ラットの伝染性あくびを測定する実験室法

要約

ここで説明する方法は、見慣れたまたは不慣れな雄ラットのペアであくびの伝染曲線を得ることを目的としています。透明または不透明な区画で区切られた穴を持つケージは、視覚、嗅覚、または両方のタイプの感覚手がかりがあくびの伝染を刺激するかどうかを検出するために使用されます。

要約

コミュニケーションは動物の社会生活に欠かせない側面です。動物は互いに影響を与え合い、学校、群れ、群れで一緒に来るかもしれません。コミュニケーションはまた、求愛中に男女がやり取りする方法や、ライバルが戦わずに紛争を解決する方法でもあります。しかし、いくつかのタイプの感覚モダリティが関与している可能性が高いため、コミュニケート関数の存在をテストすることは困難な動作パターンがあります。例えば、伝染性あくびは、視覚、聴覚、嗅覚、または動物が互いに親しんでいるかどうかに応じて、これらの感覚の組み合わせを通じて起こる可能性のある哺乳類のコミュニケーション行為です。したがって、そのような行動の可能なコミュニケーション的役割に関する仮説をテストするためには、参加する感覚モダリティを同定するために適切な方法が必要である。

ここで提案された方法は、身近で見慣れないラットのあくび伝染曲線を得て、視覚および嗅覚感覚モダリティの相対的な関与を評価することを目的とした。この方法は、安価な材料を使用し、いくつかのマイナーな変更で、マウスなどの他のげっ歯類種と共に使用することもできる。全体的に、この方法は、隣接するケージに穴が開いているラット間の通信を許可または防止する不透明な仕切り(穴の有無にかかわらず)を持つクリアディバイダー(穴の有無にかかわらず)の置換を含みます。したがって、嗅覚コミュニケーション、視覚コミュニケーション、視覚および嗅覚コミュニケーションの両方、および視覚および嗅覚コミュニケーションの4つの条件をテストすることができる。ラット間の社会的相互作用が起こるにつれて、これらの試験条件は自然環境で起こりうるものをシミュレートする。この点で、ここで提案される方法は、生物学的妥当性が懸念を引き起こす可能性のあるビデオプレゼンテーションに依存する従来の方法よりも効果的である。それにもかかわらず、それは聴覚の潜在的な役割とあくびの伝染における匂いと視覚の役割を区別しません。

概要

伝統的に、コミュニケーション行動は2つの視点から研究されてきました。一つの視点から、倫理学者は自然の設定で動物の行動を観察し、記録し、その適応値1を認識しようとします。関与する特定の感覚や感覚は、これらの研究の主な関心ではありませんでした。別の観点から、生理学者は動物がコミュニケーションをとるメカニズムを解明することにもっと興味を持っています。したがって、実験室の研究は、感覚モダリティがコミュニケーション2、3で果たす役割に対処する方法を提供してきました。動物の社会生活におけるコミュニケーション行動を総合的に理解するためには、適応的価値と即時メカニズムの両方に関する知識が必要であるため、これら2つの視点は、まさに補完的である。

あくびの挙動は、魚から霊長類5に至るまで、脊椎動物4のいくつかの種における行動レパートリーの顕著な構成要素である。口の開口部が遅く、その開いた位置の維持が遅く、その後に口5のより迅速な閉鎖と記載することができる。シーケンス全体の持続時間は、種に依存します。例えば、霊長類は非霊長類種6よりも長い期間あくびをする。多くの種では、人間が例外である場合、男性は雌7よりも頻繁にあくびをする傾向がある。この機能はあくびの可能なコミュニケーション機能を支えるかもしれないが、あくびの規則的なパターンとその毎日の頻度はまた、生理的機能を示唆するかもしれない。ラットでは、自発的なあくびは概日リズムに従い、午前8時と午後8時、9時に高周波のピークが発生する。

