臍帯血由来から 3 D 肌 Organoid の生成誘導多能性幹細胞

要約

これらのケラチノ サイトと線維芽細胞を用いた誘導多能性幹細胞由来ケラチノ サイトと線維芽細胞を区別し、3 D 肌 organoid を生成する方法を示すプロトコルを提案します。このプロトコルには、ヒト化マウス モデルを生成する追加の手順が含まれています。ここで紹介しているテクニックは、皮膚の研究が改善されます。

要約

皮膚は身体の最大の臓器で、多くの機能。皮膚は、物理的な障壁と体のプロテクターとして機能し、身体機能を調節します。バイオ ・ ミメティクス モデル、システム、および複雑な人間の問題¹の解決の為、自然の要素の模倣であります。皮膚バイオミメティックスは体外病研究と生体内再生医療の役に立つツールです。ひと誘導多能性幹細胞 (Ips) 無制限の増殖特性と 3 つの胚葉分化の能力があります。人間の Ips は、様々 な細胞、血液細胞、ケラチノ サイト、線維芽細胞などから生成されます。その中で、臍帯血単核細胞 (CBMCs) は、同種の再生医学の視点から代替セル源として浮上しています。ひと白血球抗原 (HLA) の入力が銀行システムのセルに不可欠であるために、CBMCs、再生医療に役立ちます。我々 は CBMC Ips のケラチノ サイトと線維芽細胞への分化と 3 D 肌 organoid の生成のためのメソッドを提供します。CBMC iPSC 由来ケラチノ サイトと線維芽細胞一次電池ラインと同様の特性があります。3 D 肌 organoids が真皮層に表皮層を重ねることによって生成されます。この 3 D 肌 organoid を移植、ヒト化マウス モデルが生成されます。本研究では、3 D iPSC 由来皮膚における in vitro および in vivo 皮膚研究小説、代替用具であるかもしれないことを示しています。

概要

皮膚は身体の外側の表面をカバーし、内臓を保護します。皮膚が病原体からの保護、吸収、保存水など、さまざまな機能、体温を調節し、体を排泄を無駄に²。皮膚移植は皮膚のソースに応じて分類できます。別のドナーからのスキンを使用して移植は移植と呼ばれているし、患者自身の皮膚を使用して移植は自家。自家の低拒絶反応の危険があるため最寄りの治療ですが、皮膚生検は重篤な病変を有する患者または皮膚細胞の数が不足で実行が困難です。重症熱傷患者、皮膚細胞数の 3 倍、大きい区域をカバーするために必要です。Allogenous 移植が必要な状況では患者の体から皮膚細胞の限られた供給の結果します。同種移植片は、までは通常、約 1 週³の後の宿主の免疫系による拒絶されるので、自家移植を行うことが一時的に使用されます。患者さんの免疫システムによって拒絶を克服するためには、移植が患者⁴と同じ免疫 id とソースから来なければなりません。

ヒト Ips 細胞の幹細胞療法⁵新たな源であります。人間の Ips は、OCT4、SOX2、Klf4、C-myc⁶などリプログラミング因子を用いた体細胞から生成されます。胚性幹細胞 (Esc)^7,8の倫理的および免疫学的問題を克服する人間 Ips を使用しています。人間 Ips 多能性と 3 つの胚葉⁹に分化することができます。HLA、再生医療で重要な要因の存在は、免疫反応と拒絶反応¹⁰の可能性を決定します。患者由来の Ips の使用は、ソース セル制限と免疫拒絶の問題を解決します。CBMCs も再生医療¹¹代替セル源として浮上しています。CBMC 銀行中に発生する、入力すると、必須の HLA は、研究と移植に簡単に使用できます。さらに、ホモの HLA 型 Ips は、様々 な患者の¹²に広く適用できます。CBMC iPSC 銀行は小説と細胞療法と同種の再生医療^12,13,14のための効率的な戦略です。本研究では CBMC Ips、ケラチノ サイトと線維芽細胞、分化し、層状 3 D スキン層を生成します。本研究の結果は、in vitro および in vivo 皮膚研究のための新しいツールである CBMC iPSC 由来 3 D 肌 organoid をお勧めします。

