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要約

透過型電子顕微鏡と子宮内で伝達の組み合わせは、開発中に神経系の細かい微細構造の形態学的変化を研究するための強力なアプローチです。これらの併用は、神経可塑性の地形表現に関しての基になる構造の詳細の変更への深い洞察をことができます。

要約

本研究は興味の蛋白質によって影響される、明確に識別された地形構造の微細構造パラメーターの正確な寡を目指して透過型電子顕微鏡 (TEM) で子宮内で伝達を組み合わせたウイルスの転送を介して生物に導入されます。この手法により、細孔から微細構造同定へのスムーズな移行のため組織アトラスの次の地形のナビゲーション マップ。子宮導入組織の高分解能電子顕微鏡、神経とその可塑性パラメーター、断面のシナプスブートン エリア、シナプス小胞内のミトコンドリア数などの細かい微細構造を明らかにする、ブートン プロファイル、シナプス、断面の軸索地域、ミエリン鞘の太さ、髄鞘層板の数とミトコンドリア プロファイルの断面領域の長さ。これらのパラメーターの解析では、神経系の遺伝的構造のウイルスの伝達によって影響を受けるエリアの微細構造可塑性の変化に重要な洞察力を明らかにします。これらの併用のみ神経可塑性に遺伝子組み換えの生体分子や薬剤の直接影響を研究するため使用しないことができますが、また (のコンテキストでは例えば、神経可塑性の子宮内で救助を勉強する可能性を開きます神経変性疾患)。

概要

光子は、電子の深さのグレードで極薄の組織標本を貫通できます。これはナノメートル微細構造の光学顕微鏡技術と比較した場合の解像度の画像をキャプチャで TEM に貴重な利点を属性します。たとえば、TEM は、分泌顆粒、微小管、フィラメント、繊毛、絨毛上皮 (細胞表面の様々 なタイプ、メラノソーム、ミトコンドリアなどの細胞内オルガネラの可視化特殊化)、特に神経系1,2,3,4シナプスします。本方法論研究の全体的な目標です神経可塑性変化の微細構造認識出生前干渉時に開発時に子宮内での伝達と TEM の最新の技術を組み合わせることによって興味のバイラル符号化された蛋白質は、中枢神経系5,6、7、6脊髄などに子宮内で導入されています。例えば、子宮内で伝達電子顕微鏡との組み合わせでは細胞接着分子 L1 の運動 L1 と核内受容体タンパク質間の相互作用に関して、特に L1 欠損マウスにおける可塑性を学習に及ぼす影響を研究するため使用されています小脳ニューロン7。

神経可塑性パラメーターの解析には、中枢神経系内の最小領域の局在に関する正確な情報が必要です。したがって、微細構造の詳細とその他の構造についての正確な地形向きについて説明するのには十分です。本研究では光と電子顕微鏡観察に基づく明瞭な形態の区域の詳しい調査を目指して特定の準備メソッドが表示されます。このアプローチは、組織操作、マウスの脳および脊髄の子宮内での伝達から始まる、および灌流固定後のいくつかのテクニックを組み合わせた金型埋め込むと TEM の組織を処理します。埋め込みと TEM のティッシュの処理の間に含まれている重要なステップはの microphotographic と低倍率の正確なドキュメントは、干渉光の反射法による組織のドキュメント組織標本8,9,10。本手法により、神経組織表面と TEM の準備の前に供試体スライス プロファイルの地形と構造の詳細を検討する研究手法に組み込まれ、.

頭脳全体の区分のための特別なフレームは、定位座標に対応します。このフレームは神経組織の区域の形態の三次元 (3 D) 再構成を利点し、形態分析に使用することができます。可視化のセクションの macrographs が地形座標を割り当てられ、連番付きのセクション組織アトラスのマップを構築します。

樹脂加工後で超薄切片に埋め込まれた組織の断面 (< 70 nm) 上記組織アトラスの地図によると、選択したエリアを含んでいます。その内容と連絡先団地内近隣構造物への塑性パラメーター (例えば、シナプス ボタンまたは軸索線維のプロファイル領域を断面するなど) の高解像度の画像を取得する TEM を超薄切片を受けます神経網。

記載の方法で可視化破面観察からマイクロ構造およびナノ構造への滑らかな移行は以後の子宮内開発の神経形態学的神経可塑性の詳細な比較を許可します。システム。

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プロトコル

動物の主題のすべてのプロシージャは、ハンブルク、ドイツのノルトライン ・ ヴェストファーレン州の州の動物倫理委員会によって承認されています。 滅菌器具、手袋、外科プロシージャ全体で無菌のコートを使用します。

