネクチン結合蛋白質 (FnBPs)、leukocidins、コアグラーゼ14,18,,1920など病態に寄与する 20 以上の遺伝子を調節します。サエルのレベルとして誘導の可能性がある高親和性・低親和性遺伝子ターゲットにターゲットを分類できます 〜 P 上昇その手がかり21に露出されたとき。サエル/S の活動は、Agr クォーラム センシング システムなど遺伝子発現の他の規制当局、毒素タンパク質 (Rot) と代替シグマ因子 B (SigB)22,23,24のリプレッサーによって制御されます。

nucの黄色ブドウ球菌の Sae 依存病原性遺伝子、 neutrophilic extracellular trap (ネット) から脱出するため、中に普及のために不可欠である thermonuclease (Nuc) をエンコード、感染25,26のコースです。Nucの式を分岐鎖アミノ酸と GTP27, 存在下でコーディでも強く直接に抑圧し、ブドウ球菌アクセサリー調節蛋白質サラ28,29 によって直接抑圧、その活動は、酸素 (酸化還元状態) と pH30によって影響されます。Sae 、 nucの変異体は、感染症のマウスモデルの減衰は、ことを考える彼らの対応する活動26,31を阻害する化学の介入の開発に関心があります。それにもかかわらず、感染時の規制に関する情報はありません。

蛍光レポーターは、監視し、単一細胞レベルでの遺伝子の発現を定量化する使用されています。ここで、 Sの定量化手法を提案します。黄色ブドウ球菌感染症に発現する遺伝子と組み合わせればin vitro におけるトランスクリプトーム解析と磁気共鳴画像 (MRI) や磁気共鳴分光法 (MRS) のような強力なイメージング技術を明らかにすることができますどのように細菌生理学は、特定のニッチで栄養素の相対的な存在量で規制されています。メソッドは、扱いやすい遺伝的システムと細菌の病原体に適用できます。

ゲノムの統合的なベクトルの概要です。

ゲノム統合のベクトル pRB4 には、各相同組換えを促進する黄色ブドウ球菌usa 300 SAUSA300_0087偽遺伝子の上流と下流地域から 500 の塩基対が含まれています。pRB4 は、耐熱性 β-ガラクトシダーゼ遺伝子ガラクトシダーゼ組み換え32の青/白のスクリーニングのためのエリスロマイシン耐性カセット (ermC) を含む温度敏感な pMAD ベクター バックボーンから派生されます。設計された記者コンストラクトでは、ゲノム統合プラスミド除去と superfolder グリーンに関心の規制地域をヒューズに EcoRI および SmaI サイト後選択のクロラムフェニ コール耐性マーカー (猫) も含まれています蛍光タンパク質 (sGFP) (図 1)。それは、リボソーム結合部位 (RBS) の選択が、レポーターの活動に影響を与える多くの場合経験的最適化33を必要とする知られています。したがって、RBS は付属されていません。ここでは、ネイティブ リボゾームの結合サイトは遺伝子発現のより自然なパターンを提供するために使用されるが、他のサイトを使用することがあります。