プロトコル

実験室の動物福祉法、ケアおよび実験動物の使用のためのガイドに従い動物を含むすべての手順を行ったし、機関動物ケアによって提供されるガイドラインと齧歯動物実験のためのポリシーと使用委員会 (IACUC) 韓国カトリック大学医学部。研究プロトコルは、韓国のカトリック教の大学 (CUMC-2018-0191-01) の制度検討委員会によって承認されました。2017 と取得した評価会で韓国食品医薬品局の韓国優秀動物研究施設、IACUC、学科の研究室動物 (逃げよう) 韓国カトリック大学の Songeui キャンパスに認定し、2018 年に研究所動物ケア国際 (AAALAC) 国際完全認定の認定。

1. 皮膚の誘導多能性幹細胞からの細胞分化

1. 培地の準備
   注: は、3 ヵ月の暗い環境で 4 ° C ですべての媒体を保存します。殺菌のため使用前に 0.22 μ m ポリエーテルサルホン フィルター システムを使用してすべての媒体をフィルター処理します。すべての媒体は、500 mL の容量で利用できた。
   1. KDM1 の準備 (表皮細胞分化培地 1)。ミックス ダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM)/2% ウシ胎児血清 (FBS)、0.3 mmol/L L アスコルビン酸、5 μ g/mL インスリン 24 μ g/mL アデニンと F12 媒体 (3:1)。
   2. KDM2 の準備 (表皮細胞分化培地 2)。ミックスは、表皮細胞の無血清培地を定義 (テーブルの材料を参照) 0.3 mmol/l L アスコルビン酸、5 μ g/mL インスリン 10 G/ml アデニンと。
      注: 定義された表皮細胞の無血清培地は、ケラチノ サイトの拡大成長を支援に最適です。
   3. KDM3 の準備 (表皮細胞分化培地 3)。ミックスは、表皮細胞の無血清培地を定義し、表皮細胞無血清培地 (1:1) 詳細については材料の表を参照してください。
      注: 表皮細胞の無血清培地は、成長とケラチノ サイトのメンテナンスに最適です。
   4. FDM1 の準備 (線維芽細胞分化培地 1)。5 %fbs、5 μ g/mL インスリン、0.18 mM アデニンおよび 10 ng/mL 上皮成長因子 (EGF) とミックス DMEM/F12 媒体 (3:1)。
   5. FDM2 を準備 (線維芽細胞分化培地 2)。5 %fbs と 1% 必須でないアミノ酸ミックス DMEM/F12 媒体 (1:1)。
   6. EP1 を準備 (1 上皮中)。ミックス DMEM/F12 (3:1) 4 mM L グルタミン、40 μ M アデニン、10 μ g/mL トランスフェリン、10 μ g/mL インスリンと 0.1 %fbs。
   7. EP2 の準備 (上皮中 2)。EP1 と 1.8 mM 塩化カルシウムを混ぜます。
   8. EP3 の準備 (上皮中 3、ハツカネズミ中)。4 mM L グルタミン、40 μ M アデニン、10 μ g/mL トランスフェリン、10 μ g/mL インスリン、2 %fbs と 1.8 mM 塩化カルシウム ミックス F12 媒体。
2. 胚体生成
   1. CBMC Ips 以前研究¹²に示すプロトコルを使用してが生成されます。
   2. コート文化料理、ビトロネクチン。100 mm ディッシュをコートに 5 mL を準備します。
      1. 解凍し、0.5 mg/mL ビトロネクチンの 50 μ L を再懸濁します (最終濃度: 5 μ g/mL) 5 ml 滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の。料理をソリューションに追加し、1 h. 吸引使用 (乾燥しない) する前にコーティング材 (RT) 室温で孵化させなさい。
   3. ビトロネクチン コーティング 100 mm CBMC 由来 Ips プレートし、10% の CO₂と 37 ° C で毎日 iPSC 媒体 (E8) を変更を維持します。