1. 子宮伝達で

  1. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ph 7.4 でアデノ随伴ウイルス タイプ 1 (AAV1) (4 x 1011ウイルス粒子/μ AAV1) の目的のターゲットのためのコーディングを準備します。0.1 mg/μ L の高速グリーンを追加し、37 ° C で AAV1 高速グリーン混合物を保持
  2. 目的の形をした薄いキャピラリー先端を準備 (80 μ m と内側の外側の直径、長さ 8 mm 直径 50 μ m)、マイクロ ピペットの引き手を使用して (設定: 圧力 = 500、熱 700、プルを = = 0、速度 = 80、時間 = 200、材料表を参照してください ).それは 4-5 mm、キャピラリーの先端を破る。
  3. キャピラリーの先端に吸引器チューブ (44 × 0.7 cm) をアセンブルし、毛細血管に AAV1 高速グリーンの混合物の 15 μ L を吸引します。
  4. プロシージャ全体で 37 ° C の一定の生理的体温で動物の科目を維持します。
  5. エームスプレインキュベーションの商工会議所に妊娠 c57bl/6 マウス (萌芽期日 14.5) を置き、麻酔ガスの 4% イソフルランとマウス (体積気流率 0.6 0.8 L/分)。
  6. ブプレノルフィン (体重の 0.1 mg/kg) を皮下注入します。
  7. Prewarmed 外科プレート (37 ° C) を麻酔下のマウスを置きます。
  8. 潤滑剤で目をカバーします。
  9. 麻酔マスクを持つマウスを合わせて (0.6 から 0.8 の体積風量でガスの 1.5% イソフルラン L/分) 外科プレート、ひげをそる腹部皮膚領域。剃毛地域 3 X 75% エタノールとし、betadine ソリューションを拭いてください。
    注:麻酔下のマウスの呼吸動作を継続的に監視します。マウスの吸入吐出パターンに従ってイソフルラン麻酔ガスの濃度を調整します。
  10. マウスの後肢の指骨を絞ることによって足底反射の有無を確認します。
  11. 曲線鋸歯状アイリス鉗子 (10 cm) で皮膚をつかんで、ストレート超硬はさみ (10 cm)、リネア正中に沿って皮膚を切断し、ストレート ・ デュモン ピンセット (12 cm、0.2 mm と腹膜壁を掴んで腹部キャビティを開く× 0.12 mm) とストレート ヴァンナの白線に沿って壁を切断はさみ (8 cm)。
  12. 腹部の開口部に穴あきパラフィン フィルムの部分を置き、マイクロ モスキート止血鉗子 (12.5 cm の曲線) と両端にフィルムを修正します。
  13. 子宮角内の胚への損傷を避けるためにスプーンのようなデバイスと子宮角を公開します。子宮角に PBS (37 ° C) を数滴を滴下し、損害または奇形子宮嚢内胚を確認します。
  14. 子宮角の胚の位置や順序を文書化します。注入の目的の位置に到達するまで慎重に子宮嚢内胚をオンにします。
  15. AAV1 高速グリーンの混合物の 1-2 μ L を注入すると、注入部位 (例えば、脳室) および顕微鏡の下で染料の浸透を視覚的に調べることによって。
  16. 注入された胚を文書化し、腹腔内に注入された胚と子宮角を配置します。
  17. 腹腔内に PBS (37 ° C) を数滴を滴下します。腹腔の壁 (使用ポリアミド 6-0 サイズ縫合糸) や皮膚 (使用ポリアミド 3 0 サイズ縫合)、ホルステッドのモスキート止血鉗子 (12.5 cm) 曲線を使用して縫合して空洞を閉じます。また、単純なパターンに中断またはステンレス製縫合/ステープルを使用する腹部キャビティそして皮膚を閉じます。