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プロトコル

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ジョージタウン大学によって承認されています。

1. 蛍光レポーター歪みの世代

  1. 制限酵素 EcoRI と SmaI で順番にゲノム統合 pRB4 ベクトルを消化します。次の製造元のプロトコル SmaI 25 ° c、1 μ g の pRB4 を使用して一晩消化を設定、EcoRI を反応混合物に追加することによって 37 ° C で 1 時間 2 番目の消化が進みます。20 分の 65 ° c の孵化によって酵素を不活性化します。
  2. PCR 増幅 (この場合 〜 350 塩基対 DNA フラグメントの thermonuclease [nuc] プロモーター領域を含む)、ゲノム DNA からの興味の規制地域 5' EcoRI 制限サイトと 3' SmaI 制限サイトを組み込みます。SmaI 認識シーケンスする必要がありますフレームで翻訳開始コドン。本研究では、PCR を行ったメーカーの推奨事項に従って忠実度の高い DNA ポリメラーゼを用いた前方プライマー oRB015 (5'-atcattgaattctccaaagtaaattataagttatac-3') 逆プライマー oRB016 (5'-gggcataactaacacctctttctttttag-3')。アニーリングの温度 53 ° C であった。製造元の指示に従って PCR クリーン アップ キットを使用して結果のフラグメントを浄化します。
  3. EcoRI と SmaI ステップ 1.1 で実行結果として得られる PCR の製品を消化し、製造元の推奨どおりに T4 DNA リガーゼを使用して統合の構築を生成する pRB4 の同じサイトに消化の DNA のフラグメントを縛る。エシェリヒア属大腸菌に結紮混合物を導入し、構築シーケンスを確認します。
  4. 34と前述したように、Electroporate黄色ブドウ球菌株 RN4220 を構築します。簡単に言えば、電子有能なセルの 70 μ L で 1 μ g のプラスミドを使用 (100 Ω、25 μ F と 2.3 kV) B2 液 (1% [w/v] カゼイン加水分解物、酵母エキス 2.5% [w/v]、2.5% [w/v] NaCl、0.1% [w/v] K2PO40.5% [w/v] 血糖値)。エリスロマイシン (5 μ g mL-1) と 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X Gal; 80 μ g mL-1) 補われるトリプシン大豆寒天 (TSA) に寛容な温度 (30 ° C) で抵抗エリスロマイシン (Emr) を選択します。結果として得られる形質転換体、プラスミドでエンコードされた β-ガラクトシダーゼ活性のために青。
    注:臨床分離株に DNA の転送は、強い制限変更バリア35のために非常に困難です。したがって、欠乏および高い変換可能な制限だから、黄色ブドウ球菌RN4220 は融合コンストラクトの中間の受信者として使用されました。
  5. 寛容な温エレクトロポレーションまたはバクテリオファージを介した伝達36を使用して興味の黄色ブドウ球菌の usa 300 株にプラスミドを転送します。簡単に言えば、Φ11バクテリオファージ TSA プレート 5 mM CaCl2ドナー歪に及ぼす粒子 30 ° c、夜間し、0.45 μ M の酢酸セルロース シリンジ フィルターを通して濾過により滅菌を伝達します。ヘッジホッグ Emrには黄色ブドウ球菌菌株ラック lysates を使用します。
    注:ラックは、以前に行われた Em 敏感与える Emr 37,38ネイティブ プラスミド pUSA03 の歪みを治すため TSB 培地で継によって広く使用されている臨床分離株です。
  6. 染色体32を前述のように、2 つの連続した相同組換えイベントによって構造を統合します。組み換え、クロラムフェニ コール耐性 (Cmr) 5 μ g mL-1を含む TSA プレートにクロラムフェニ コール, エリスロマイシン感受性 (Erms), と長いブルーです。
    注: 可能な場合、in vitro におけるひずみ通路39と温度シフトに関連付けられている突然変異の蓄積を避けるためにバクテリオファージを介した伝達を介して usa 300 にマークされた融合を再導入します。