   4. 以前研究¹⁵ (説明の簡潔に次のように) に示すプロトコルを使用して萌芽期の体 (EBs) を生成します。セルが 80% の合流点に到達するまでに媒体を変更することにより、Ips を展開します。80% の合流点でメディアを取り出して、PBS で洗浄します。
   5. 1 ml の 1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) のセルを扱います。5% CO₂ 2 分の 37 ° C で、E8 培地 3 mL を使用してセルを収穫します。2 分間 250 x gで細胞を遠心します。
   6. 上清を吸引し、E8 培地 5 mL をセルに適用します。診断を使用してセルをカウントし、1 x 10 の⁶セルを新しい 15 mL の円錐管に転送します。2 分間 250 x gで細胞を遠心します。
   7. 10 μ M の Rho 関連キナーゼ (ロック) 阻害剤による EB 形成中の 2.5 ml 転送細胞を再懸濁します。1 x 10 の⁴セル (25 μ L/ドロップ) 10-100 μ L マルチ チャンネル ピペットを使用して noncoated 文化板蓋の上にドロップします。1 x 10 の⁶セル (1 × 10⁴セル/1 EB) からフォーム 100 EBs。皿を裏返して、蓋、液滴にハングアップします。
      注: ROCK 阻害剤は、維持と分化プロセスの添付手順で必要です。EB 集計段階で ROCK 阻害剤を追加します。
   8. 1 日 5% CO₂と 37 ° C で水滴を孵化させなさい。
   9. 次の日、収穫、100 EBs と差別化のために使用します。IPSC 媒体 (E8 媒体) または PBS とプレートの蓋を洗うし、50 mL の円錐管にその内容を収穫します。それらを解決するため 1 分の RT で EBs を維持します。上清を吸引、E8 媒体、EBs を再懸濁します、分化まで 90 mm シャーレでそれらを維持します。
3. CBMC Ips のケラチノ サイトへの分化
   注: CBMC Ips から表皮細胞の分化においては、図 1を参照してください。
   1. IPSC 媒体または PBS で 50 mL の円錐管に収穫、100 EBs。EBs 落ち着くに 1 分間、常温を維持します。円錐管の下部につけるかどうかを確認します。上清を吸引し、1 ng/mL 骨形成タンパク質 4 (BMP4) E8 媒体と EBs を再懸濁します。90 mm シャーレの EBs を転送し、1 日 5% CO₂と 37 ° C でそれらを維持します。
   2. IV 型コラーゲンを使用して培養皿をコートします。100 mm ディッシュをコートに IV 型コラーゲンの 5 mL を準備します。
      1. 解凍し、タイプ IV コラーゲン溶液を再懸濁します (最終濃度: 50 μ g/mL) 0.05 N 塩酸。 料理にソリューションを追加し、RT で 1 時間インキュベートを使用 (乾燥しない) する前に塗料を吸引。
         注: プレートを使用する前に洗って料理 3 x 酸を削除する PBS の。
   3. 50 mL の円錐管に EBs (ステップ 1.3.1) を収穫し、それらを解決するため 1 分の RT でそれらを維持します。彼らは、円錐管の下部に解決、上清を吸引、10 μ M ROCK 阻害剤と KDM1 の 6 mL で EBs を再懸濁しますを確認します。タイプ IV コラーゲン被覆 100 mm 皿に EBs を転送します。
      注: は、EB 添付の段階にのみ ROCK 阻害剤を追加します。
   4. 0-8 日間中 3 μ M レチノイン酸 (RA) と KDM1 にすべての他の日と 25 ng/mL、各 BMP4 EGF を変更します。5% CO₂と 37 ° C で EBs を維持します。
