アンジオテンシンIIによるニトロペプチドプロファイリングと同定

要約

チロシン硝化タンパク質のプロテオミックプロファイリングは、3-ニトロチロシン修飾の低い存在性のために挑戦的な技術であった。ここでは、アンジオテンシンIIをモデルにしたニトロペプチド濃縮とプロファイリングに対する新しいアプローチについて述べた。この方法は、他のインビトロまたはインビボシステムに拡張することができます。

要約

タンパク質硝化は、チロシン残基に対する最も重要な翻訳後修飾(PTM)の1つであり、真核細胞における活性酸素種(ROS)および反応性窒素種(RNS)の化学作用によって誘導されうる。タンパク質上の硝化部位の正確な同定は、炎症、老化、癌などのタンパク質硝化に関連する生理学的および病理学的プロセスを理解するために重要です。硝化タンパク質は、誘導条件下でも細胞内の存在量が少ないため、タンパク質硝化部位のプロファイリングと同定のための普遍的かつ効率的な方法は開発されていません。ここでは、化学還元反応とビオチン標識を用いてニトロペプチド濃縮のためのプロトコルを説明し、続いて高分解能質量分析を行う。我々の方法では、ニトロペプチド誘導体を高精度で同定することができる。我々の方法は、以前に報告された方法と比較して2つの利点を示す。まず、ジメチル標識は、ニトロペプチド上の一次アミンをブロックするために使用され、定量的な結果を生成するために使用することができます。第二に、NHS-ビオチン試薬を含むジスルフィド結合が濃縮に使用され、質量分析計上の検出信号を増強するためにさらに低減およびアルキル化することができる。このプロトコルは、現在の論文においてモデルペプチドアンジオテンシンIIに正常に適用されている。

概要

3-ニトロチロシンを形成するタンパク質中のチロシン残化の硝化は、多くの生物学的プロセスを調節する。チロシンと3-ニトロチロシンの間の異なる化学的特性のために、硝化されたタンパク質はシグナル伝達活性1、2を乱暴にしてもよい。そのため、タンパク質上の硝化部位を効率的に濃縮・同定できる方法を開発することが重要です。3-ニトロチロシンは、リン酸化やアセチル化などの他の形態のPTMと比較してタンパク質に対する豊富な修飾が低いため、細胞株や組織サンプルから直接内因性の硝化部位を同定することは困難です。それにもかかわらず、ニトロペプチドの断片化パターンを特徴付けるために質量分析(MS)を用いた方法論(例えば、Zhan & Desiderio 3)が開発され、これはニトロプロテオミクスの新しい方法の基礎を築く。

現在、MSに続く濃縮ステップは、ニトロペプチドプロファイリング4、5のための最も強力な戦略です。エンリッチメント メソッドは、2 つのクラスに分類できます。1つのクラスは、3-ニトロチロシンを特異的に認識できる抗体に基づいており、他のクラスは、アミン基4、5にニトロ基を減少させる化学誘導法に基づいている。抗体ベースの方法では、ニトロチロシン親和性カラムが濃縮に使用され、そこから、解離された材料がさらに高分解能MS6、7によって分解および分析される。化学誘導ベースの方法では、ペプチドまたはリジンのN終位におけるアミン基は、アセチル化、相対および絶対定量のための同位体タグ(iTRAQ)、またはタンデム質量タグ(TMT)試薬のいずれかによって最初のステップでブロックされるべきである。次に、ミトロチロシンをアミノチロシンに還元し、続いて新たに形成されたアミン群を改変するためにリデューサを使用し、ビオチンライゲーション、スルフィドリルペプチド変換、または他のタイプのタグ付けシステム8、9、^{および 10、11}.これまでに確立されたプロトコルのほとんどは、内因性硝化タンパク質の代わりに、インビトロの過剰硝化タンパク質に基づいています。

本研究では、ニトロチロシンの化学誘導法の改変手順を、MS検出時の感度向上を示し、定量化目的に適したニトロペプチド濃縮および同定のために開発される。この手法を生物系に用いた最近の研究では、骨髄系抑制細胞(MDSC)から産生されるRNSによるTyr394におけるリンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(LCK)の硝化が重要な役割を果たしていることを明記した。腫瘍微小環境の免疫抑制¹².したがって、我々のニトロペプチド同定の方法は、複雑な生物学的試料にも適用することができる。ここで、フラグメンテーションパターンが知られており、ニトロプロテオミクス研究8、9、10、11で広く使用されているモデルペプチドアンジオテンシンIIを例として我々のプロトコルを説明する。

