クライオ走査型電子顕微鏡で可視化された木質植物のキシレム水分布

要約

キシレム内の水分布を観察することは、木質植物の水流ダイナミクスに関する重要な情報を提供します。本研究では、サンプル調製時の水位のアーティフィスの変化を排除するクライオスタットとクライオSEMを用いて、キシレム水分布をその中で観察する実践的なアプローチを実証する。

要約

クライオユニット(クライオSEM)を設置した走査型電子顕微鏡により、氷点下の温度での検体観察が可能となり、液体窒素(LN)_{を用いて凍結固定技術と組み合わせて植物組織の水分布を探索するために使用されています。2.}木質種の場合、しかし、キシレム横断切断面を観察するための準備は、木繊維の配向のためにいくつかの困難を伴う。さらに、キシレム導管の水柱の張力が高いと、特にサンプルの固定および収集中に、水の分布にアーティフィカルな変化を引き起こす場合があります。本研究では、クライオスタットとクライオSEMを用いて、その場で木質植物のキシレム内の水分布を観察する効率的な手順を示す。まず、サンプル採取中に、キシレム水電位を測定し、キシレム導管に高張力が存在するかどうかを判定する必要があります。キシレム水電位が低い場合(< ca. -0.5 MPa)、サンプル凍結固定中にキシレム導管の水状態をより良く保存するために、緊張緩和手順が必要です。次に、木の茎の周りに防水首輪を取り付け、キシレムの水状態の凍結固定のためにLN2で満たされる。収穫後は、観察のためのサンプル調製の手順を完了しながら、サンプルが凍結保存されていることを確認するために注意する必要があります。クライオスタットは、キシレム横断切断面を明確に露出させるために使用される。クライオ-SEM観測では、凍結エッチングの時間調整は、霜の塵を除去し、表示面上の細胞壁のエッジを強調するために必要とされます。我々の結果は、細胞および細胞レベルでのキシレム内の水分布の観察のためのクライオSEM技術の適用性を示す。クライオ-SEMと非破壊的な観察技術の組み合わせは、木質植物の水流ダイナミクスの探査を大幅に改善します。

概要

水資源(沈殿、土壌水分含有量)の利用可能性は、土壌から水を吸収し、光合成生産のために葉に輸送する必要があるため、植物種の死亡率と地理的分布を厳密に決定します。植物は、変動する水供給の下で水輸送システムを維持する必要があります。特に、木質植物は、場合によっては、地上100m以上のクラウンを保持する必要があるため、蒸散流れに沿って導管に高い張力を発生させます。このような高い負圧下で水柱を維持するために、キシレム導管は、硬直および疎水性細胞壁1を有する管状細胞の連続体からなる。各種におけるキシレム導管のキシレム機能障害に対する脆弱性は、変動する水^供給2の下での種生存の良好な決定要因である。また、キシレム導管の水位を調ることは、生物学的または生物学的ストレスを受けた個々の樹木の健康状態を評価するために重要である。樹液の流れまたは水の電位を測定することは、キシレム導管の統合された油圧機能による木質植物の水の状態の推定を提供できる。さらに、キシレム細胞における水の分布を可視化することで、キシレム油圧システムの個々の成分の状態を明らかにすることができる。