2. 動物感染症: 接種、全身性感染症、およびティッシュの処理の準備

  1. 菌の準備
    1. 冷凍グリセロール ストックから血液寒天培地プレート上の分離のための興味の黄色ブドウ球菌菌株を連勝します。赤い血球 (赤血球) を溶解する能力に基づいて溶血性表現型とフォームをオフに透明なゾーンを確認する 37 ° C 16-24 時間で孵化させなさい。
    2. 一晩培養を開始するには、滅菌ガラス管のトリプシン大豆スープ (TSB) 4 mL にそれぞれのひずみのシングル コロニーを接種します。約 70 ° の角度と 70 回転毎分 [RPM] で設定チューブ ローラー 16-24 h 37 ° C でチューブを回転させます。
    3. 600 の光学濃度を測定する分光光度計を使用してステップ 2.1.2 から文化の nm (外径600)。(空白) 光参照として生殖不能媒体を使用します。0.05 で 25 mL の滅菌トリプシン大豆スープ (TSB) 別での OD600にこれらの細胞を希釈、125 mL フラスコ (容積比 5:1 フラスコ) のデロング、適切な熱に転送するため、文化)、水浴の文化をインキュベート 280 回転で振動し、37 ° C に設定
      メモ: 接種材料の成長は、さまざまな方法で実行できます。指数段階に成長している細胞の 1 つのメソッドが表示されます。関係なく、接種のためセルを準備するため同じ方法を一貫して使用することが重要です。
    4. ~ 1 の600を OD、再開始外径600セル達成指数段階と指数段階レベルに夜通しの孵化中に蓄積する要因を低減していることを確保するため 0.05 の新鮮培地に細胞を希釈します。
    5. 室温で 10 分間 3,000 × gで遠心分離指数段階 (外径600 ~0.6–0.8) でセルを収穫します。
    6. リン酸緩衝食塩水 (PBS; pH 7.4) x 滅菌 1 の同等のボリュームで 2 回ペレットを洗浄します。
    7. 1 × PBS (pH 7.4) 1 x 108コロニー形成単位 (CFUs) mL-1の濃度で細胞をサスペンドまたは目的のために適切な実験します。
      注:セル サイズと形状のひずみ依存性の変化は光散乱特性に影響を及ぼすため外径600と関心の各緊張に CFU mL-1との関係を決定することが重要だと、最終的に、伝染の線量。
  2. 動物や細菌感染の準備
    1. 精製飼料・ アイン 93 7 日間マウスを順応させます。食事は、標準のマウスの食事40植物由来原料の消費に伴う組織自動蛍光を削減しながら十分な栄養を提供するために策定されます。
      注:ここで、女性の C57/BL6 マウス (6-8 週齢) を使用、マウス緊張とセックス研究によって異なります。
    2. 感染する前に、ぬるま湯マウス尾静脈を拡張させます。
    3. 動物に感染して全身感染を引き起こす尾静脈を介して菌の 100 μ L 注入によって。フローサイトメトリーを実行している場合、最初の接種の因数を保存 (セクション 4 を参照)。
    4. 毎日動物を監視し、審査し、承認の制度的動物ケアおよび使用委員会の監視システムを使用して自分の健康状態を評価します。
    5. 希望の期間進行する感染を許可します。実験は、終了 3 日後感染を示します。
      注:これらの条件の下で膿瘍は、細菌、フィブリンの沈殿物によって囲まれ、免疫細胞5,41の同心の層に囲まれてのブドウ球菌性膿瘍コミュニティで構成されます。
  3. 器官およびティッシュの処理を収穫
    1. CO2吸入と二次的な方法として頚部転位によって動物の安楽死し、剖検を実行します。
    2. 腎臓 (右) とその他の臓器 (心臓、肝臓、肺、脾臓) を収穫し、10% [v] ホルマリンを含む 15 mL ポリプロピレン チューブに移します。後述 2.3.4 をステップにこれらの臓器を続行します。
    3. 左の腎臓を 2 mm シリカビーズの 1 mL 滅菌 1 × PBS (pH 7.4) 〜 500 μ L を含む滅菌 2 mL 耐衝撃管に転送します。この器官に 4.2 の手順に進みます。
    4. 2.3.2 穏やかな揺れや回転が少なくとも 24 時間、48 時間室温で暗闇の中を修正するための手順から臓器を許可します。
    5. 明確な組織の凍結中に臓器を埋め込み、-80 ° C で組織を保存
    6. 10 μ m の厚さのスライスに、クライオスタット、セクション組織を使用します。
    7. 暗闇の中で 20 分間事前洗浄、荷電ガラス スライド上のセクションを乾燥, 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 染色でメディアをハード マウントを適用し、coverslip を適用します。室温でマウントされたスライドを一晩で治すし、長期保存のための 4 ° C に転送します。