プロトコル

1. アンジオテンシンIIの硝化

1. 硝化ペプチドを生成するには、50 μMの最終濃度で390 μL PBS溶液(10mM NaH₂PO 4、150 mM NaCl、pH 7.4)でアンジオテンシンII(DRVYIHPF)親溶液(水中2mM)を希釈します。
2. アンジオテンシンII溶液に10 μLのペルオキシニットライト(4.7%NaOHで200mM)を加え、ペルオキシニットライト5mMの最終濃度を作ります。
   注:ペルオキシニットライトは、それが酸性の形態であるときに不安定で解決しやすいので、ペルオキシニットライトの親溶液は、基本的な溶液に保持され、-80 °Cに保存されます。
3. 溶液のpH値を1M HClで7-8に調整します。硝化反応を開始するには、チューブを400rpmで5分間振ります。
4. 脱塩には、市販の逆相 SPE 列 (材料の表を参照) を使用します。
   1. 脱塩用の2つの溶液、洗浄用の水に5%のメタノール、溶出用の水に80%メタノールを調べます。
   2. 500 μLのメタノールを加え、続いて500μLの水をカラムを予め条件付けし、1mLピペッタを柱の上部に先端に置き、ピペッタを押して流れを加速させる。
   3. カラムのステップ1.3でサンプルの410 μLをロードし、流れを破棄します。
   4. 5%メタノールの500 μLで洗浄した後、80%メタノールの300 μLを使用してニトロペプチドを溶出させ、室温でのデフォルト設定で速度vacによって完全に乾燥させます。
      注:前のステップで残された溶媒は次のステップに悪影響を及ぼす可能性があるため、脱塩は反応にとって非常に重要です。

2. ジメチル標識による一次アミンのアルキル化

1. 重炭酸トリエチランモニウム(TEAB)溶液の100μLで粉末ニトロアンジオテンシンIIを再構成する。
   注:溶液のpH値は7~9で、溶液中に一次アミンが添加されていないことを確認してください。
2. 溶液に4%ホルムアルデヒドの4 μLを加え、簡単に混ぜます。
   注意: ホルムアルデヒド蒸気は有毒です。ヒュームフードで実験を行う。
3. 溶液に0.6 M NaBH₃CNの4 μLを加え、室温で1時間400rpmでチューブを振る。
4. 1%アンモニア溶液の16μLを添加して標識反応をクエンチし、室温で5分間インキュベートする。
5. 溶液を酸性化するために8 μLのギ酸を加え、ステップ1.4で説明するように逆相SPEカラムを使用して脱塩を行います。

3. アミノチロシンに対するニトロチロシンの減少

1. PBSの500 μL(10mM NaH₂PO 4、150 mM NaCl、pH7.4)でジメチル標識ニトロアンジオテンシンIIを再構成する。
2. 溶液に1Mジチオネートナトリウムの10 μLを加え、室温で1時間インキュベートします。還元反応の後、溶液の黄色が明らかになる。
   注:174.1 mgのジチオネートナトリウムの重量を量り、最終的な容積が1 mLであることを作るために水にそれを溶解します。この溶液は、1週間以内に-20°Cで保存することができます。
3. ステップ 1.4 で説明するように、脱塩には逆相 SPE 列を使用します。