あくび行動の興味深い特徴の1つは、いくつかの種の脊椎動物11、12において、伝染性行為(行動の刺激を放出すると、同じ方法^で10を振る舞う別の動物である場合)である可能性があることである。 ^13,14,15,16, 鳥¹⁷とげっ歯類¹⁸を含む .さらに、最近の証拠は、1匹のラットのあくびが嗅覚手^がかり19にさらされたときに別のラットの生理的状態に影響を与えることができるので、伝染性あくびがコミュニケーションの役割を反映する可能性があることを示している。しかし、あくびがコミュニケーションの役割を持っているかどうかは、まだ議論^の対象となっている20、21、そして伝染性あくびの分析は、この問題を解決するための重要な第一歩です。

一方、伝染性あくびは、他の動物の視点に共感する動物の能力にリンクされています。したがって、密接に関連する個人は、感染4を示す可能性が高い。この仮説は、動物がビデオ12、13にあくび刺激を提示される実験室条件で頻繁にテストされています。したがって、伝染は視覚的な手がかりによってのみ起こり得る。他の調査は、動物14、15の群を使用して、より自然な条件であくびの伝染を評価しました。この大きな問題は、社会的に相互作用する動物が、感覚モダリティの組み合わせを通じて伝達される合図や交換信号に反応することが多いことです。組み合わせた効果から特定の行動に関与する実際の感覚を区別することは、必ずしも簡単な作業ではありません。典型的には、研究者は、薬理学的または外科的に特定の意味の動物の使用を妨げ、その後、関連する行動2、3、18、22におけるその意味の役割を推測する。幸いなことに、動物23、24、25間のコミュニケーションを許可または妨害するために物理的な障壁のみが使用される他の方法があり、それによってより大きな生物学的妥当性を達成する。

ここで提案された方法は、社会的な環境で身近で見慣れないラットの伝染性あくびを研究するために特別に設計されています。共感仮説によると、前者のグループは、伝染性あくびの影響を受けやすいはずです。この方法は、動物が外科的または薬理学的に任意の感覚を奪われる必要はありません。代わりに、ラットを穴を持つ隣接するケージに入れ、穴の有無にかかわらず透明または不透明な仕切りを使用して通信を物理的に妨害することによって動作します。したがって、(1)嗅覚通信(OC、穿起不透明分周器)、(2)視覚コミュニケーション(VC、非穿起クリアディバイダ)、(3)視覚および嗅覚通信(VOC、穿備されたクリアディバイダー)、および(4)いずれも検査することができます。視覚または嗅覚通信(NVOC、非穿起不透明な分周器)。したがって、研究者は、嗅覚、視覚、およびある程度、あくびの伝染における聴覚手がかりの相対的な寄与を比較することができる。このアプローチは、同様の方法が^トカゲ23および^マウス26のような動物における特定のコミュニケーション行動に関与する感覚を分離するために使用されているように、新しいものではありません。実際、Gallupたちは、同様の方法を用いて、バジェリガーにおける伝染性あくびにおける視覚的手がかりの役割を実証した。これらの方法の主な特徴は、社会的文脈のシミュレーションと動物に与える最小限のストレスです。さらに、相互作用する動物の使用は、結論の生物学的妥当性を増加させる。

伝染性あくび25、28を測定する方法はいくつかあります。スティーブン・E・G・リー博士(パーソナル・コミュニケーション、2015)は、ここで使用されるデータの以前の分析のために、以前に原始学者13、14によって採用された方法を数値的に適応させるのを助けました^18.このプロトコルで提示されるこのメソッドの拡張バージョンは、より広い範囲のアプリケーションを備えています。これは、特定の時間枠の内外のラットのあくびの総数を、時間枠内外のあくびに対応する観察時間の割合で重み付けすることで構成されます。

