PiggyBac ベクターを用いたヒト誘導多能性幹細胞 (iPSCs) の機能的脊髄および頭蓋運動ニューロンへの変換

要約

このプロトコルは、誘導性 piggyBac ベクターからの転写因子を異所的に発現することによって、脊髄または頭蓋の同一性を有する運動ニューロンへの誘発多能性幹細胞の迅速かつ効率的な変換を可能にする。

要約

ここではヒト誘導多能性幹細胞 (iPSCs) から機能的脊髄および頭蓋運動ニューロンを得る方法について述べる。運動ニューロンへの直接変換は、転写因子、すなわち Ngn2、Isl1 および Lhx3 (NIL) または Ngn2、Isl1 および Phox2a (ニップ) の代替モジュールの異所性発現によって得られる。NIL およびニップは、それぞれ、脊髄および頭蓋運動ニューロン同一性を指定する。私たちのプロトコルは、piggyBac トランスポゾンベクターを介して、NIL またはニップがゲノム内に安定して統合される修飾 iPSC 線の生成から始まる。トランスジーンの発現は、その後、ドキシサイクリンおよびリードによって誘発され、5日で、iPSCs の MN 前駆細胞への転化に移行する。その後の成熟は、7日間、脊椎または頭蓋の MNs の均質な集団をもたらす。私たちの方法は、以前のプロトコルよりもいくつかの利点を保持します: それは非常に迅速かつ単純化されます。これは、ウイルス感染またはさらに MN 分離を必要としません;これは、アクション電位の列車を発射する能力によって示されるように、成熟の顕著な程度で異なる MN 亜集団 (脊髄および頭蓋) を生成することができます。さらに、混合集団から精製することなく多数の運動ニューロンを得ることができる。iPSC 由来の脊髄および頭蓋運動ニューロンは、筋萎縮性側索硬化症および運動ニューロンの他の神経変性疾患のインビトロモデリングに使用することができる。同種運動ニューロン集団は、細胞型特異的薬物スクリーニングのための重要な資源を表すかもしれない。

概要

運動ニューロン (MN) 変性は、筋萎縮性側索硬化症 (ALS) や脊髄筋萎縮 (SMA) などのヒト疾患において原因となる役割を果たしている。ヒト MN の複雑性を不在するインビトロ細胞モデルシステムを確立することは、新しい治療アプローチの開発に向けた重要なステップである。顕著な plurilineage 分化特性を授けられている誘導多能性幹細胞 (iPSCs) は、現在、運動ニューロン疾患^1,2によって影響を受ける多くの患者に由来している。MN 疾患に関連した病原性変異を運ぶ付加的な iPSC 線は、遺伝子編集によって生成されており、制御「健常な」多能性幹細胞³から始まる。これらの線は、インビトロ疾患モデリングおよび薬物スクリーニングのための有用なツールを表し、MNs への iPSC 分化のための適切な方法が利用可能であることを提供する。この方法の開発の背後にある理論的根拠は、成熟した機能 MNs を生み出す高速かつ効率的な分化プロトコルで MN 疾患に興味を持って科学的なコミュニティを提供することです。この方法の最初の利点は、実行の時間枠です。強度の別の関連するポイントは、任意の精製工程の排除から来ています。最後に、プロトコルは、運動ニューロンの2つの異なる集団を生成するために使用することができます。

MNs の異なるサブタイプを生成する可能性は、特に MN 疾患のモデル化に関連している。すべての MN 亜型は、ALS および SMA において同様に脆弱であり、異なる運動単位での症状の発症は、予後に大きく影響する。ALS において、上肢および下肢において始まる症状を伴う脊髄発症は、約3-5 年で死に至る⁴.逆に、球性発症は、頭蓋 MNs の変性から始まり、最悪の予後を有する。さらに、球性発症の割合は、SOD1 変異⁵を有する個体に比べて RNA 結合タンパク質 FUS および TDP-43 の突然変異を有する患者において有意に高い。代替 MN 分化プロトコールのほぼ全体は、レチノイン酸 (RA) の活性に依存しており、iPSCs^6、7、8の鑑別に脊髄特性を付与する。これは、特定の MN 亜型^9,10で保護することができる内因性因子を研究する可能性を制限します。