4. バイオチンラ化、濃縮、検出

1. PBSの500 μL(10mM NaH₂PO 4、150 mM NaCl、pH 7.4)でアミノアンジオテンシンIIを標識したジメチルを再構成する。
2. 40 nM NHS-S-S-ビオチンの5μLを加え、DMSOに溶解し、溶液に、室温で2時間インキュベーションした後、反応をクエンチするために5%ヒドロキシルアミンの1 μLを使用する。
3. 一方、PBSの500μL(10mM NaH₂PO 4、150 mM NaCl、pH7.4)を加えて平衡化し、室温で5分間580×gで遠心分離し、上清を廃棄する。平衡化を3回行う。
4. 反応系に100μLの連鎖アジャビジンアガロースビーズを加え、室温でロータリーシェーカーで1時間インキュベートする。PBSで4回洗浄(10 mM NaH₂PO 4、150 mM NaCl、pH 7.4)。各洗浄工程について、ビーズに500 μLのPBSを加え、よく混ぜ、室温で5分間580xgで遠心分離機を使用し、上清を廃棄します。
5. 10mMジチオスレイトール(DTT)の400 μLを使用して、アガロースビーズを50°Cで45分間インキュベートし、室温で5分間580xgでスピンダウンし、ビーズを捨て、0.5Mのidoacetatamid(IAM)の20 μLを超暗闇の20mに加えます。
   注:DTTは、ビオチンとペプチドのリンク間の二硫化結合を破るために使用され、後者はビーズから放出され、さらにIAMによってアルキル化される。
6. ステップ 1.4 に示す脱塩には、逆相 SPE 列を使用します。
7. 0.1%ギ酸(FA)の20μLで乾燥ペプチドを溶解した後、各部の産物をスタンデム質量分析(LC-MS/MS)分析で液体クロマトグラフィーに加える。
   1. 60分の勾配溶出によって修飾されたAng IIペプチドを分離する(0-8分、2%B;8-10分、 5% B; 10-35 分, 18% B; 35-50 分, 28% B; 50-52 分, 80% B; 52-58 分, 80% B; 58-59 分, 2% B; 59-60 分, 2% B) 流量で 0.30 μl/mPLC システム高分解能質量分析計と直接インターフェースされます。
      注:分析カラムは、C-18樹脂を詰めた75μmのID、150 mmの長さです。移動相Aは0.1%ギ酸、移動相Bは100%アセトニトリルと0.1%のギ酸で構成された。
   2. データ依存性集録モードで質量分析計を操作し、単一のフルスキャン質量スペクトル(300-1800 m/z、60 000解像度)を設定し、20のデータ依存MS/MSスキャンを28%正規化された衝突エネルギーでスキャンします。
   3. 質量スペクトルデータを開き、各工程で製品のピークを特定し、化学反応が正常に行われたことを確認します。

5. ニトロペプチドの定量

1. ステップ1.4からニトロアンジオテンシンII溶液の3セットを準備し、各セットは、ニトロアンジオテンシンIIの2濃度を含む:#1、チューブAで20 nmol、チューブBで20 nmol、それぞれ100 μl TEAB溶液中に。#2、チューブCに10nmol、チューブDに20 nmolを設定し、それぞれ100 μl TEAB溶液中に入れます。#3、チューブEに40nmol、チューブFに10nmol、それぞれ100μl TEAB溶液にセットします。
   注:各セット中のニトロアンジオテンシンIIの2つの濃度は、ジメチル標識に使用され、ホルムアルデヒド(光)およびホルムアルデヒド-D2(重)とそれぞれ反応する。
2. 各セットについて、4%ホルムアルデヒドとホルムアルデヒド-D2の4 μLをサンプルに加え、それぞれ軽くて重いと標識します。ジメチルラベリングを完了するには、手順 2.3 ~ 2.5 に従います。
3. 軽く、重いラベルのサンプルを混ぜます。
4. 削減、バイオチニル化、濃縮、検出については、3.1 から 4.6 までの手順に従います。

結果

この原稿におけるニトロペプチドプロファイリングのフローチャートを図1に示す。図2、3、4および5は、アンジオテンシンII、ニトロ−アンジオテンシンII、ジメチル標識ニトロアンジオテンシンIIおよびジメチル標識アミノアンジオテンシンIIの質量スペクトルを示す。 化合物の分子量は、各図におけるモノ...

ディスカッション

ここでのプロトコルは、ニトロペプチド濃縮およびプロファイリングについて説明する。モデルペプチドとしてアンジオテンシンIIを用いて、図1に示す手順を示した。ニトロアンジオテンシンIIを得た後、ペプチド上の一次アミンは、プロトコル内で最も重要なステップの1つであるさらなるアミン結合を避けるためにブロックされるべきである。現在のプロトコルでは?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acclaim pepmap 100 C18 column	Thermo-Fisher	164534
1 M TEAB solution	Sigma-Aldrich	T7408
50% hydroxylamine	Thermo-Fisher	90115
Acetonitrile	Thermo-Fisher	A955	MS Grade
dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43819
formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Molecular Biology Grade
formaldehyde-D2	Toronto Research Chemicals	F691353
formic acid	Sigma-Aldrich	695076	ACS reagent
Fusion Lumos mass spectrometer	Thermo
isoacetamide	Sigma-Aldrich	I1149
Methanol	Thermo-Fisher	A456	MS Grade
NHS-S-S-bition	Thermo-Fisher	21441
Oasis HLB column (10 mg)	Waters	186000383
peroxynitrite	Merck-Millipore	516620
sodium cyanoborohydrite	Sigma-Aldrich	42077	PhamaGrade
sodium dithionate	Sigma-Aldrich	157953	Technical Grade
Streptavidin Sepharose	GE Healcare	GE17-5113-01
Ultimate 3000 nanoLC	Thermo