キシレム導管の水位を可視化するためのいくつかの技術が存在^する3.木質組織の水経路を観察するための古典的で有用な方法は、切断された枝の端を染料に浸すことによって、または立っている木の茎4に染料を注入することによって、水柱を染色することを含む。柔らかいX線写真はまたxylem5、6の水分の差動X線吸収強度によるスライスされた木ディスクの水配分の視覚化を可能^にする。しかし、これらの方法は、水の動きの軌跡を提供するか、水のマクロ的な分布を示すだけです。近年、マイクロフォーカスX線コンピュータ断層撮影(μCT)7、8、9、10、磁気共鳴画像(MRI)などの非破壊観測技術、¹²は、無傷の苗木内のキシレム導管中の水の観察を可能にするために大幅に改善された。これらの非破壊法は、人工切断効果なしにキシレムの水位を観察できるという大きな利点があり、シーケンシャルイメージングまたは造影^剤10の導入により水流のダイナミクスを追跡することができます。しかし、細胞レベルの水分含有量を識別できる画像を得るためには、植物イメージング用にカスタマイズされたMRIやシンクロトロン系μCTの特殊な施設を使用する必要があります。また、シンクロトロンベースのμCTシステムは、光顕微鏡7、8、9に匹敵する高い空間分解能で微細な画像を得ることを可能にしたが、高エネルギーX線13、14の放射線。クライオユニット(cryo-SEM)を設置した走査型電子顕微鏡(cryo-SEM)を採用することは、キシレム中の水を細胞レベルで正確に見つけ出す非常に有用な方法ですが、観察のためにサンプルを破壊的に収穫する必要があります。キシレム導管中の水を固定するために、茎の一部(すなわち、小枝、枝または茎)は、液体窒素(LN2)によってその中で凍結される。クライオSEMによるトリミングされた凍結標本の表面の観測は、キシレム導管中の水を氷として識別できるキシレム構造の高度に拡大された画像を提供します。この方法の重要な制限は、同じ試料内の水の移動性の逐次観察が不可能であるということです。しかし、フィールドに生息する樹木を順次観察するためのμCTまたはMRIの適用は、これらの器具が持ち運びにくいため、非常に困難です。対照的に、cryo-SEMは、フィールド実験で大きな木にこの技術を使用して、細胞レベルだけでなく、より細かい構造レベルで水内容を明確に可視化する可能性を秘めています(例えば、血管間^ピット15の水、水中)細胞間^空間16、または水柱17中の気泡。

クライオSEMによってキシレム水を観察する多くの研究は、5、12、18、19、20、21、23で報告されている。 内海ら(1996年)は、当初、LN2をステム21にセットした容器に充填することにより、生きている体幹の凍結固定により、その中でキシレムを観察するためのプロトコルを確立した。試料の温度は、キシレム導管内の氷を溶かすことを避けるために、サンプル収集中およびクライオSEM調製中に-20°C以下に維持した。この方法は、変化する水体制11、12、24、25、26の下で水の分布を明らかにするために、キシレム中の水を観察するために使用されてきた。 ^27,28, 水配分の季節変動^21,29,30, 凍結融解サイクルの効果¹⁷,^{31, 32、}湿った木の水の分布5、樹木からハートウッドへの移行中の水配分の変化、カンビアル活動と容器の分化の季節的な時間経過33、特定の生物学的ストレスによって誘発されるキャビテーション^23,34.キャビテーションに対する油圧伝導性および導管の脆弱性も、cryo-SEM^35,36を使用して検証されています。エネルギー分散X線分光法(EDXまたはEDS)を搭載したCryo-SEMは、^水37を含む検体の表面上の元素分布を研究するために用いられてきた。

高い油圧張力下の導管を含む生きているトランクの凍結固定は時々導管38、39の内腔の壊れた氷の結晶として凍結SEMによって観察される人工キャビテーションを引き起こす。特に、より長く、より広い導管を有する広い放置種は、水中3、40の下で行われても、サンプル切断によって引き起こされるキャビテーションなどの緊張誘発性アーティファクトに対して脆弱である。キャビテーションアーティファクトは、透過木のサンプリング後(すなわち、日中のサンプリング)または厳しい干ばつ条件下で顕著になり、キャビテーション発生の過大評価に誤解を与える可能性^{があります}3,^{38, 39}.したがって、導管で働く張力は、実際のキャビテーション3、12、39を避けるために解放されなければならない。