マウス胚性幹細胞¹¹における以前の作業と一致して、我々は最近、ヒトの iPSCs 異所の Ngn2、Isl1 および LHX3 (NIL) が脊髄 MN 同一性を誘導するのに、Ngn2 および Isl1 プラス PHOX2A(ニップ) を頭蓋 MNs を指定することを示した。従って私達はそれ故に12日の転換の機能特性と恵まれた人間の MNs の生産に導く有効な議定書を開発した。この方法の目的は、短時間で、精製を必要とせずに (例えば、FACS によって) 得ることであり、細胞集団は脊髄または頭蓋の同一性を有する MNs に対して高度に濃縮された。

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プロトコル

1. 人間の iPSCs の維持

1. マトリックスコーティングプレートの調製
   1. 4° c のマトリクス (材料の表を参照) の1つの 5 mL バイアルを一晩解凍します。元のマトリックス株は異なるストック濃度で来て、アリコートは個々のロットに特異的なデータシートに示された希釈倍率に従って作られる。マトリックスの早期ゲル化を防ぐためにバイアルとチューブの氷を冷たく保つことが重要です。氷の前に冷やされた cryotubes のアリコートにマトリックスを分配しなさい。-20 ° c で未使用のアリコートを凍らせます。
   2. 1つのアリコートを氷上で約2時間、解凍します。
   3. 50 mL の円錐形の管の冷たい DMEM/F12 の20の mL が付いているマトリックスのアリコートを希釈しなさい。
   4. よく混ぜて 35 mm の皿 (他の料理の表面積ごとの同等の量) に希釈されたマトリックスの 1 mL を分配してください。
   5. 1時間室温で希釈したマトリックスを含む食器を使用して、コーティングを可能にします。
      注:パラフィルムで密封された皿は、2週間まで4° c で貯えることができる。
2. 原液の調製 (20 mL) と、穏やかな細胞解離試薬の1x 作業アリコート(資料表参照)。
   1. 粉末を PBS 中で 10mg/mL に溶解させます (Ca2⁺/Mg⁺ free)。
   2. 0.22 μ m フィルター膜を通してフィルター消毒。
   3. 20個のアリコート (それぞれ 1ml) を用意し、-20 ° c で保管してください。
   4. 使用前に、PBS (Ca2⁺/Mg^{2 +} free) の1アリコートを 1 Mg/mL (1x 作業アリコート) に希釈してください。
      注: 1x 作業アリコートは、2週間まで4° c で保存することができます。
3. 継代人間の iPSCs。
   1. 開始前: 4 ° c で保存する場合、37° c のインキュベーター内で20-30 分間の前温マトリックスコーティングされたプレートを室温で予熱する必要がありましたヒト iPSC 培地 (材料の表を参照) の量。DMEM/F12 を予温する。
   2. 培養液を吸引する。
   3. PBS (Ca^{2 +}/Mg^{2 +} free) で iPSCs をすすぎます。
   4. 1x ジェントル解離溶液 (35 mm ディッシュに 0.5 mL) を加えます。コロニーの端がプレートから剥離し始めるまで37° c でインキュベート, 通常3-5 分.
   5. 穏やかな解離溶液を吸引し、iPSC コロニーを分離しないように注意する。
   6. 細胞を DMEM/F12 (35 mm ディッシュで 2ml) で洗浄し、細胞を切断しないように注意して吸引します。この手順をもう一度繰り返します。
   7. ヒト iPSC 培地 (35 mm ディッシュに 1ml) を加えます。
   8. 細胞リフターでコロニーを静かに切り離し、15 mL のチューブに移します。
   9. P1000 pipettor 3-4 回で、セルの束をゆっくりとピペットで押して、静かに切断します。
   10. マトリックスコーティングされたプレートから上清を吸引する (s)。
   11. ヒト iPSC 培地の適切な培養容積中に細胞を播種する。スプリット比は、行ごとに異なることができ、約1:4-1:8 です。メディアを毎日変更します。