   5. 日 9-12 の間に媒体を変更他の毎日 3 μ M RA、25 ng/mL、BMP4 20 ng/mL EGF と KDM2。
   6. 13-30 日の間に媒体を変更その他の毎日 KDM3 10 ng/mL BMP4 と 20 ng/mL EGF。
4. CBMC iPSC の線維芽細胞への分化
   注: CBMC Ips から線維芽細胞の分化においては、図 2を参照してください。
   1. コートの培養皿の基底膜マトリックスを使用しています。100 mm ディッシュをコートに 5 mL を準備します。
      1. 基底膜マトリックスを解凍 (最終濃度: 600 ng/mL)/F12 DMEM 培地で希釈し、。料理をソリューションに追加し、30 分吸引 (乾燥しない) 使用前に塗料の 37 ° C で孵化させなさい。
   2. IPSC 媒体または PBS のピペットを使用して 50 mL の円錐管に収穫、100 EBs。EBs 落ち着くに 1 分間、常温を維持します。円錐管の下部につけるようにします。上澄みを除去します。
   3. 10 μ M の ROCK 阻害剤と FDM1 の 6 mL で 1,000 μ L ピペットを使用して EBs を再懸濁します。基底膜マトリックス コート 100 mm 皿 (中) と EBs を転送し、, 5% CO₂と 37 ° C で。3 日間毎日、FDM1 を更新します。
      注: のみ、EB 添付の段階で ROCK 阻害剤を追加します。
   4. 4 日から 6 日間 FDM1 に 0.5 nM 骨形成タンパク質 (BMP 4) 4 を追加します。
   5. 7 日に媒体を変更 FDM2 1 週間毎日。
   6. 14 日に 1 mL 1 mM EDTA を加えるし、2 分 2 分、上清を除去し、FDM1 の 5 mL の細胞を再懸濁します FDM2 3 mL、250 × gで遠心すると細胞の収穫のため 5% CO₂と 37 ° C で孵化させなさい。
   7. 診断を使用してセルをカウント、FDM1 培地で 2 x 10⁶細胞を再懸濁し、セルを noncoated の皿に転送します。5% CO₂と 37 ° C で細胞を維持し、一日おきに媒体を変更します。
   8. 使用したコート文化料理 I 型コラーゲンです。100 mm ディッシュをコートに 5 mL を準備します。希釈タイプ I のコラーゲン溶液 (最終濃度: 50 μ g/mL) 0.02 N 酢酸。料理をソリューションに追加し、1 h. 吸引使用 (乾燥しない) する前に塗料の RT で孵化させなさい。
      注: プレートを使用する前に洗って料理 3 x 酸を削除する PBS の。
   9. 21 日に 1 mM EDTA の 1 mL を追加し、2 分 FDM1 3 mL、250 × gで遠心するとセルを収穫は、2 分の上澄みを除去し、FDM1 の 5 mL の細胞を再懸濁しますのため 5% CO₂と 37 ° C で孵化させなさい。検定と転送を使用してセルを 2 × 10⁶細胞型に私 FDM1 中コラーゲン被覆の 100 mm ディッシュの数。5% CO₂と 37 ° C で細胞を維持し、一日おきに媒体を変更します。
   10. 28 日に 1 mM EDTA の 1 mL を追加し、2 分 FDM1 3 mL、250 × gで遠心するとセルを収穫は、2 分の上澄みを除去し、FDM1 の 5 mL の細胞を再懸濁しますのため 5% CO₂と 37 ° C で孵化させなさい。診断を使用してセルをカウントし、2 x 10 の⁶セルを FDM1 中 noncoated 皿に転送します。5% CO₂と 37 ° C で細胞を維持し、一日おきに媒体を変更します。
       注: iPSC 由来線維芽細胞は主に線維芽細胞のセルラインと 10 の通路までの通路のような増殖します。本研究では、さらに分析 2 ~ 5 通路の iPSC 由来線維芽細胞を使用しました。