例えば、ラットAとBが12分間観察されると仮定した場合、そのあくびは最も近い分に記録され、3分の時間枠は伝染性あくびを測定するように設定される。次に、これらのラットのあくびの配列は、ラットA(0,0,0,1,0,0,2,0,0,0,2,1)およびラットB(0,1,0,1,1,1,0,0,0,0,0,0,0,3)と考えられる。なお、各数値(0-3)は、各分で得点されたあくびの数に相当する。ラットAの場合、分1、10、および11(太字型の数字)の間に、ラットBは前の3分(選択した時間枠)またはその分以内にあくびをしません。その分で、ラットAは合計2回あくびをする。したがって、あくび刺激を受けずにラットAのあくび率(非あくび率)は2/3(すなわち、0.67あくび/分)である。残りの9分間で、ラットBは、同じ分または3分前のいずれかに少なくとも1回あくびをする。ネズミAは9分で合計4回あくびをする。したがって、あくび刺激に応答するラットAのあくび率(あくび後あくび率)は4/9(すなわち、0.44あくび/分)である。ラットBに同じ手順を適用すると、2/3(すなわち、0.66)の非あくび率と5/9(0.55)のあくび後のあくび率が得られます。

一方、あくびが1分の最も近い小数点以下に記録された場合、あくびの伝染はあくび後の時間を調整します。例えば、ラットAとBの12分間の観察期間に次のあくび時間が記録された場合:ラットA(2.3、5.1、5.8、10.4、10.8、11.1)およびラットB(1.2、2.4、4.5、5.1、11.2、11.6、11.8)。 ラットAの場合、ラットBが過去3分の範囲内で0~1.2分、8.1~11.2分(すなわち3.1分)の範囲であくびをしない期間は、合計4.3分の非あくび時間を生み出す。その間にあくびをする回数は3回(太字の数字)なので、あくび以外のあくび率は3/4.3(すなわち0.69)、あくび後のあくび率は3/7.7(すなわち、0.38、分母は12-4.3分)です。同様に、ラットBの場合、ラットAが過去3分の範囲内であくびをしない期間は0~2.3分、8.8~10.4分の範囲で、合計3.9分になります。これらの期間内のラットBのあく回数は1回なので、あくび以外のあくび率は1/3.9(すなわち0.25)です。したがって、あくび後のあくび率は6/8.1(すなわち0.74)です。

行動のほぼ同時期の一致は、伝染の存在を実証するための理想的な基準であるが、個人が出席するものに対する制約、刺激に対する反応の時間、時間の経過に対する行動の分布(例えば、あくび)エピソードで発生する可能性があります)、そして実験設定に順応する時間はすべて種の違いを生み出し、ユニークな時間枠を使用することは困難です。これは、研究者が秒5から数分11まで変化するタイムウィンドウを使用した理由であり、^結果28を比較する際に問題が発生する可能性があります。このため、あくびの伝染曲線を得て、種間のあくび伝染曲線を比較するために、時間ウィンドウの範囲について上記の手順を繰り返すことを提案する。

同等のあくび伝染曲線は、観察期間にわたって各ラットについて観察されたあくびの数をランダムに分配することによって比較することができる。したがって、あくびの伝染を測定する提案された方法は、(1)時間ウィンドウの外で発生するあくび率(非あくび時間)と(2)あくびの数のランダム分布から得られる人工あくび伝染曲線の2種類の制御を提供する。したがって、あくびの伝染を分析するこのアプローチは、単一の時間枠内であくびのパーセンテージまたは頻度を比較するような他の手順から、この^{ウィンドウ25}の外で起こるものとを比較するような他の手順から一歩前進している。実際の時間フレーム。この方法は、Rベースの^{プログラム29}によって補完され、1つまたは複数の時間枠に対する伝染性あくびの確率を便利かつ客観的に計算する。

この方法の有用性とRベースプログラムの利点を説明するために、以前に公開された^研究18からのデータセットが使用される。実験条件は、144匹の雄ラットで構成され、なじみのない状態または不慣れな状態のいずれかに割り当てられました。各実験条件のラットを9対の4つのサブグループに細分化し、上述の4つの試験状況のいずれかに曝露した。その後、各実験条件および試験状況におけるラットのあくび行動を60分の期間にわたって記録した。