2. NIL およびニップ誘導性 iPSC 線の生成

1. 細胞トランスフェクション。
   1. PBS (Ca2⁺/Mg⁺ free) で細胞をすすいでください。
   2. 細胞解離試薬 (材料の表を参照) を加え (35 mm ディッシュは 0.35 mL)、単一の細胞が分離されるまで37° c でインキュベートします (5-10 min)。
   3. P1000 pipettor 3-4 回で、上下にピペッティングして細胞の分離を静かに完了します。
   4. 15 mL チューブで収集し、PBS (Ca2⁺/Mg^{2 +} free) を10ml に添加します。セルをカウントします。
   5. ペレット 10⁶細胞および再懸濁は、100μ l のバッファ R (エレクトロポレーションキットの細胞に含まれる、材料の表を参照)。
   6. トランスフェクションのためのプラスミド DNA を追加します: 転移因子ベクターの4.5 μ g (epB-Bsd-TT-NIL または epB-Bsd-TT-NIP¹²) および piggyBac トランスポゼースプラスミド¹³の0.5 μ g。
   7. トランスフェクトは、製造元の指示に従ってセルのエレクトロポレーションシステム (資料の表を参照) を使用し、前述の^{3 つ}のパラメータを使用して、1200 V 電圧、30 ms 幅、1パルスを示します。ヒト iPSC 培地中に細胞を播種し、6 mm マトリックスコーティングされた皿に10μ m Y-27632 (岩石阻害剤、材料表を参照) を添加した。
2. 抗生物質による選択。
   1. トランスフェクションの2日後に、培養培地に5μ g/mL ブラスチシジンを加えます。
   2. 非トランスフェクトされた細胞のほとんどは、ブラスチシジン選択の 48 h 以内に死亡する。ゲノム中のトランスジーンを統合していない細胞をブラスチシジンに、少なくとも7-10 日間細胞を再選択するようにしてください。
   3. 混合集団として安定的にトランスフェクトされた細胞を維持し、異なる数のトランスジーンおよび異なる集積部位を有する細胞から構成される、または単一クローンを単離する。
   4. Ngn2 (フォワード: TATGCACCTCACCTCCCCATAG のためのトランスジーン特異的プライマーを用いた RT-PCR により、1μ g/mL のドキシサイクリン誘導時にトランスジーンの効果的な発現をチェックする追加の皿を準備します。逆: GAAGGGAGGAGGGCTCGACT)、前述したように¹².
   5. この段階では、ヒト iPSCs のための凍結培地において新規の NIL-およびニップ− iPSC 線のストックを凍結する (材料の表を参照)。

3. 運動ニューロン分化

1. 細胞を解離試薬の細胞と分離して説明する (手順 2.1.1.-2.1.3.)。15 mL チューブで細胞を解離させると、5倍量の DMEM/F12 で希釈します。ペレット細胞および再懸濁をヒト iPSC 培地中で、10μ m の ROCK 阻害剤を添加した。62500細胞/cm2 の密度でマトリックスコーティングされた皿の細胞そして種を数える。
2. その翌日、培地を DMEM/F12 と交換し、1個の安定した L-グルタミンアナログ、1x の非必須アミノ酸 (NEAA) 細胞培養サプリメントおよび 0.5 x ペニシリン/ストレプトマイシンを添加して、3μ g/mL のドキシサイクリンを含む。これは、分化の0日目とみなされます。1日目に、培地とドキシサイクリンをリフレッシュします。
3. 2日目に、培地を Neurobasal/B27 培地に変更し (Neurobasal 培地に 1x B27、1x 安定 L-グルタミンアナログ、1x NEAA、0.5 x ペニシリン/ストレプトマイシン) を添加し、5μ m DAPT、4μ m SU5402 および1μ g/mL のドキシサイクリンを含む (資料表参照).5日目まで毎日の培地とドキシサイクリンをリフレッシュ。
4. 5 日目: 細胞解離試薬による解離(資料表参照)。
   1. PBS (Ca2⁺/Mg⁺ free) で細胞をすすいでください。
   2. 細胞解離試薬 (35 mm ディッシュは 0.35 mL) を加え、細胞単層全体がディッシュから分離するまで37° c でインキュベートします。単一の細胞はインキュベーションの間に分離されないことに注意してください。
   3. 1ml/F12 の 1 mL を追加し、15 mL のチューブで細胞を収集します。.
   4. P1000 pipettor 10-15 回で、上下にピペッティングして細胞の分離を静かに完了します。
   5. 4 mL の DMEM/F12 を加え、細胞を数える。
   6. この段階では、凍結運動ニューロンは、製造業者の指示に従って、細胞凍結培地で前駆細胞 (材料の表を参照)。
   7. ペレットを神経媒体中の細胞および再懸濁 (Neurobasal/B27 培地に添加した 20 ng/mL の BDNF、10 ng/mL の GDNF および 200 ng/ml の L-アスコルビン酸、10μ m ROCK 阻害剤を添加した材料の表を参照のこと)。
   8. ポリオルニチン/ラミニン上の細胞をシード-または10万細胞/cm2 の密度でマトリックスコーティング支持体。免疫染色の分析のためにポリマーカバースリップ (材料の表を参照) とのμ-スライドのプラスチックサポートを使用しなさい。
5. 6日目に、ROCK 阻害剤を欠く新鮮な神経媒体で培地を変更する。次の日には、メディアの半分を3日ごとに更新します。培養媒体は、表面からの剥離を防ぐために、非常に慎重に変更する必要があります。

