哺乳類の細胞周期中に RNA 活性化蛋白質キナーゼの RNA インターアクターを勉強

要約

HeLa 細胞を用いた哺乳類細胞周期中に二本鎖 RNA 結合蛋白質キナーゼ rna (PKR) 勉強 RNA インターアクターのための実験的アプローチを提案します。このメソッドは、クロスリンク RNA PKR 錯体と PKR バインド Rna を豊かにする免疫沈降にホルムアルデヒドを利用しています。これらの Rna は、高スループット シーケンスまたは qRT PCR からさらに分析できます。

要約

タンパク質キナーゼ (PKR) rna は生得の免疫反応蛋白質のメンバーであるし、ウイルス Rna の二重鎖の二次構造を認識します。ウイルスの二本鎖 Rna (二本) にバインドされると、PKR は二量体化とそれに続く自己リン酸化を受けます。リン酸化 PKR (pPKR) はアクティブになり、真核生物の開始因子 2 (神経: Eif2) グローバル翻訳を抑制する α サブユニットのリン酸化を誘導します。増加する証拠を PKR を細胞周期の間に生理学的な条件の下で、または感染せず様々 なストレス条件下で起動できるかを示唆しています。しかし、pkr からの RNA の活性剤の私達の理解はキャプチャし、二本の pkr から相互作用を分析する標準化された実験方法の不足のために限られました。ここでは、提案する実験的具体的に豊かにし、PKR を分析するためのプロトコルは HeLa 細胞を用いた細胞周期中に Rna をバインドします。我々 は、PKR RNA 複合体を修正し、免疫沈降で分離するホルムアルデヒドの効率的な架橋アクティビティを利用します。PKR co 沈澱 Rna は、高スループット シーケンス ライブラリを生成するさらに処理することができます。PKR と相互作用する細胞二本鎖 rna の 1 つの主要なクラスは、重鎖と光鎖 Rna の相補的な相互作用による分子鎖 Rna として存在できますミトコンドリア Rna (mtRNAs) です。これらの二重 mtRNAs の strandedness を勉強するには、本鎖固有 qRT PCR のためのプロトコル。私達のプロトコルは PKR バインド Rna の解析に最適化されますが、細胞二本や他の dsRNA の結合蛋白質の RNA インターアクターを研究する簡単に変更できます。

概要

プロテインキナーゼ rna (PKR)、として知られている真核生物の開始因子 2 α キナーゼ 2 (EIF2AK2) はよ特徴付けられた蛋白質キナーゼ Rna によって提供される情報を伝送します。それは真核生物の翻訳開始 2 サブユニット α (神経: Eif2) に属するキナーゼ家族とグローバル翻訳¹を抑制して感染への応答でセリン 51 で神経: Eif2 を廃止します。このコンテキスト PKR は PKR 活性化と自己リン酸化²のプラットフォームを提供するウイルスの二本鎖 Rna (二本) によってアクティブ化されます。神経: Eif2、に加えて PKR できますもをリン酸化 p53、インスリン受容体基質 1、阻害剤 B、c 6 月 N 末端キナーゼ (JNK) 多数信号伝達経路^{3,4、5の活動を規制するには 6}。

PKR はもともとポリオ ウイルスの伝染の間にポリオ ウイルスの二本^7、8を認識することによ....

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プロトコル

1. ソリューションおよびセルの準備

1. ソリューションの準備
   1. 細胞培養液の 500 ml ダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) の牛胎児血清 (FBS) の 50 mL を追加することによって HeLa 細胞培養のためメディアを準備します。
      注: 抗生物質は、細胞培養液に追加できますが、我々 は抗生物質を使用しないでください。
   2. 0.1% パラホルムアルデヒド解散 1 で 4% (w/v) パラホルムアルデヒド x Phosphate-Buffered 生理食塩水 (PBS) ホット プレート上、希は暖房装置を持つ 1x PBS を追加して 0.1% (v/v) パラホルムアルデヒドの 30 mL をすること。
      注意: ヒューム フードのすべての手順を実行、パラホルムアルデヒド ソリューションを沸騰しないように注意してください。0.1% 溶液を光から保護し、4 ° C で保存ソリューションを使用して、1 ヶ月以内。
      注: 最後の 0.1% (v/v) パラホルムアルデヒド溶液の pH は約 7 をする必要があります。
   3. FCLIP の換散バッファーの準備: トリス-HCl (pH 7.5) 20 mM 15 mM 0.1% (v/v) トリトン X-100, 10 ミリメートルの EDTA、0.5% (v/v) ノニデット p40 (NP-40)、塩化ナトリウム 0.1% (v/v) ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) とデオキシ ....

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結果

HeLa 細胞を細胞周期の S または M の段階で逮捕するプロセスの模式図を図 1に示します。M 相逮捕のサンプルでは、(図 2 a) 顕微鏡の下で円形の形をした細胞を明確に視覚化できます。細胞周期の停止の効率を調べる、FACS (図 2 b) を使用してセルの核の内容を分析できます。D7F7 抗体が immunoprecipitate PKR する優れた性能を示す免疫沈?.......

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ディスカッション

S または M 相逮捕のサンプルを準備するプロセスを図 1に示します。S 期の細胞を逮捕、逮捕高効率 (図 1 a) を確保する間に 9 h のリリースで 2 回チミジンと細胞を扱ってチミジンの二重ブロック メソッドを使用しました。チミジンと一度セルを扱って M 相の逮捕のため 9 h のリリースに続いて、ブロック prometaphase (図 1 b) 細胞.......