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プロトコル

実験プロトコルと畜産は、制度上のガイドラインに従って行われた。

1. 材料

1. 材料の表でメソッドを実装するために使用される材料の完全なリストを検索します。図1を使用して、反転T字型テーブル、観察ケージ、ケージ仕切りを構築するための専門家のアドバイスを求めます。鋭利な工具および潜在的に危険な材料の使用のための安全指示に従ってください。
2. 2本のレール状の木製の棒(長さ45cm、互いに0.6cmを分離)を上部と木片の真ん中(100 cm x 45 cm x 1.5 cm)に接着して、反転T字型のテーブルを作ります。次に、レールのような棒の間に2番目の木材(50 cm x 45 cm x 0.6 cm)を垂直に配置します。この 2 番目の木材が、一方の側のネズミのペアが反対側の他のペアを見るのを防ぐことを確認してください (図1)。
3. ガラスとアクリルを使用して、8つの観察ケージを作成します。各ケージ(幅19cm、長さ19cm、高さ10cm、厚さ3mm)に、両側の中央に3列に24個の等距離穴(直径5mm)が配置されていることを確認します。アクリル(厚さ3mm)のこの側を作り、ラットが呼吸できるように反対側の高さを0.7cm短くします。
   1. 各観察ケージには、60分の観察期間中にラットが飼育し、気を散らすことを防ぐために、アクリル製のスライド蓋が付いていることを確認してください。
4. アクリル(幅19cm、高さ30cm、厚さ3mm)から4つの仕切りを作ります。観察ケージ内のものと一致する24個の穴(直径5mm)をドリルし、それぞれ1つの明確な仕切りと1つの不透明な仕切りにします。
5. あくびの発生を記録するために、事前にデータシートを準備します。各データシートの見出しに、観察者の名前、実験条件(すなわち、身近なラットまたは不慣れなラット)、関連する試験状況(OC、VC、VOC、NVOC)、日付、および観察の初期および最終時刻を含める。データシートの残りの部分を2つの列に分割し、それぞれ上部に書かれたラットの数を持ち、ラットのあくびの挙動を記録します。