試料室に設置されたナイフを用いた凍結破壊技術は、しばしば凍結SEM観察のために標本表面を露出させるために用いられる。しかし、木質植物組織の凍結破砕面、特に二次キシレムの横断部は、組織6の解剖学的特徴および水を明確に観察するには粗すぎる。標本をトリミングするためのクライオスタットの適用はサンプル表面20、23の急速で、高品質の調製を可能にする。この方法の全体的な目標は、サンプリングアーティファクトの発生することなく、その中の様々な種類のキシレム細胞における水分布の電子顕微鏡分解能を示す証拠を提供することである。キシレムのクライオ固定サンプルの高品質な電子顕微鏡写真を得るための試料表面のサンプリング、トリミング、洗浄に関しては、初めて採用して着実に改善された最新の手順をご紹介します。

プロトコル

注: このプロトコルの概略図を図 1に示します。

1. サンプリング:キシレム導管の水柱内の緊張緩和

注:Xylem水配分における凍結および張力誘発アーティファクトの両方を避けるために、LN₂アプリケーションの前に次の張力緩和治療が推奨されます。

1. 黒いビニール袋でサンプリング用の枝と葉を囲み、キシレムと葉の間の水位を平衡化してから2時間以上前に残します。
2. 圧力室またはサイクロムスターを使用して、サンプルから少なくとも2つの葉の水電位を決定します。水位がca.0.5 MPaより高い場合(すなわち、凍結後にサンプルを収穫することができます(セクション2:凍結固定を参照)。水の電位が-0.5 MPaより低い場合は、以下に説明するようにリラクゼーションの治療が必要です。
3. 水で満たされるために、茎の周りに水密襟を固定します。底のないプラスチックカップは、防水襟として機能することができます。その後使用される液体媒体の漏れを防ぐために粘着テープを使用して、茎と襟の間のスペースをしっかりと密封するように注意する必要があります。細い枝や小枝などの柔軟な茎を収穫する場合は、茎を曲げて水で満たされたバケツに切断部分を沈めます。剪定せん断またはのこぎりを使用して水面下で切断します。切り傷を空気にさらすことを最小限に抑えるために、サンプルをできるだけ早く別の水の容器に移します。
4. サンプルの切り端を水中に保管してください。広い放置種の場合は、クライオサンプル内の張力誘発アーティファクトを防ぐために、SEM用のクライオサンプルが採取された茎のカットエッジまで長くなることを確認してください。
5. 蒸散を減らすために黒いビニール袋で葉を含むサンプルをカバーします。サンプルの切断端を水中に保ち、キシレムの張力を緩和するために約30分間この状態を維持します。キャビテーション導^管12の可能な人工補充によるより長いリラクゼーション時間(>1 h)を避けてください。
6. 再び水位を測定し、キシレム張力(約0MPa)の緩和を確認します。
   注:サンプリングの前に、ターゲット種の最大容器長は、空気注入法によって同様のサンプルで研究または決定されるべきです。大きな木、または大きな枝をサンプリングする場合、上述した張力緩和手順を行うことが困難である。したがって、キシレム水位が高い夜明け前の期間に、大きな木からのサンプルを収集する必要があります。

2. LN₂で固定を凍結

1. ハサミまたはユーティリティナイフで水密襟の片側をカットして開きます。開口部を水平に保持したまま、粘着テープで茎の周りに首輪をしっかりと取り付けます。
2. 絶縁手袋/ミトンを着用しますが、LN₂のボトルを安全に保持し、LN₂を首輪に入れてLN2で満たしてください。LN₂を着実に加えて、キシレムの水を完全に凍結して充填してください。フリーズに必要な時間は、サンプルサイズによって異なります。注がれたLN2の沸騰後1分は、小さな小枝や苗のために十分であるが、20分以上は、より大きな^木20の茎のために必要とされる。LN₂と周囲温度の間の温度差が大きいため、凍結中に LN₂を連続的に追加します。
3. 十分な凍結時間の後にLN2を除去するために、サンプルステムの凍結部分から首輪を取り外します。首輪を取り離すことによって引き起こされる潜在的なLN₂流出との接触を避けるために、絶縁手袋を着用してください。
4. すぐに細かい手のこぎでサンプルを収穫します。
5. 冷凍サンプルをアルミホイルで覆うか、サンプルID番号が書かれたサンプルチューブに入れます。収穫したサンプルをLN2で満たされた容器に素早く入れ、ドライアイスで満たされた絶縁された箱に詰めます。
6. 観察するまで深い冷凍庫にサンプルを保管してください。好ましい貯蔵温度は、貯蔵中の氷昇華及び再結晶化を防ぐために-80°Cである。