2. による細胞分化の応用

1. 3 D 肌 organoid の生成
   1. 中和型を準備私コラーゲン氷上では、製造元の推奨事項に従います。最終濃度として 3 mg/mL を使用しての I 型コラーゲン (ストック濃度は I 型コラーゲンは 3.47 mg/mL)、混合物の最終的な量は 5 mL であることを確認します。10 x PBS の体積を計算 (最終的なボリューム/10 = 0.5 mL)。ボリュームを計算する I 型コラーゲン使用される (最終的なコラーゲン濃度 x 最終巻/コラーゲン濃度を株価 = 5 mL x 3 mg/mL/3.47 mg/mL = 4.32 mL)。1 N NaOH の量を計算する (使用するコラーゲンの量 × 0.023 mL = 0.1 mL)。DH₂O のボリュームを計算 (10 x PBS - 1 N NaOH の量の最終的なボリューム - コラーゲン - ボリューム = 5 mL 4.32 mL ・ 0.5 mL 0.1 mL = 0.08 mL)。管の内容をミックスを使用する準備ができるまで氷の上保管してください。
   2. 1.4.10 のステップから iPSC 由来線維芽細胞に EDTA の 1 mL を追加し、2 分剥離細胞を収穫、検定を使用してセルをカウント、2 x 10 の⁵セルを新しい 15 mL の円錐管に転送のため 5% CO₂と 37 ° C で孵化させなさい。2 分間 250 × gで遠心し、上清を削除します。FDM1 の 1.5 mL の iPSC 由来線維芽細胞を再懸濁します、中和タイプ私コラーゲン溶液 (1:1)。
      注: は、優しく泡を避けるためにソリューションをミックスします。
   3. 6 ウェル マイクロ プレートの膜挿入を置いて、挿入に液を移し、室温で 30 分間インキュベートします。
      注: は、プレートを移動しないでください。
   4. ゲル化を確認した後挿入と、井戸の底に 3 mL のトップに培地 2 mL を追加します。5-7 日、ゲル化が完了するまで、もはや契約の線維芽細胞および 5% CO₂と 37 ° C でコラーゲンのマトリックスを孵化させなさい。
   5. 完全なゲル化後 (ステップ 1.3.6) から iPSC 由来ケラチノ サイトを分離 EDTA を使用します。EDTA の 1 つの mL を追加し、, 5% CO₂と 37 ° C で 2 分剥離細胞を収穫、診断、それらを数えるし、1 x 10 の⁶セルを新しい 15 mL の円錐管に転送。250 x gで 2 分間遠心します。
   6. 上澄みを除去し、低カルシウム上皮中 1 (EP1) の 50-100 μ L で 1 x 10 の⁶セルを再懸濁します。
   7. マトリックス内のすべての媒体を吸引 (手順 2.1.5 参照) とそれぞれの線維芽細胞層に iPSC 由来ケラチノ サイトの 1 x 10 の⁶セルの種子します。37 ° C で 30 分間 5% CO₂で板を孵化させなさい。
      注: プレートを移動しないし、ケラチノ サイトの添付ファイルを任意のメディアを追加しないでください。
   8. ドライブベイ カバーの上部と、井戸の底に EP1 の 3 mL に EP1 の 2 mL を追加します。
   9. 2 日後膜挿入プレートのすべての媒体を吸引し、2 日間通常カルシウム EP2 に媒体を変更します。
   10. 2 日後すべての媒体を吸引し、空気液体インターフェイスを生成する下にだけハツカネズミ中の 3 mL を追加します。
   11. 5% CO₂と 37 ° C で 14 日前までの 3 D 肌 organoid を維持し、一日おきに媒体を変更します。カバーの端を切断することによって 3 D 肌 organoid を収穫し、染色と皮膚移植のさらなる研究のために使用します。
2. 皮膚移植
   1. NOD/scid マウス (男性、6 週齢) の吸入麻酔を行う、標準的な制度的承認メソッドを使用します。皮膚移植の各マウスの皮膚の毛を剃る。
   2. 鉗子で曲線はさみを使用して、マウスの皮膚の 1 cm × 2 cm のセクションを削除します。
   3. 欠陥サイトとタイオーバー ドレッシング法を用いた絹糸縫合に CBMC iPSC 由来 3 D 肌 organoid を配置します。
   4. 2 週間のマウスを観察し、組織学的解析のためそれらに犠牲します。汚損のプロトコルが以前の研究¹⁶で確認されます。