3. レーザー走査型共焦点顕微鏡と画像処理

  1. 使用されている蛍光レポーターの適切なレーザーを使用して病変を検索するマウント スライドを確認します。この場合、緑 (GFP)、赤 (tdTomato)、ブルー (DAPI) 蛍光信号を使用します。
  2. 個々 の細胞を可視化するための適切な目的を使用して画像を取得 (例えば、通常 20 倍または 40 倍目標が使用されます)。
  3. 共焦点画像の蛍光強度を測定します。
    1. 画像 J の共焦点画像を開き、正しく病変の蛍光信号を視覚化する明るさ/コントラストを調整します。
    2. しきい値オプションを使用して、関心の領域を定義、必要に応じて下限と上限の蛍光制限を設定します。
    3. 重心を選択して定義エリア平均グレー値 → 重心 → 制限のしきい値画像 J. [分析] タブの下で
    4. 重心の蛍光強度の値を抽出または GFP と tdTomato 特定の病変面積 (平均蛍光強度、MFI) あたりの平均蛍光強度を測定します。ここでは、1 つの μ m2の領域が使用されました。
      注:盲検第 2 分析は、サンプルの id がわかっている場合のバイアスを最小化します。
    5. データをプロットし、各比較の適切な統計解析を実行します。

4. 流れフローサイトメトリー解析

  1. (省略可能)(2.2.3 を参照) からの感染の日に接種の融合活性を決定します。
    1. 1 x の 899 μ L 滅菌 PBS (pH 7.4) を追加各菌の 100 μ L と 1 μ L 膜側の透過物の核酸の染色 (材料の表を参照してください)。コントロールに欠けている核酸染色サンプルを含めることです。
    2. すべてのサンプルでフローサイトメトリーを実行します。
      注:非常に最初の実験では、使用する適切な電圧を決定する興味の融合のためのベクトルだけ調節に便利です。正と負のサンプル間の明確な分離は、データ解析に不可欠なバック グラウンド信号をはるかに上回るは記者を示します。
    3. 細菌の人口を識別するために核酸の汚れ (y 軸) を使用して、イベントをプロット、散布図 (x 軸) を転送します。
    4. 両方の核酸染色陽性のイベントと菌 (黄色ブドウ球菌用 0.5 〜 2.0 μ m) の間前方散乱に基づく正しいサイズ周り包含ゲートを描画します。
      注:これらのパラメーターには、明らかにイベントを含めることが重要である、この人口を識別するとき厳密なこと。この門を除くその他の条件の下で否定的なコントロールのすべてのイベントを必ず。本研究では約 70% セル人口を満たして分析これらの要件。
  2. 犠牲の後組織試料の分析:
    1. 安楽死させる動物、(手順 2.3 参照)、左の腎臓を収穫し、ビーズに転送管滅菌 PBS (pH 7.4) x 1 の含有 1 mL とホウケイ酸塩の 2 mm のビードを 250 μ l 添加します。
    2. 細菌細胞を解放する組織を混乱させます。腎臓の細胞を破壊するのに圧力式ホモジナイザーを使用します。ここでは、冷却サイクル間濡れた氷上期間 1 分 6800 rpm で 3 つの 30 s バーストは加熱サンプルを最小限に抑えるために使用されました。
    3. ペレット 4 ° C に冷却卓上遠心機で 3 分間 250 × gで遠心分離によってより大きいティッシュの残骸
      注:通常、チューブの上に浮かんでいる残骸の層下部の細胞ペレットがあります。中間の水層には、細菌のセルが含まれています。
    4. 水層から 989 μ L の PBS の核酸染色の 1 μ L を含むクリーン 1.5 mL 遠心チューブに 10 μ L を転送 (合計量 1 mL)。
    5. フローサイトメトリー同じデータ集録パラメーターを使用して、最初の接種に関してはゲートを実行します。
      注:サンプルは主に組織破片を含んでいるので、細菌の細胞の数は非常に低くなります。「ライブ ゲート」オプションは、データがアプリケーションに読み込まれるとき、核酸染色陽性とサイズ ゲートがあるセルの場合にも使用できます。これは、対象イベントの詳細を分析し、ファイル サイズを減らすにも役立ちます。、サンプルごとにほぼ 100 万のイベントがカウントされますが、より多くのイベント カウント、感染症の重症度と組織のサイズに応じて必要があります。
    6. データ分析: 決定セクション 4.1.4 で決定された包含ゲートを用いた特定のサンプルの各蛍光体の蛍光強度 (MFI) を意味します。イベント カウントする流動解析ソフトのサンプルを正規化します。分析では、通常 10,000 カウントです。
      注:これは膿瘍の形成と感染症の重症度に依存するのでこのイベント数よりも少ないが含まれてサンプルを見つけることは珍しくないです。500 40,000 は、このアプローチを使用してイベントは、通常感染した組織で発見されます。