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher Scientific	AM9260G
1 M Tris, pH 7.0	Thermo Fisher Scientific	AM9855G
1 M Tris, pH 8.0	Thermo Fisher Scientific	AM9855G
1.7 mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-175-C
10% Nonidet-p40 (NP-40)	Biosolution	BN015
10X DNA loading buffer	TaKaRa	9157
15 mL conical tube	SPL	50015
3' adaptor			5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3'
3 M Sodium Acetate pH 5.5	Thermo Fisher Scientific	AM9740
5' adaptor			5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3'
5 M NaCl	Thermo Fisher Scientific	AM9760G
50 mL conical tube	SPL	50050
Acid-phenol chloroform, pH 4.5	Thermo Fisher Scientific	AM9722
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	Magnetic beads DNA/RNA clean up
Antarctic alkaline phosphatase	New England Biolabs	M0289S
Anti-DGCR8			Made in house
Anti-PKR (D7F7)	Cell signaling technology	12297S
Anti-PKR (Milli)	Millipore EMD	07-151
ATP (100 mM)	GE Healthcare	GE27-2056-01
Bromophenol blue sodium salt	Sigma-aldrich	B5525
Calf intestinal alkaline phosphatase	TaKaRa	2250A
Cell scraper 25 cm 2-position	Sarstedt	83.183
CMV promoter sequence			5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'
Dulbecco's modified eagle medium	Welgene	LM001-05
dNTP mixture (2.5 mM)	TaKaRa	4030
Ethanol, Absolute, ACS Grade	Alfa-Aesar	A9951
Fetal bovine serum	Merck	M-TMS-013-BKR
Formamide	Merck	104008
Glycine	Bio-basic	GB0235
GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	AM9516
Isopropanol	Merck	8.18766.1000
NEBNext rRNA Depletion Kit	New England Biolabs	E6318	rRNA Depletion Kit
Nocodazole	Sigma-Aldrich	M1404
Normal rabbit IgG	Cell signaling technology	2729S
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	6148
PCR forward primer (RP1)			5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3'
PCR index reverse primer (RPI)			5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3'
PCR tubes with flat cap, 0.2 mL	Axygen	PCR-02-C
Phosphate bufered saline (PBS) Tablet	TaKaRa	T9181
Phusion high-fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0530	High-fidelity polymerase
PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotor	Benchmark	c2000
Polynucleotide kinase (PNK)	TaKaRa	2021A
Proteinase K, recombinant, PCR Grade	Sigma-Aldrich	3115879001
qPCR primer sequence: CO1 Heavy			Forward/Reverse: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO1 Light			Forward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO2 Heavy			Forward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO2 Light			Forward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO3 Heavy			Forward/Reverse: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO3 Light			Forward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CYTB Heavy			Forward/Reverse: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CYTB Light			Forward/Reverse: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: GAPDH			Forward/Reverse: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND1 Heavy			Forward/Reverse: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND1 Light			Forward/Reverse: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND4 Heavy			Forward/Reverse: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND4 Light			Forward/Reverse: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND5 Heavy			Forward/Reverse: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND5 Light			Forward/Reverse: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND6 Heavy			Forward/Reverse: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND6 Light			Forward/Reverse: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Random hexamer	Thermo Fisher Scientific	SO142
Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL)	TaKaRa	2270A
Recombinant Rnase inhibitor (40 U/μL)	TaKaRa	2313A
Ribo-Zero rRNA Removal Kit	Illumina	MRZH116	rRNA Removal Kit
Rotator	FINEPCR, ROTATOR AG	D1.5-32
RT primer sequence: CO1 Heavy			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′
RT primer sequence: CO1 Light			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′
RT primer sequence: CO2 Heavy			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′
RT primer sequence: CO2 Light			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′
RT primer sequence: CO3 Heavy			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′
RT primer sequence: CO3 Light			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′
RT primer sequence: CYTB Heavy			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′
RT primer sequence: CYTB Light			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′
RT primer sequence: GAPDH			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′
RT primer sequence: ND1 Heavy			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′
RT primer sequence: ND1 Light			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′
RT primer sequence: ND4 Heavy			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′
RT primer sequence: ND4 Light			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′
RT primer sequence: ND5 Heavy			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′
RT primer sequence: ND5 Light			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′
RT primer sequence: ND6 Heavy			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′
RT primer sequence: ND6 Light			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′
Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tube	Bio Plas	4167SLS50
Sodium dedecyl sulfate	Biosesang	S1010
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750
SUPERase In Rnase inhibitor	Thermo Fisher Scientific	AM2694
SuperScript III reverse transcriptase	Thermo Fisher Scientific	18080093	Reverse transcriptase for library preparation
SuperScript IV reverse transcriptase	Thermo Fisher Scientific	18090010	Reverse transcriptase for qRT-PCR
SYBR gold nucleic acid gl stain	Thermo Fisher Scientific	S11494
T4 polynucleotide kinase	New England Biolabs	M0201S
T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase)	New England Biolabs	M0204
T4 RNA ligase 2, truncated KQ	New England Biolabs	M0373
Thermomixer	Eppendorf ThermoMixer C with ThermoTop
Thymidine	Sigma-Aldrich	T9250
Tris-borate-EDTA buffer (TBE)	TaKara	T9122
Triton X-100	Promega	H5142
Ultralink Protein A sepharose beads	Thermo Fisher Scientific	22810	Protein A beads
Ultrasonicator	Bioruptor
Urea	Bio-basic	UB0148
Vortex mixer	DAIHAN Scientific	VM-10
Xylene cyanol	Sigma-Aldrich	X4126
γ-32P-ATP (10 μCi/μL, 3.3 μM)	PerkinElmer	BLU502A100UC