2. 手続き

1. 144匹のオスのネズミをプラスチックケージ(ホームケージ)に入れ、生後2.5ヶ月に達するまで離葉した。彼らはホルモンサイクルによる行動の大きな変化を示す傾向があるので、女性のラットを使用しないでください, これは、テスト状況の影響と混同する可能性があります.各ケージ内のネズミが兄弟ではないことを確認してください。
   注:すべてのラットを一緒に得ることは困難な場合があります。その場合、少なくとも8匹の慣れ親しんだラットと8匹の不慣れなラットのブロックを作成し、すべての試験状況が各実験^条件30で1回表されるようにする。
2. ラットを識別するには、市販のマーカーを使用して尾に記号番号を付けます。たとえば、ドットと線を組み合わせて 1 ~ 4 の数値を表します (たとえば、1 番の場合は 1 個、4 行目に 1 行)。異なる色を使用して、よく知られていないラットを識別します。
   注:動物施設のスタッフが提供する安全指示に従ってラットを取り扱い、実験を行う施設での実験動物の正しい使用に関する勧告に従います。
3. ランダムにどのホームケージは、おなじみのラットのグループを収容し、不慣れなグループを収容します。たとえば、4 つのホーム http://cran.r-project.org/ ケージに 16 匹のラットが住んでいるとします。
   > サンプル(4,4)
   [1] 4 3 2 1
   1. ホームケージ4と3で見慣れない(または見慣れない)ラットをグループ化し、ホームケージ2および1に見慣れない(またはなじみのない)ラットをグループ化する。動物施設のスタッフが各ケージのアイデンティティを維持し、動物施設内の他のすべてのラットと同じ方法でラットを処理することを確認します。
   2. Rプログラムを再び使用し、ランダムに各実験条件で各ペアを形成するラットを選択します。おなじみのラットの各ペアのラットが同じホームケージから発生していることを確認し、不慣れなグループのペアに対してその逆が当てはまることを確認します。各実験条件の各試験状況に対して、ラットのペアをランダムに選択します。
4. テストセッションごとに、8つの可能なテスト状況(1匹につき4匹)(60分間の観察期間)のうち2つのテストセッションを1日に2回実行します。3 時間以内に 2 つのテスト セッションを連続して実行します。
   注:交絡因子を避けるために、午前または午後にすべてのテストセッション(1日あたり4組のラット)を行うことを確認してください。2 日間連続して実験の完全な反復 (8 つのテスト状況) を実行します。
   1. 実験の反復ごとに、ランダムなシーケンスでテスト状況を使用してください。たとえば、番号 1 ~ 8 を使用して各テスト状況を識別し、次のように R を使用します。
      >サンプル(8,8)
      [1] 8 7 4 6 5 1 2 3
   2. テスト状況 8 と 7 をテスト セッション 1、テスト状況 4 および 6 をテスト セッション 2 に割り当てます。次いで、ラットの各ペア(試験状況)が配置される反転T字面表の側面をランダムに選択する。
5. 実験の 2 回目の反復 (ブロック)についても、同じ手順 (手順 2.3 ~ 2.4.2) を繰り返します。
   注:研究の目的は、あくびの頻度に対する社会的状態(すなわち、2匹の相互作用ラット)の影響をテストすることである場合は、空の観察ケージの隣に置かれた1匹のラットを、4つの試験状況のそれぞれに対するコントロールとして使用する。8匹のラットの対照群に対して各試験状況に対してこの実験を2倍に行う。
6. 最初の4匹のラットを動物施設から観察室に移し、新しい環境に順応するために15分間残ってテストセッションを設定します。個々のケージでラットを輸送し、輸送中や観察室で互いに分離しておきます。
   注:動物施設のスタッフが提供する動物を輸送するための安全指示に従い、指定された服を使用して実験室で動物と一緒に作業します。ラットは観察室にいる間、食べ物と水にアクセスできません。
7. 順化期間が過ぎた後、反転した T 字型テーブルを大きな長方形のテーブルに配置します。観察を行う際に十分に部屋を点灯する天井ランプがあることを確認してください。
8. 各観察ケージの底にフィルターペーパーを置き、反転したT字型テーブルの両側にケージをペアに置きます。対応する仕切りをケージの各ペアの間に配置します。
   注:フィルターペーパーはケージをきれいにすることを容易にし、ラットが滑らずに動くことができる粗い表面を提供する。
9. 戦略的に 2 つのデジタル ビデオカメラを配置し、それぞれがラットの各ペアのあくびの動作を記録します。ビデオカメラが三脚に安全に固定され、観察ケージに正しく向かっていることを確認します。ビデオカメラをデスクトップコンピュータに接続して、ラットの動作を同時に監視します。
   注: フラッシュ ドライブにデジタル情報を保存して、実験セッションを永続的にアーカイブします。大容量のフラッシュドライブを使用します。
10. 順化期間に続いて、ラットを以前に決定した割り当てに従って観察ケージに入れなさい。ビデオカメラの自動フォーカスを設定し、ストップウォッチで同時にビデオ録画を開始します。60分の観察期間の終わりにビデオ録画を停止します。
    注:実験者は、テストセッション中に部屋の外にいて、遠隔で観察することができますが、1人が観察室にいる(実験設定から可能な限り遠く)ラットの行動を監視しながら、テスト セッションが中断されずに続行されることを確認します。
11. 観察が終わったら、動物施設の自宅のケージにネズミを返します。動物施設のスタッフに、ラットが再び食物と水にアクセスできることを確認してもらいます。非毒性洗剤を使用して観察ケージを徹底的に清掃し、実験セットアップを準備して、その日の2回目と最終試験を行います。
    注:観察ケージに入れたときにラットが残した香りを取り除くために木材をきれいにし、テストした次のラットの行動に影響を与える可能性があります。
12. 1~2人のボランティアを部分的に見失い、全発生サンプリング法を用いてあくびを特定して記録します。オブザーバーが導入セクションで説明されているあくびの定義を使用していることを確認します。
13. 任意の標準的な再生システムを使用して、コンピュータ画面上で各ビデオを再生し、投影します。観察者に各ビデオを見てもらい、以前に作成したデータシートを使用してあくびの動作を観察および記録してもらい、あくびを観察して測定する能力を高めるために、より遅い速度でビデオを確認できるようにします。
    1. オブザーバーに、次のような表記システムを使用してあくびを採点するよう依頼する:あくびの発生を表すために上付き文字として書かれた分を持つ垂直線を使用する(例えば、. ³ |⁶ |⁹は、分3で1つのあくび、分6で2つのあくび、分9で1あくびを示す)。スコアはシーケンス(例えば、1.2、2.2、3.2、5.0、5.8)であくびをして、より高い精度(小数点以下1桁に丸められた分)で記録します。
    2. または、標準的なデータ収集プログラムを使用して、ビデオからコンピュータに直接データを入力します。オブザーバーがそのようなプログラムに精通していることを確認します。
       注: 必要に応じて、オブザーバーが複数のセッションで各ビデオを表示できるようにします。1 つのオブザーバーが 1 ブロックの実験に対応するすべてのビデオを見ることを確認します。2人の異なるオブザーバーがこれらのビデオを見た場合、あくびを観察し記録する能力の違いがテスト状況の影響を混乱させるリスクがあるかもしれません。あくびが同じ方法でアーンに付加されるように、ビデオの10%-20%で異なる観察者間の観察者間の信頼性をスコア付けすることが重要です。