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結果

任意の記者を届けることができる pMAD32から派生したプラスミドを開発したダブル クロス オーバーの相同組み換え (図 1) による染色体に融合コンストラクト。このコンス トラクターは、GFP タンパク質と背景の上の蛍光信号の生成をサポートする任意の規制領域の定量分析のためことができます。プラスミッドのメンテナンス?...

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ディスカッション

細菌感染症は、抗生の抵抗の決定要因の46の取得により世界的な増加する健康問題です。ホスト環境への適応は成長と感染中の生存に不可欠な病原体のフィットネスを高める遺伝子発現プログラムを見据えた戦略は治療役に立つかもしれない。1 つのようなプログラムは、サエル/S 2 つコンポーネント システム (TCS)、免疫回避47で重要な役割を再生する前に?...

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開示事項

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

謝辞

フローサイトメトリー解析ヘルプについては PsarAP1- tdTomato 融合とカレン クレスウェルの贈り物ありがとうアレキサンダー Horswill。我々 はまた統計的な分析でアドバイスをアリッサ王をありがちましょう。この作品は、NIH 萌芽/発達研究賞 (グラント AI123708) と SRB 学部スタートアップ資金によって一部で賄われていた。資金提供者には、研究デザイン、データの収集と解釈、または出版物のための仕事を提出する決定の役割はなかった。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
5% sheep bloodHardy Diagnostics (Santa Maria, CA)A10
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)ThermoScientificR0402
AmpicillinFisher ScientificBP1760-25
C57Bl/6 MiceCharles RiverNA
ChloramphenicolSigma-AldrichC-0378
confocal laser scanning microscopeZeissNA
cryostat microtomeThermo ScientificNA
Culture, CapVWR International2005-02512
D+2:25NA OligoIntegrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)NA
DNA LigaseNew England BiolabsM0202S
ErythromycinSigma-AldrichE5389
Flow AnalyzerBecton DickinsonNA
glass beadsSigmaZ273627
Miniprep, plasmidPromegaA1220
orbital shaking water bathNew Brunswick InnovaNA
PCR purificationQIagen28106
Phosphate Buffer Saline (PBS)Cellgrow46-013-CM
Plate readerTecanNA
Precellys 24 homogenizerBertin LaboratoriesNA
pUC57-KanGenScript (Piscataway, NJ)NA
Q5 Taq DNA PolymeraseNew England Biolabs (Ipswich, MA)M0491S
Restriction EnzymesNew England Biolabs (Ipswich, MA)R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).
Reverse transcriptaseNew England BioLabsE6300L
Sanger SequencingGenewiz (Germantown, MD)NA
Sub Xero clear tissue freezing mediumMercedes MedicalMER5000
Superfrost Plus microscope slidesFisher Scientific12-550-15
superloopGE Lifesciences18111382
Syringe, FilterVWR International28145-481
Syto 40Thermo Fisher ScientificS11351Membrane permeant nucleic acid stain
TetracyclineSigma-AldrichT7660
Tryptic Soy BrothVWR90000-376
UV-visible spectrophotometerBeckman Coulter-DU350NA
Vectashield Antifade Mounting medium with DAPIVector LaboratoriesH-1500

参考文献

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