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要約

この研究は、実験室条件下で米を食べているシロオオバコに対する非好性を評価するための簡単で実行可能な方法を提示します。シロハラオオバコと茶色のオオバコに対する抵抗性を特定する現在の方法の戦略と構成の改善について説明します。

要約

昆虫抵抗性イネの生殖形質資源と関連遺伝子を利用することは、昆虫抵抗性品種を育種するための主要なニーズですが、イネの昆虫抵抗性表現型の同定の精度は大きな困難です。イネの耐虫性をスクリーニングするための新しい方法の開発や既存の方法の改善が急務です。この記事では、実験室でシロオオバコ(WBPH)である Sogatella furciferaに対するイネの非優先型耐性を評価するための簡単で実行可能な方法について説明します。成熟したイネを摂食する、または成熟したイネに生息する成体のWBPHの選好性は、ペアワイズ比較によって連続的に分析されます。イネにおけるWBPHの動的変化を記録し、耐性同定の指標として比較します。現在の方法は、操作が簡単で観察しやすく、サイクルが短いです。この方法の使用は、茶色のオオバコ(BPH)、 Nilaparvata lugens(Stål)などの類似の半翅目(phyphyterans)の摂食と産卵の好みを調査するために拡張することができます。

概要

米は世界人口の3分の1以上が主食であり、米の90%以上がアジアで生産・消費されています1,2。WBPHとBPHは、イネの最も破壊的な害虫であり、コメ生産に対する大きな脅威です3。コストと環境の観点から、昆虫抵抗性イネの育種と施用は、オオバコによる被害を制御するための最も効果的なアプローチです4,5,6。したがって、抵抗性イネの生殖形質資源のスクリーニングは、昆虫抵抗性イネを育種するための重要な前提条件です。イネ抵抗性の表現型を同定する精度は、標的遺伝子の微細なマッピングやさらなる機能研究に役立ちます。しかし、表現型の同定は、抵抗メカニズムの複雑さのために大きな困難となっています。イネの害虫に対する抵抗性は、抗菌薬、耐性、非好性7の3つのタイプに分けることができます。各タイプは、害虫に対するイネの抵抗メカニズムの異なる側面を反映しています。現在、オオバコに対する抵抗性をスクリーニングするために最も広く使用されている方法は、多数のイネの表現型抵抗性を迅速に特定し、短時間で候補の耐性生殖細胞株を得るために使用できる標準的なシードボックススクリーニング技術(SSST)である8。

しかし、SSST法は苗の段階でのイネの抵抗性を反映しているだけであり、耐性型の抵抗メカニズムの評価にはより効果的です。イネの昆虫に対する抵抗性は、幼虫の生存率、幼虫の持続時間、卵の孵化率などの抗生物質や、生息地、摂食、産卵選好などの非嗜好にも反映されます9。さらに、抵抗性に対するイネの苗の性能は、しばしばあまり安定していません。植物の成長とともに、抵抗力はより安定する傾向があります。したがって、SSST法は米の抵抗レベルを完全に反映することはできません。さらに、イネの害虫に対する抵抗性は成長段階によって異なり、苗と成熟する植物の間では抵抗メカニズムに明らかな違いがあります。研究によると、成熟したイネは、害虫による侵入を避けるために揮発性の二次代謝産物を放出する可能性があり、これはイネ10,11の摂食または産卵における昆虫の非選択性によって現れます。これも非常に重要な抵抗メカニズムであり、害虫の予防や成熟時の米の収量確保に重要な役割を果たしています。

現在、非選好による米の抵抗性の特定は依然として課題です。この場合、現在、主に 2 つのアプローチが使用されています。一方では、オオバコとイネは正方形のナイロンネットケージ12に入れられます。このアプローチは、複数のイネ系統で同時に実験を行うには比較的効率的であると考えられていますが、より大きな実験スペースを必要とするため、不透明なナイロンネット材料のために観察とカウントにいくつかの困難を引き起こします。一方、昆虫選抜実験では、米から放出される揮発性物質の違いによりY字管嗅覚計法が用いられます。この方法は、ガラス容器14のため、観察が容易である。この方法の主な制限要因の1つは、揮発性の臭いしか判断できないことと、実験装置の気密性に厳しい要件があり、時間がかかることです。

ここでは、イネのWBPHに対する非優先型耐性を評価するための改良された方法について説明し、これは操作が簡単で観察が容易です。この方法は、BPHやその他の半翅目の害虫の生息地、摂食、および産卵選好行動の研究にも使用できます。