3. 試料調製

注:観測のために、サンプルをトリミングし、観測用の表面をゼロ以下の温度で計画する必要があります。クライオスタット系(クライオスタット)を用いる生物学的マイクロトームは、クライオSEMによるこのタイプの観察において標本の表面をトリミングおよび露出させるのに理想的である。

1. クライオスタットの試料室の温度を-30 °Cに設定し、通常はほとんどの植物のキシレム樹液を凍結状態に保つのに十分な寒さです。
2. クライオSEMの標本ホルダーに合わせて調整できる小片(< ca. ca. 2 cm、幅または直径1cm)にサンプルをトリミングします。ナイフで切れない大きなサンプルの場合は、冷凍庫の中で冷却された鋸で素早くプリカットします。
3. トリミングされた部分をチャックに取り付け、凍結埋め込み媒体(例えば、OCT化合物)に取り付けてクライオスタット用ホルダーをクライオ断面化する。次に、クライオスタットのマイクロトームの試料ホルダーにチャックを取り付ける。
4. 厚さの5-7 μmセクションで繰り返しシェービングすることにより、表面をトリミングします。1,000~2,000μm以上を切り取ってトリミングし、サンプル採取時の初期表面からの総深さで、ステップ3.2に記載されているようにナイフまたは鋸で事前切断することによって引き起こされるサンプルの損傷部分を除去するのに有用である。
5. 試料の表面を大まかにトリミングした後、試料の表面の上にマイクロトームブレードの未使用部分を調整します。ブレードが厚さの設定を超えるサンプルに触れないようにしてください。
6. 未使用の刃部による最初の切断の前に、試料と刃物の表面との間の距離をわずかに広げる。
7. サンプルの表面を1~2回だけカットします。また、試料表面の未使用のブレード部分を調整してブレードを再度スライドさせます。
8. 手順 3.6 と 3.7 を 3 回または 4 回繰り返します。これは「ナイフマーク」なしで透明な表面を得るために重要です(図4)。
9. 最終カットの後、サンプルにほこりが付着するのを防ぐために、ブレードの位置をサンプルから遠くに設定します。
10. 試料ホルダーからチャックを取り外し、冷凍埋め込み媒体を鋭利なナイフで取り外してチャックから取り外します。標本が凍結粉塵からその計画された表面を防ぐためにクライオスタットチャンバーに置かれることを確認してください。
11. クライオスタットチャンバ内に組織凍結埋め込み媒体を有するクライオSEM標本ホルダーに試料を取り付ける。

4. クライオSEM標本室への移送

注:表面調製試料は、クライオスタット室からクライオSEM標本室の観測段階への移動中の温度の上昇または霜の蓄積から保護されなければならない。

1. 装置の取扱説明書に従って、クライオSEM試料室の低温を-120 °C以下、LN₂で維持します。
2. 調製した試料をLN2で満たした絶縁容器にクライオスタットチャンバーに入れます。
3. LN₂の下に棒を交換する標本と標本ホルダーを握る。可能な限り、標本ホルダーを空気にさらすことは避けてください。
4. 試料ホルダーを、避難前室の避難を開始するとすぐに、クライオSEM標本室の事前避難室に迅速に設定する。次に、空気が完全に避難した後、寒い段階に標本ホルダーを置きます。少しの霜の蓄積は避けられませんが、「凍結エッチング」手順(ステップ6)はそれを取り除くことができます。