2. 隔離されたティッシュの Telemacrophotography

  1. バッファーの準備
    1. Na2HPO4と 1 l 蒸留水 200 rpm で攪拌下の瀬2PO4 2.18 g 溶解の 14.95 gデニスソレンセンのバッファー (1 L) を準備します。灌流末の胎仔および/または出生後の子犬期間、腹部や胃内注入用針の適切なサイズを使用して、ターミナル ナトリウム ペントバルビ タール麻酔濃度が 180 mg を超えないことを確認してください/体の kg の重量を量る。
    2. 75 ° C に蒸留水 500 mL を加熱することによってMugnainiの固定の解決 (5 L) を準備し、5 の 200 μ L を追加する、200 rpm で攪拌下パラホルムアルデヒド粉末 50 g を追加する N 水酸化ナトリウム、デニスソレンセンのバッファーの追加 1,500 mL、1,750 mL の蒸留水、と 25% グルタルアルデヒドの 500 mL。5,000 mL を蒸留水に詰めます。灌流のこの最後のバッファーを使用します。
      注: ボンネットの下の Mugnaini の固定の解決を準備、保護メガネを着用し、煙を避けるため。灌流のより良い視覚化のメチレン ブルー (0.05 g/L) を追加します。
  2. マウスの血流と組織の分離
    1. Transcardially が導入された胚 (胚研究) の場合、または標準手順6,7によると希望年齢 (例えば、生後 24 日目) で生まれた導入されたパブを運ぶ妊娠マウスを灌流します。 11,12,13,14,15,16,17, 腹腔内ターミナル ナトリウム ペントバルビ タールを使用して麻酔 (体重の 200 mg/kg)。
    2. マウス transcardially を注入マウスを吹き込む 26 G、針と、固定の前に 1 を使用して (500 U)、ヘパリン溶液を 10 ml、体内から血液を洗い流すし、30 ml 40 ° C prewarmed Mugnaini の transcardially を灌流する PBS の transcardially固定の解決。
      注:成体マウスの腹部大動脈14経由で代替の逆行性血流を実行します。
    3. 興味 (全脳や脊髄など) の灌流の組織を分離し、4 ° C で 24 時間の別の Mugnaini の固定の解決の少なくとも 10 mL で組織を置
    4. 室温で 3 h の 10 mL の PBS で組織を洗浄します。
  3. アガロース、およびドキュメントに埋め込み、セクショニング
    1. 再現性のある断面角度8,9,10特別なフレームの分離組織 (例えば、全脳) を調整します。また、調節可能な切削厚、vibratome を使用します。
    2. フレームに神経組織を配置、telemacrography のための組織を調整し、座標を文書化します。
    3. 3% 低融点アガロース埋め込みメディアの準備: agarose の 3 g を 100 mL のデニスソレンセンのバッファーの追加し、90 ° C の水浴中で混合物を熱
    4. 組織を含む枠の 3% の agarose (30 ° C) を注ぐ。暖かい金属ブロックとフレームをカバーし、それが硬化するまで待ちます。硬化中に埋め込まれた組織とその座標フレーム内のイメージを telemacrographic デバイスを使用します。
    5. 最初のフレームの座標に対応する切削ギャップのあるフレームに agarose 埋め込まれたティッシュを転送します。
    6. 薄いと振動のかみそりの刃を備えたデバイスで所望の厚さ (例えば、1.5 mm) のセクションに埋め込まれた組織を削減 (材料の表を参照してください)。
      注:かみそりの刃の滑走を改善するために埋め込まれた組織にグリセリン数滴を滴下します。
    7. PBS で各切片を画像フォルダーに画像を収集しています。

3. 分離組織の透過電子顕微鏡用の準備

注:フードの下で動揺のプラットホームのしっかりと開閉蓋とガラス皿で培養の以降のすべての手順を実行します。

  1. PBS で 2 x 30 分間ティッシュ セクションを洗います。室温で 2 時間 2% 水溶液四酸化オスミウム ソリューション (OsO4) のセクションを孵化させなさい。
    注意:四酸化オスミウムは有毒、皮膚接触すると有害のおそれ。
  2. PBS で 2 × 30 分の osmicated セクションを洗います。
  3. 10-15 分の室温で 30%、50%、70% エタノールでセクションを孵化させなさい (オプション: 4 ° C で 70% エタノールで一晩インキュベート)。
  4. LED RGB 光8,9,10 (2 x 15 W) 70% エタノールで osmicated の標本は、45 ° の角度で左右からサンプルに適用するイメージ。散乱とイルミネーションの中に、光の反射を最小限に抑えるため黒い皿および鈍い黒の背景を使用します。
    注意:イメージ投射の間を乾燥させるセクションを許さない。
  5. シリーズ フォルダー内の画像を収集することにより、座標を持つセクション画像のアトラスを作成します。
  6. 100% エタノール (30 分の 2 倍)、室温で 100% のプロピレンの酸化物 (30 分の 2 倍) に標本を孵化させなさい。
    注意:セクションにソリューションを変えながら乾くようにしてください。
  7. ドデセニルこはく酸ガラス容器内の 240 mL と優しくガラス棒で攪拌しながら 260 mL の樹脂を混ぜます。不均質性、泡と汚れを定期的にチェックします。非常に優しく、少なくとも 45 分手でかき混ぜます。
  8. 1:2 と 1:1 の比率で樹脂/プロピレンの酸化物を準備し、3% アクセラレータ (2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol) を追加.
  9. 1:2 のステップ 3.8 2 h し 1:1 の埋め込みソリューションのステップ 3.8 から 2 時間室温で回転ホイール上からソリューションを埋め込み組織を孵化させなさい。
  10. フラット ポリプロピレン皿にティッシュを置き、ティッシュをかぶせて 3% アクセラレータを含む新鮮な樹脂と 12-24 時間の 65-85 ° C で埋め込まれた組織を治します。
  11. 埋め込まれた組織を室温に冷却し、ポリプロピレンの料理から樹脂包埋標本を削除します。