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プロトコル

1.オオバコ、イネ、ポリ塩化ビニルケージの調製

  1. オオバコ
    1. Taichung Native 1(TN1)と呼ばれる感受性の高いイネ品種の分げつにWBPHを防虫ケージで飼育し、何世代にもわたって自然に繁殖させます。さらなる実験のために、翼の長い、新しく出現した女性の成虫を選びます。
      注:WBPHは、中国農業科学院深センの農業ゲノミクス研究所から提供されました。
  2. 水稲
    1. 各米の種子を水に浸し、28°C、相対湿度(RH)75%〜80%、発芽まで2日間、14時間の明るい/10時間の暗いサイクルに設定されたパラメーターを使用して、温度調節された部屋に入れます。
    2. 試験した各イネ系統の発芽種子30個を、水田で満たされたプラスチック製の苗箱(長さ20 cm x 幅 15 cm x 幅 x 10 cm [高さ])に均等に播種します。
    3. 種子を細かい乾燥した土の薄い層で覆います。次に、乾燥した土壌を水で濡らします。
    4. シードボックスを28°Cで200メッシュの防虫ケージ(75 cm [長さ] x 75 cm [幅] x 75 cm [高さ])に入れ、75%〜80%RHで、温度管理された部屋で14時間の明るい/ 10時間の暗いサイクル処理を行います。土壌を湿らせておくために毎日水をやります。植物が2〜3枚の葉の段階に達するまで、7日間植物を育て続けます。
    5. 同様の成長可能性を持つ20本の苗木を選び、底に穴が開いた直径10cmのプラスチック製シードポット(ポットごとに1本の苗)に苗を移植します。
    6. ポットを28°C、75%-80%RH、14時間の光/10時間の暗サイクル処理で、トレイの底に水を入れた温度制御された部屋で、200メッシュの防虫ケージ(長さ75cm×幅×幅×75cm高さ)に入れ、1つまたは2つの分げつで分げつステージに達するまで約30日間成長させます。
    7. 実験を開始する前に、稲を1つの分げつにトリミングします 48時間。
  3. 円筒形ポリ塩化ビニルケージ
    1. 寸法が120 cm x 90 cm、厚さが0.5 mmの透明なポリ塩化ビニル(PVC)を取得します。
    2. 高さ90cm、直径35cmの円筒形の構造物にします。
    3. ホッチキスを使用して、シリンダーの両端のオーバーラップ領域を固定します。オーバーラップ領域が長さ約90cm、幅10cmであることを確認してください。
    4. シリンダーの周囲からオーバーラップ領域全体を感圧テープでシールします。
      注意: 円筒形のケージを地面に対して垂直に配置でき、ケージと地面の間に明らかな隙間がないことを確認してください。
    5. 200メッシュのナイロンネットをカットし、それぞれ50 cm x 50 cmの寸法があります。後続の手順のために十分な準備をします。
    6. 適切な輪ゴムを入手してください。バンドを収縮させたときの直径は約1.5mm、円周は少なくとも32cmであることを確認してください。

2.昆虫と米の処理

  1. 直径28cm、高さ10cmの丸いプラスチックトレイを、ステップ1.2.6で説明されているパラメーター設定を使用して、温度制御された部屋の平らなコンクリートの地面に置きます。
    注意: 温室の床が土の場合は、トレイが平らに置かれていることを確認するために、できるだけ平らな面を見つけてください。
  2. (ステップ1.2.7から)異なる米のラインの2つのポットを選択し、それらを並べてトレイに入れ、プラスチックトレイに十分な水を入れます。
  3. 2つのテストライスポットを、手順1.3.4で作成した円筒形のケージで覆います。
  4. ケージの上にナイロンネット(手順1.3.5)を1枚置きます。
    注:ケージ内の2つのライスポットはグループとして使用できます。各グループを15セット繰り返します。鉢をランダムな位置と方向に置きますが、2つの稲の葉が触れないようにしてください。
  5. 手作りの吸引トラップを使用して、新たに出現した40匹の女性のWBPH成虫を収集します(セクション1.1を参照)。
  6. WBPHの成虫をガラス管(直径2cm、高さ15cm)に入れ、スポンジストッパーで覆います。
  7. ナイロンネットの角を持ち上げます(手順2.4を参照)。
  8. ガラス管からスポンジストッパーを取り外し、チューブをケージの中央部に置いて、すべてのWBPHを放出します。
  9. ナイロンネットをすばやく覆い、輪ゴムを使用して密封し、WBPHが逃げないようにします(図1)。

3. 記録・観察

  1. 蔓延後3、6、24、48、72、96、および120時間後の各イネのWBPHの分布を観察します。
  2. 透明なケージを通じて、葉の鞘や葉のすべての方向からの葉を含むさまざまなイネ植物のWBPHの数を記録します。
    注:観察過程では、WBPHを乱さないように穏やかにしてください。

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結果

この研究では、3つのテストイネラインが使用されました。イネ系統FY01はWBPHの影響を受けやすく、対照群として使用されます。イネ株HZ08およびHZ06は、FY01の背景に基づき、潜在的なWBPH耐性X1遺伝子およびX5遺伝子をそれぞれ導入したトランスジェニック株である。したがって、HZ08/HZ06とFY01のイネ抵抗性の比較により、対応する挿入遺伝子が潜...