5. SEMでの設定

注: 観測の一般的な設定を以下に説明します。真空状態や電子ビームに応じて、いくつかの変更が必要です。

1. 観測の SEM パラメータを次のように設定します。
   加速度電圧:3~5kV
   試料段階の温度: < -120 °C
   検出器:二次放出

6. フリーズエッチング

注:フリーズエッチングは、わずかな氷の結晶昇華によってサンプルの細胞壁の端を強調するための手順です。凍結エッチングはまた、表面霜の塵を除去することを含む。

1. フリーズエッチング中に電気銃の加速電圧をオンにします。標本を観察しながら凍結エッチングを行う方が良いです。
2. 試料ステージの温度を-100°Cに上げます。
3. 霜の粉塵が取り除かれ、キシレム細胞の氷の表面レベルが細胞壁と比較してわずかに減少するまで数分間待ちます。
4. 試料ステージの温度を-120°Cに下げます。
   注:試料ステージに温度コントローラが取り付けされていない場合は、交換ロッドを使用して試料を保持し、数分間試料段階から取り外します。この凍結エッチングプロセス中に試料を数回観察し、標本の昇華状態を確認します。

7. 金属コーティング(オプション)

注:SEM器械およびイメージ処理の最近の改善は金属コーティングなしで電気絶縁標本の良質のイメージを提供できる。しかし、生体材料などの非導電性標本は、時には電荷の対象となることがあります。電子の蓄積(「充電」)による試料の特定の位置で高い明るさ。試料を電子ビームに長時間または高倍率でさらすことで、充電効果が大きくなります。試料の表面を電気導電性金属材料でコーティングし、充電の発生を防ぎます。クライオSEMユニット内に設置された真空コーティングシステムを使用して、塗装時に試料の温度が上昇するのを防ぎます。

1. コーティング材料がコーティングシステムの指定された蒸発器ヘッドに取り付けられていることを確認します。
2. -170 °C以下のコーティングシステムで冷たい段階の温度を維持します。
3. 十分な凍結エッチングの後、コーティングシステムの冷たい段階に試料ホルダーを置きます。
4. コールドステージと蒸発器ヘッドの間に仕切りを開きます。
5. 蒸発器ヘッドの電流値と電圧値をそれぞれca.30 mAとca.5Vに設定します。
6. ca.30sのコーティング材料を蒸発させ、試料の表面を被覆する。
7. 蒸発器ヘッドの電流値と電圧値の両方をゼロに設定し、パーティションを閉じます。
8. 観察のために試料室の冷たい段階に標本ホルダーを置きます。

結果

凍結-SEMによって観察された、縮小樹と広い木キシレムの横切り面の代表的な画像を図2に示す。低倍率では、画像内の黒い領域は水が完全または部分的に消失する空洞を示し、灰色の領域はキシレム細胞壁、細胞質、および水を示します(図2A)。高倍率では、水が3つの気管イドのルミナから完全に失われるわけ?...

ディスカッション

本論文で紹介したクライオSEM観測法は、細胞規模での水分布を明確に可視化するために実用的である。この方法を通じて、キシレム内の水の分布の変化を調べた場合、生物ストレス(水不足または凍結)や生物学的ストレス(樹木病)に対する樹種耐性のメカニズムを明らかにするのに役立つ可能性がある。

この方法で最も重要なステップは、サンプル収集およびその後のサ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
coating material	JOEL Ltd., Japan	Gold wire, 0.50 × 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499
cryo scanning electron microscope	JOEL Ltd., Japan	JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS
cryostat	Thermo Scientific	CryoStar NX70
microtome blade	Thermo Scientific	HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735
tissue freezing embedding medium	Thermo Scientific	Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006