3. データ処理

1. 各ラットのあくびの時間的なシーケンスをデータシートからスプレッドシートに書き起します。短い見出しを持つ各ラットに1つの列があることを確認します(例えば、fr1.lとfr1.rは、それぞれ左右の側に使い慣れたラットの最初のペアを示します)。 空のセルを 0 または NA で塗りつぶして、すべての列が同じ長さであることを確認します (下記を参照)。
   注: 補足ドキュメントとして提供されている一般的なガイドを使用して、データを処理し、伝染性あくびを測定し、伝染性あくび曲線を取得するために、次の手順を完全に理解します。
   1. あくびが最も近い分に記録された場合は、関連する各分であくびの数を入力し、特定の分にあくびが発生しなかったときにセルを埋めるために0(あくびなし)を使用します。ワークシートをテキスト ファイル (.txt) として保存します。
   2. あくびが1分の最も近い小数点まで記録された場合は、シーケンス上から下に入力し、"NA"を使用して、あくび(行)の数が列の数よりも低い列(ラット)を埋めるために「NA」を使用します。で。ワークシートをテキスト ファイル (.txt) として保存します。
      注: R は空のセルを使用できるため、ワークシートは異なる長さの列で保存できます。不足しているデータを処理するには、R が提供するヘルプ オプションを使用します。
2. R. 開始 以前に配置されたファイルからデータをインポートします。
3. 拡張子"でプログラムコードを保存します。R"(補足資料として提供)、あくびが整数または小数として記録されたかどうかに応じて、特定のプログラムコード(一般ガイドを参照)をダウンロードします。ラットのペアと必要な時間枠数のプログラムを実行します。
   1. 各ラットのあくびの数をランダムに分布して、プログラムをもう一度実行します(一般的なガイドを参照)。すべての実験条件(例えば、身近なラットや見慣れないラット)および/またはすべての試験状況について、同じ手順(手順3.3~3.1)に従ってください。一般的なガイドに示すように進み、結果を Excel にエクスポートします。
      注: テキスト エディターを使用して前に保存したプログラムをインポートする代わりに、R のワークスペースにプログラムをコピーして直接貼り付けます。
4. あくびの伝染曲線を作成するには、スプレッドシートに以前に保存したデータを使用します。ラット、時間枠、およびテスト状況の各ペアの感染率から非伝染率を減算します。観測されたデータと人工的な(ランダムに分布する)データの分析を分離します。
   1. 次に、ブートストラップ手順を使用して、各時間枠とテスト状況の信頼区間(CI)を計算します(一般的なガイドを参照)。使い慣れたラットと不慣れなラットの分析を分離します。次に、各実験条件の 4 つのテスト状況の人工データを組み合わせ、ブートストラップ手順を使用して各時間枠の CI を計算します。
   2. 次に、各テスト状況と実験条件のプロットを作成します (図 2および図 3を参照)。最後に、多重回帰分析を実行して、テスト状況間のあくびの感染の強度を比較します(下記参照)。