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ディスカッション

成熟したイネ植物は、揮発性の二次代謝産物を放出して害虫を制御したり、葉鞘表面の特殊な物理的構造を介してこれらの害虫(WBPHなど)の交配能力を低下させたりします。これは主要な抵抗メカニズムです13。イネでは、非選好は摂食だけでなく、生息地や交配にも関連しています。しかし、現在の研究では、幼虫の非選好性4,...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

著者らは、シロオオバコに餌を与え、米を栽培してくれたラン・ヤン博士に感謝しています。この作業は、深セン市大鵬新区の産業開発のための特別基金(助成金番号。KY20180216およびKY20180115)。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
climate-controlled roomNingbo Jiangnan Instrument FactorySZJYS2013temperature, relative humidity, photoperiod control
glass tube with sponge stopper//diameter 2 cm and height 15 cm
handmade suction trap///
insect-proof cage //200-mesh, (L × W × H, 75 × 75 × 75 cm)
Nylon net//200 mesh
paddy soil///
plastic seed box // (L × W × H, 20 × 15 × 10 cm)
plastic seed pot//10-cm-diameter
plastic tray// (D × H, 28  × 10 cm)
rice seed of FY01 line//60 seeds
rice seed of HZ06 line//30 seeds
rice seed of HZ08 line//30 seeds
rice seed of TN1 variety//many
Rubber band//diameter is 1.5 mm, and the circumference is 32 cm
scotch tape///
SPSS Statistics 19.0IBM Corporation/statistical data analysis
stapler///
transparent PVC //120 cm × 90 cm dimensions and thickness of 0.5 mm

参考文献

  1. Du, B., et al. Identification and characterization of Bph14, a gene conferring resistance to brown planthopper in rice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. , (2009).
  2. Khush, G. S. Strategies for increasing the yield potential of cereals: case of rice as an example. Plant Breeding. 132 (5), 433-436 (2013).
  3. Heong, K. L., Hardy, B. Breeding for resistance to planthoppers in rice. Planthoppers: New Threats to the Sustainability of Intensive Rice Production Systems in Asia. , International Rice Research Institute, Asian Development Bank, Australian Government, Australian Centre for International Agricultural Research . 401-409 (2009).
  4. Han, Y., Wu, C., Yang, L., Zhang, D., Xiao, Y. Resistance to Nilaparvata lugens in rice lines introgressed with the resistance genes Bph14 and Bph15 and related resistance types. PLoS One. 13 (6), e0198630(2018).
  5. Arora, R., Sandhu, S. Advances in Breeding for Resistance to Hoppers in Rice. Breeding Insect Resistant Crops for Sustainable Agriculture. , Springer. Singapore. 101-130 (2017).
  6. Sarao, P. S., et al. Donors for resistance to brown planthopper Nilaparvata lugens (Stål) from wild rice species. Rice Science. 23 (4), 219-224 (2016).
  7. Horgan, F. Mechanisms of resistance: a major gap in understanding planthopper-rice interactions. Planthoppers: New Threats to the Sustainability of Intensive Rice Production Systems in Asia. Heong, K. L., Hardy, B. , International Rice Research Institute, Asian Development Bank, Australian Government, Australian Centre for International Agricultural Research. 281-302 (2009).
  8. He, J., et al. High-resolution mapping of brown planthopper (BPH) resistance gene Bph27 (t) in rice (Oryza sativa L). Molecular Breeding. 31 (3), 549-557 (2013).
  9. Ling, Y., Weilin, Z. Genetic and biochemical mechanisms of rice resistance to planthopper. Plant Cell Reports. 35 (8), 1559-1572 (2016).
  10. Qi, J., et al. The chloroplast-localized phospholipases D α4 and α5 regulate herbivore-induced direct and indirect defenses in rice. Plant Physiology. , 111(2011).
  11. Qiu, Y., Guo, J., Jing, S., Zhu, L., He, G. High-resolution mapping of the brown planthopper resistance gene Bph6 in rice and characterizing its resistance in the 9311 and Nipponbare near isogenic backgrounds. Theoretical and Applied Genetics. 121 (8), 1601-1611 (2010).
  12. Liu, Y., et al. A gene cluster encoding lectin receptor kinases confers broad-spectrum and durable insect resistance in rice. Nature Biotechnology. 33 (3), 301(2015).
  13. Lou, Y., et al. Differences in induced volatile emissions among rice varieties result in differential attraction and parasitism of Nilaparvata lugens eggs by the parasitoid Anagrus nilaparvatae in the field. Journal of Chemical Ecology. 32 (11), 2375(2006).
  14. Da Silva, A. G., et al. Non-preference for oviposition and antibiosis in bean cultivars to Bemisia tabaci biotype B (Hemiptera: Aleyrodidae). Revista Colombiana de Entomologia. 40 (1), 7-14 (2014).

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