結果

ほとんどの部分は、表皮と真皮の皮膚を構成します。ケラチノ サイトは、表皮の主要な細胞型と線維芽細胞は、真皮の主要な細胞のタイプ。表皮細胞分化のスキームを図 1に示します。CBMC iPCSc はビトロネクチン コーティング皿 (図 1B) に維持されました。本研究では EB 形成を利用した線維芽細胞とケラチノ サイトに CBMC ...

ディスカッション

人間の Ips は、パーソナライズされた再生医療¹⁷のための新しい選択肢として提案されています。患者由来のパーソナライズされた Ips は、疾患モデル作製、薬剤のスクリーニングおよび自家移植^18,19に使用することができます患者の特性を反映しています。患者由来の Ips の使用も一次電池、十分な細胞数, と免疫反応

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenine	Sigma	A2786	Component of differentiation medium for fibroblast
AggreWell Medium (EB formation medium)	STEMCELL	05893	EB formation
Anti-Fibronectin antibody	abcam	ab23750	Fibroblast marker
Anti-KRT14 antibody	abcam	ab7800	Keratinocyte marker
Anti-Loricrin antibody	abcam	ab85679	Stratum corneum marker
Anti-p63 antibody	abcam	ab124762	Keratinocyte marker
Anti-Vimentin antibody	Santa cruz	sc-7558	Fibroblast marker
BAND AID FLEXIBLE FABRIC	Johnson & Johnson	-	Bandage
Basement membrane matrix (Matrigel)	BD	354277	Component of differentiation medium for fibroblast
BLACK SILK suture	AILEEE	SK617	Skin graft
CaCl2	Sigma	C5670	Component of epithelial medium for 3D skin organoid
Collagen type I	BD	354236	3D skin organoid
Collagen type IV	Santa-cruz	sc-29010	Component of differentiation medium for keratinocyte
Defined keratinocyte-Serum Free Medium	Gibco	10744-019	Component of differentiation medium for keratinocyte
DMEM, high glucose	Gibco	11995065	Component of differentiation medium
DMEM/F12 Medium	Gibco	11330-032	Component of differentiation medium
Essential 8 medium	Gibco	A1517001	iPSC medium
FBS, Qualified	Corning	35-015-CV	Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte
Glutamax Supplement	Gibco	35050061	Component of differentiation medium for fibroblast
Insulin	Invtrogen	12585-014	Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte
Iris standard curved scissor	Professional	PC-02.10	Surgical instrument
Keratinocyte Serum Free Medium	Gibco	17005-042	Component of differentiation medium for keratinocyte
L-ascorbic acid 2-phosphata sesquimagnesium salt hydrate	Sigma	A8960	Component of differentiation medium for keratinocyte
MEM Non-Essential Amino Acid	Gibco	1140050	Component of differentiation medium for fibroblast
Meriam Forceps Thumb 16 cm	HIROSE	HC 2265-1	Surgical instrument
NOD.CB17-Prkdc SCID/J	The Jackson Laboratory	001303	Mice strain for skin graft
Petri dish 90 mm	Hyundai Micro	H10090	Plastic ware
Recombinant Human BMP-4	R&D	314-BP	Component of differentiation medium for keratinocyte
Recombinant human EGF protein	R&D	236-EG	Component of differentiation medium for keratinocyte
Retinoic acid	Sigma	R2625	Component of differentiation medium for keratinocyte
T/C Petridish 100 mm, 240/bx	TPP	93100	Plastic ware
Transferrin	Sigma	T3705	Component of epithelial medium for 3D skin organoid
Transwell-COL collagen-coated membrane inserts	Corning	CLS3492	Plastic ware for 3D skin organoid
Vitronectin	Life technologies	A14700	iPSC culture
Y-27632 Dihydrochloride	peprotech	1293823	iPSC culture