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結果

ラットは、頻繁にあくびのために選択されたスプラーグ・ドーリーラットの以前に生産されたサブラインから選択された(1時間あたり約22あくび31)。しかし、1回の試験状況につき使われた9組の見慣れないオスラット(生後2.5~3ヶ月)は、平均18回、1時間に約12回あくびをした。従って、あくびの伝染を測定する試験状況は部分的にあく?...

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ディスカッション

成功を収めるために考慮する必要があるメソッドには、重要な手順があります。おなじみのラットは、分けた後、実験を実行する前に、少なくとも1.5ヶ月間ホームケージを共有する必要があります。しかし、慣れないネズミは別々の家のケージに住む必要があります。どちらの場合も、ラットのペアは異なるごみから来る必要がありますが、年齢は可能な限り類似している必要があります。?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylic dividers	Handcrafted	Not available	Two dividers, one clear and one opaque, will have 24 holes each. The other two dividers, one clear and one opaque, will have no holes. See the main text for details of construction.
An R-based program	Benemérita Universidad Autónoma de Puebla	Not available	This is the program used to assess yawn contagion in rats. See the main text for information about the way the program is used.
Data sheets	The user can elaborate them	Not available	These forms will be used for the observer to record the frequency of yawning behaviour by viewing the video recordings. Alternatively, a notebook can be use provided you follow the suggestions given in the main text.
Desktop computer	Any maker	Not available	Make sure the computer has a video card capable of conveniently processing the video recordings of yawning behaviour.
Digital camcorders	Any maker	Not available	They will be used to video record yawning behaviour of each pair of rats; there will be 2 pairs of rats per experimental session.
Flash drive	Any maker	Not available	Each experimental session will last 60 min, and so you will require sufficient memory to store the video recording.
Glass cages	Handcrafted	Not available	Each cage (19 X 19 X 10 cm height) will have 24 holes (0.5 cm diameter) forming three rows in the middle of one of its sides. See the main text for more details about their construction. It is recommended to fabricate one extra cage in case one of them is accidentally broken.
Markers	Sharpie or any other maker	Not available	Permanent markers to number the rats. See the main text to see one way of using painting symbols on the rat's tail.
Pencils	Any maker	Not available	They are used by the observer to record the frequency of yawning. It is important that the observer has previously been trained to recognize yawning behaviour and operate the video player system.
R software	R Development Core Team	Not available	Download R at: http://cran.r-project.org/
Rail-like wooden bars	Handcrafted	Not available	They will be fixed in the middle of the rectangular wooden sheet  forming a track, where a second wooden sheet is placed. See the main text for additional instructions for construction.
Rectangular table	Any maker	Not available	This is the table (approximately 2 x 1 m) where the inverted T-shaped table will be placed for performing the observation of yawning behaviour.
Sprague-Dawley male rats	Any local supplier of laboratory animals	Not available	Nine pairs of male rats per test situation are necessary for each group, familiar and unfamiliar rats, because with this sample size the interindividual variation that might exist in yawning frequency will not severely affect the conclusions drawn from the statistical analysis performed to the data.
Spreadsheet software	Microsoft	Not available	Excel will be the software used to store the yawning recordings initially recorded on the data sheets. Revise the main text for instructions about the recommended way of doing the transcription.
Square filter papers	Any maker	Not available	They are used for covering the cage's bottom.
Tripods	Any maker	Not available	They will be used for fixing the camcorders in front of each pair of observation cages.
Wooden Inverted T-shaped table	Handcrafted	Not available	Read the instructions in the main text to see the way of constructing it. If preferred, a different material to wood can be used. Make sure any material is as resistant as possible to the transmission of ultrasounds, which the rats might use for communication.