4. 免疫染色分析

1. 細胞固定。PBS で細胞をすすぎ (Ca2⁺/Mg +)、室温で pbs 中の 4% パラホルムアルデヒド (ca2⁺/Mg^{2 +}) で15分間インキュベートします。
   注意:パラホルムアルデヒドは有毒であり、癌を引き起こす可能性が疑われる。皮膚や目との接触を避け、化学ヒュームフードの下で取り扱います。
2. 室温で5分 0.1% のトリトン X-100 を含んでいる PBS (Ca2⁺/Mg^{2 +}と) の透過処理。
3. 抗体ブロッキング溶液 (ABS: PBS 中の 3% BSA で Ca^{2 +}/Mg^{2 +}) で30分間インキュベートします。
4. ABS の一次抗体を用いて室温で1時間インキュベートする: 抗 TUJ1 (1:1000; ウサギ) および抗 Oct4 (1:200; マウス) またはアンチ・チャット (抗コリンアセチルトランスフェラーゼ; 1:150; ヤギ)。資料の表を参照してください。
5. 適切なロバを使用して室温で45分インキュベートしてください。 ABS では、抗マウス alexa fluor 647 (1:250)、抗ウサギ594アレクサ fluor (1:250)、抗ヤギアレクサ fluor 488 (1:250)。資料の表を参照してください。
6. 室温で5分間0.4 μ g/mL DAPI でインキュベートし、核にラベルを付けます。
7. 蛍光顕微鏡で撮像するための埋込媒体 (材料表参照) で細胞をマウントします。