4. 定量分析のための超微細構造の神経可塑性パラメーターの選択

  1. 関心のある領域のマッピング
    1. (例えば、海馬や小脳) 関心の領域を選択し、このエリアを含むアトラス (ステップ 3.5) からイメージを選択してセクション アトラス地区をローカライズします。
    2. 断面画像に関心のある領域の境界線をスケッチし、樹脂試料の上にこれらの地域のボーダーを見つける/スーパーイン ポーズします。
    3. スクラッチ マーク (26 G、1 で) 細針ゲージを使用して、樹脂試料 (例えば、海馬や小脳) 関心のある領域の国境。
    4. トリミング用樹脂を柔らかくしたり、また、トリミング装置、薄い刃またはサンドペーパーを使用するオーブンで 85 ° C に樹脂試験片を加熱します。
    5. かみそりの刃をもつ樹脂試料から関心のある分野を消費税 (材料の表を参照してください)。試料をマウント接着剤など (直径 8 mm) と長さ 1 cm 必要な口径のアクリル ガラスのバーを保持しています。準超薄切片とマウントされた試料をトリミングします。
    6. グリコールメタクリル (0.75 μ m) を準備し、極薄 (70 nm)、ウルトラミクロトームを使用してトリミング領域のセクション: 0.75 μ m 厚 1.5 mm/s と 70 nm 厚さ 0.7 mm/s でそれを設定。
    7. ガラス担体にグリコールメタクリル セクションを収集し、(4 分) 用 PBS で青 1% トルイジンのセクションを染色します。
    8. 何度か脱イオン水内のセクションを洗います。4 x を使用して光学顕微鏡の下でステンド グラスのセクションを調べる (0.1 ∞ の NA/-), 10 (0.22 ∞/0.17 の NA)、x 40 x (0.65 ∞/0.17 の NA)、(1.25 ∞/0.17 の NA) 目標 × 100。
    9. ニッケル グリッドの超薄切片を収集します。180 で TEM グリッドの対象 kV、3、200 x、6, 000 x および/または 8,000 倍の倍率。
  2. TEM 分析
    1. 定量的な TEM 分析 (例えば、小胞とミトコンドリアや有髄と無髄の軸索の研究) のための興味の微細構造パラメーターの選択し、これらのパラメーター未満 3 8,000 倍の倍率や 6,000 x 500 x の TEM 画像を取る。

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結果

マウスの信頼性と高速麻酔の安全な多数のパラメーターが考慮されたと麻酔ユニットの最適化されたワークスペースが十分な (図 1A) をあることを証明しました。単位は、マウスやラットなどの小動物の手術の成功に必要な精度で液体イソフルランと周囲の空気の混合を制御するために設計されています。空気とイソフルランは目的?...

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ディスカッション

子宮内での情報伝達の重要なステップは、注入の手順です。脳室または興味の別の領域に精密成形には、経験と実践的なスキルが必要です。シンナーのマイクロキャピ ラリー チップ以下の組織の損傷が発生します。しかし、これは射出圧力の増加を犠牲にしては。子宮内でエレクトロポレーション19,20,21,