5. パッチクランプによる機能評価

1. HEPES 平衡型外部溶液 (NE) を次のように準備します: 140 mM NaCl、2.8 mM KCl、2 mM CaCl₂、2 mm MgCl₂、10 mm HEPES、および 10 mm グルコース。290-300 m ωの間のオスモル濃度を設定します。1N NaOH を使用して pH を7.3 に調整し、溶液を4° c で保存します。
2. 内部溶液を準備する: 140 mM K-グルコン酸塩、2mm NaCl、5mm BAPTA、2mm MgCl₂、10ミリメートル HEPES、2ミリメートル MG-ATP、0.3 mm NA-GTP。PH を1M の KOH で7.3 に調整し、オスモル濃度が約 290 m ωに設定されていることを確認します。溶液を-20 ° c で小さなアリコートで凍らせる。
3. 実験を実行する前に、約28-30 ° c の水浴中で NES 溶液を予温する。
4. ホウケイ酸 micropipettes (ID 0.86 mm を引っ張ってください。先端の抵抗を支える OD 1.5 mm): 5-6 m ωおよびピペットのホールダーに取付ける前に細胞内の解決を満たしなさい。
   注:配線表面に AgCl の均一な層を形成するためには少なくとも30分間漂白剤中の記録電極と参照電極の塩化銀ワイヤーに注意してください。
5. 記録室にペトリ皿を移し、1-2 mL/min の NES の解決の部屋をしなさい。溶液を暖かく保つために、30° c の温度に設定されたインラインヒーターを通過する流れをしてみましょう。
6. 電気生理学的記録室を直立顕微鏡で配置する。パッチクランプアンプで膜電流を記録し、適切なソフトウェアでデータを集録します。
7. アンプ制御ソフトウェアを開き、値1の信号ゲインと 10 kHz のベッセルフィルタを設定します。ベッセルフィルタがサンプリング周波数よりも2.5 倍低いことを確認します。
8. 記録ソフトウェアの電圧クランプおよび電流クランプ実験のための実験プロトコルを設定します。
9. プロトコル設定では、エピソード刺激モードをチェックし、25 kHz でサンプリング周波数を設定します。次に、[波形] タブに移動し、次のように電圧または現在のステップの振幅と長さを入力します。
10. 電位依存性ナトリウム電流の場合、15個の電圧ステップ (それぞれ 50 ms 持続時間) を-100 mV から + 40 mV (10 mV インクリメント) で使用します。パッチを適用したセルに、アンプを通して-60 mV の保持電位を課すと、プロトコルを実行します。同様に、電圧依存性カリウム電流は、記録されたセルを-40 mV に保持する-30 mV から + 50 mV (10 mV インクリメント) までの電圧ステップ (それぞれ 250 ms 持続時間) によって誘発します。
11. IPSC 派生頭蓋および脊髄 MNs の発火特性を調べるために、クランプ細胞を、電流クランプモードで、膜電位で-70 mV と (+ 20 pA から + 80 pA; 20 pA インクリメント) の増加振幅の4現在のパルス (1 秒の持続時間) を使用します。
12. 各セル電圧活性化電流、誘発焼成活性、および全細胞容量 (Cm) としての3つの受動特性、細胞膜抵抗 (Rm) および静止膜電位 (RMP) を取得します。

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結果

この分化方法の概略説明を図 1に示す。ヒト iPSCs (WT I ライン³) は、EpB-BSD-TT-NIL または EpB-BSD-TT-ニップを用いてトランスフェクトし、ブラスチシジン選択に際して、安定かつ誘導的な細胞株¹²を、それぞれ iPSC-NIL および iPSC-ニップと称する。分化細胞は、多能性マーカー OCT4 と汎神経マーカー TUJ1 の発現について特徴付けられた。免疫?...

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ディスカッション

このプロトコルは、系統特異的転写因子の異所性発現のおかげで、ヒト iPSCs を脊髄および頭蓋運動ニューロンに効率的に変換することを可能にする。これらのトランスジーンはドキシサイクリンによって誘導され、piggyBac のトランスポゾンベースのベクターのおかげでゲノムに安定的に組み込まれる。混合集団では、piggyBac ベクターの1つまたは複数のコピーが個々の細胞のゲノムにランダ?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Bapta	Sigma-Aldrich	A4926-1G	chemicals for electrophysiological solutions
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	Cell dissociation reagent
anti-CHAT	EMD Millipore	AB144P	Anti-Choline Acetyltransferase. Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_2079751; Lot number: 2971003
anti-goat Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A11055	Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_2534102; Lot number: 1915848
anti-mouse Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A31571	Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_162542; Lot number: 1757130
anti-Oct4	BD Biosciences	611202	Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_398736; Lot number: 5233722
anti-Phox2b	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-376997	Primary antibody used in immunostaining assays. Lot number: E0117
anti-rabbit Alexa Fluor 594	Immunological Sciences	IS-20152-1	Secondary antibody used for immonofluorescence assays
anti-TUJ1	Sigma-Aldrich	T2200	Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_262133
B27	Miltenyi Biotec	130-093-566	Serum free supplement for neuronal cell maintenance
Bambanker	Nippon Genetics	NGE-BB02	Cell freezing medium, used here for motor neuron progenitors
BDNF	PreproTech	450-02	Brain-Derived Neurotrophic Factor
Blasticidin	Sigma-Aldrich	203350	Nucleoside antibiotic that inhibits protein synthesis in prokaryotes and eukaryotes
BSA	Sigma-Aldrich	A2153	Bovine Serum Albumin. Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3881	chemicals for electrophysiological solutions
Clampex 10 software	Molecular Devices	Clampex 10	Membrane currents recording system
Corning Matrigel hESC-qualified Matrix	Corning	354277	Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports
CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA	Biological Industries	05-710-1E	Freezing medium for human iPSCs
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G5146	chemicals for electrophysiological solutions
DAPI powder	Roche	10236276001	4′,6-diamidino-2-phenylindole. Fluorescent stain that binds to adenine–thymine rich regions in DNA used for nuclei staining in immonofluorescence assays
DAPT	AdipoGen	AG-CR1-0016-M005	Gamma secretase inhibitor
Dispase	Gibco	17105-041	Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D6421-500ML	Basal medium for cell culture
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D9891-1G	Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors
DS2U	WiCell	UWWC1-DS2U	Commercial human iPSC line
E.Z.N.A Total RNA Kit	Omega bio-tek	R6834-02	Kit for total extraction of RNA from cultured eukaryotic cells
GDNF	PreproTech	450-10	Glial-Derived Neurotrophic Factor
Gibco Episomal hiPSC Line	Thermo Fisher Scientific	A18945	Commercial human iPSC line
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050038	An alternative to L-glutamine with increased stability. Improves cell health.
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	chemicals for electrophysiological solutions
iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR	Bio-Rad	1708841	Kit for gene expression analysis using real-time qPCR
iTaqTM Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121	Ready-to-use reaction master mix optimized for dye-based quantitative PCR (qPCR) on any real-time PCR instrument
K-Gluconate	Sigma-Aldrich	G4500	chemicals for electrophysiological solutions
KCl	Sigma-Aldrich	P9333	chemicals for electrophysiological solutions
L-ascorbic acid	LKT Laboratories	A7210	Used in cell culture as an antioxidant
Laminin	Sigma-Aldrich	11243217001	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Laser scanning confocal microscope	Olympus	iX83 FluoView1200	Confocal microscope for acquisition of immunostaining images
Mg-ATP	Sigma-Aldrich	A9187	chemicals for electrophysiological solutions
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	chemicals for electrophysiological solutions
Mounting Medium	Ibidi	50001	Mounting solution used for confocal microscopy and immunofluorescence assays
Multiclamp patch-clamp amplifier	Molecular Devices	700B	Membrane currents recording system
Na-GTP	Sigma-Aldrich	G8877	chemicals for electrophysiological solutions
NaCl	Sigma-Aldrich	71376	chemicals for electrophysiological solutions
NEAA	Thermo Fisher Scientific	11140035	Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability.
Neon 100 μL Kit	Thermo Fisher Scientific	MPK10096	Cell electroporation kit
Neon Transfection System	Thermo Fisher Scientific	MPK5000	Cell electroporation system
Neurobasal Medium	Thermo Fisher Scientific	21103049	Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer
NutriStem-XF/FF	Biological Industries	05-100-1A	Human iPSC culture medium
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	157-8	Used for cell fixation in immunostaining assays
PBS	Sigma-Aldrich	D8662-500ML	Dulbecco's Phosphate Buffer Saline, with Calcium, with Magnesium
PBS Ca2+/Mg2+ free	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Dulbecco's Phosphate Buffer Saline, w/o Calcium, w/o Magnesium
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333-100ML	Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria.
poly-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
SU5402	Sigma-Aldrich	SML0443-5MG	Selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2)
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether. Used for cell permeabilization in immunostaining assays
Upright microscope	Olympus	BX51VI	Microscope for electrophysiological recording equipped with CoolSnap Myo camera
Y-27632  (ROCK inhibitor)	Enzo Life Sciences	ALX-270-333-M005	Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival
μ-Slide 8 Well	Ibidi	80826	Support for high–end microscopic analysis of fixed cells