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者は、そのサポートと動物のケアのため医学部、ルール大学ボーフムで飼養施設の同僚をありがちましょう。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenolServa36975
26 G x 1'' needleHenke-Sass, Wolf GmbH
410 Anaesthesia Unit for air pumpBiomedical Instruments (Univentor)8323102
Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1)UKE (Viral Core Facility)-For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54.
AgaroseSigma-AldrichA9414low gelling agarose
Air PumpBiomedical Instruments (Univentor)Eheim 100
AralditeCIBA-GEIGY23857.9resin for embedding of tissue
aspirator tune assembliesSigma-AldrichA5177-5EA
Breathing Mask Mouse Anodized AluminiumBiomedical Instruments (Univentor)-
buprenorphineTemgesicampulespainkiller
capillariesScience-ProductsGB100TF-10with fillament
Dodecenylsuccinic anhydrideFluka44160
Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm)FST11203-23
electric shaverPhillips-
Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0)Ethicon-polyamide
eye lubricantBepanthene-
Fast GreenSigma-AldrichF7252for visualization of injected liquids
Gas Routing Switch 4/2 connectorsBiomedical Instruments (Univentor)8433020
halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight)FST13011-12
Heparin-NatriumRatiopharm25 000 I.E./5 mL
Induction box for mice
with horizontally moving lid.
Inner dimensions: LxBxH: 155 mm x 115 mm x 130 mm.
Wall thickness: 6 mm		Biomedical Instruments (Univentor)-
iris forceps (10 cm, curved, serrated)FST14007-14
iris scissors (11 cm, straight, tungsten carbide)FST14501-14
Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm
Outer dimensions: 257mm x110 mm x 18 mm.
Heating area: 190 mm x 90 mm
The removal of the isoflurane escaping
the breathing mask is downwards in compliance with the
regulations		Biomedical Instruments (Univentor)-
isoflurane (Attane)JD medicalinhalation anesthesia
LED RGB lightsCameoCLQS15RGBWLEDs 2 x 15 W
Light microscope Basic DM ELeica-4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives
micropipette pullerScience-ProductsP-97
Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, curved)FST13010-12
Nickel grids, 200 meshTed Pella1GC200
Osmium (VIII)-oxidDegussa73219
Propylene oxideFluka82320
razor bladesSchick87-10489
Sodium pentobarbital (Narcoren)Merial GmbH-
TC01mR 1-Channal temperature controller with feedbackBiomedical Instruments (Univentor)-
Technovit 4004 two components glueKulzer
TelemacrodeviceCanon-Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand.
Thermopuller P-97Sutter Instruments-
thin vibrating razor blade deviceKrup-with Szabo thin blades
toluidine blueSigma-Aldrich89640
Transmission electron microscope C20Phillips-up to 200 kV
Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts
Outer diameter: 6 mm
Inner diameter: 4 mm
Wa
ll thickness: 1 mm		Biomedical Instruments (Univentor)-
Ultracut EReichert-Jung-ultramicrotome
Univentor ScavengerBiomedical Instruments (Univentor)8338001
Vannas scissors (8 cm, straight)FST15009-08

参考文献

  1. Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers. Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159(1961).
  2. Hamlyn, L. H. The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit. Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).
  3. Peters, A., Palay, S., Webster, H. The Fine Structure of the Nervous System. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1991).
  4. Rollenhagen, A., et al. Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses. Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).
  5. Lutz, D., et al. Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival. Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).
  6. Lutz, D., et al. Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury. Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).
  7. Kraus, K., et al. A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination. Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).
  8. Andres, K. H., von Düring, M. Interferenzphänomene am osmierten Präparat für die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung. Mikroskopie. 30, 139(1974).
  9. Andres, K. H., von Düring, M. Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy. Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. Hayat, M. A. , Van Norstrand Reinhild. 246-261 (1997).
  10. Andres, K. H., von Düring, M. General Methods for Characterization of Brain Regions. Techniques in Neuroanatomical Research. Heym, C., Forssmann, W. -G. , Springer-Verlag. Berlin, Germany. 100-108 (1981).
  11. Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).
  12. Webster, H. F., Collins, G. H. Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).
  13. Andres, K. H. Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von Säugern. Mikroskopie. 21, 169(1967).
  14. Forssmann, W. G., et al. Fixation par perfusion pour la microscopie électronique. Essai. De généralisation. Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).
  15. Descarries, L., Schröder, J. M. Fixation du tissue nerveux par perfusion à grand debit. Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).
  16. Langford, L. A., Coggeshall, R. E. The use of potassium ferricyanide in neural fixation. Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).
  17. Liu, J., et al. Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex. Molecular Brain. 7, 84(2014).
  18. Lee, S. H., et al. Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway. Molecular Neurodegeneration. 12, 48(2017).
  19. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. , Suppl 1 120-125 (2009).
  20. dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960(2012).
  21. Nishiyama, J., et al. Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation. European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).
  22. Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo. Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).

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