溶媒クリア脳組織における狂犬病ウイルス感染の高解像度3Dイメージング

要約

溶媒除去された器官の究極の3Dイメージングのような新しい、免疫染色互換組織クリアリング技術は、狂犬病ウイルス脳感染症とその複雑な細胞環境の3D可視化を可能にします。厚い、抗体標識された脳組織スライスは、画像深さを高め、共焦点レーザー走査顕微鏡による3D解析を可能にするために光学的に透明に作られています。

要約

免疫標識による組織や臓器の感染過程の可視化は、現代の感染生物学における重要な方法である。臓器組織内の病原体の分布、栄養学、および豊富さを観察し、研究する能力は、疾患の発症と進行に関する重要なデータを提供します。従来の顕微鏡検査法を用いて、免疫標識は、パラフィン埋め込みまたは凍結サンプルから得られる薄いセクションに主に制限される。しかし、これらの薄い部分の限られた2D画像面は、感染した器官の複雑な構造および感染の細胞コンテキストに関する重要な情報の喪失につながる可能性がある。現代の多色、免疫染色互換組織クリアリング技術は、ウイルスに感染した臓器組織の大量の3D画像スタックを研究するための比較的高速かつ安価な方法を提供します。組織を有機溶媒にさらすことで、光学的に透明になります。これはサンプルの屈折率指数と一致し、最終的には光散乱の大幅な減少につながります。従って、長い自由な働く間隔の目的と組み合わせて、サイズの1 mmまでの大きいティッシュセクションは高リゾリューションの慣習的な共焦点レーザースキャン顕微鏡(CLSM)によってイメージ化することができる。ここでは、ウイルス病因、広がり、トロピズム、神経侵襲などのトピックを研究するために、感染した脳における狂犬病ウイルス分布を可視化するために、組織クリア後に深部組織イメージングを適用するプロトコルについて説明する。

概要

従来の組織学の技術は、主に複雑な3D環境に2D洞察しか提供できない臓器組織の薄い部分に依存しています。原理的には実現可能ですが、シリアルシンセクションからの3D再構成は、取得した画像1のシリコアライメントのスライスおよびその後の両方に対して、厳しい技術的パイプラインを必要とします。さらに、マイクロトームスライス後のZボリュームのシームレスな再構成は、非重なり合う画像平面、染色バリエーション、物理的な画像登録によって引き起こされる最適でない画像登録のために、機械的および計算的なアーティファクトの両方が残る可能性があるため、重要です。例えば、マイクロトームブレードによる組織の破壊。対照的に、無傷の厚い組織サンプルの純粋な光学スライスは重なり合うイメージ平面の獲得(オーバーサンプリング)を可能にし、それによって、3D再建を促進する。これは、複雑な細胞集団(例えば、周囲のグリア細胞および免疫細胞の文脈における神経ネットワーク)における感染プロセスの分析に非常に有益である。しかしながら、厚い組織切片の固有の障害は、組織への光散乱および限られた抗体の浸透を含む。近年、これらの問題を克服するために様々な技術が開発され、最適化されています^2,3,4,5,6,^{7,8,9,10歳,11歳,12歳,13.}本質的に、標的組織は、水性2、3、4、5、6、7のいずれかの治療によって光学的に透明に変わる 、8、9^または有機溶媒ベースの10、11、12、13溶液。3DISCO(溶媒クリア臓器の3Dイメージング)11、12およびその後継uDISCO(溶媒クリア臓器の究極の3Dイメージング)13の導入は、比較的高速でシンプルで安価なツールを提供しました。優秀なクリアリング機能。クリアリングプロトコルの主な構成要素は、有機溶媒テルトブタノール(TBA)、ベンジルアルコール(BA)、ベンジル安息香酸ベンゾエート(BB)、およびジフェニルエーテル(DPE)です。iDISCO(溶媒クリア臓器の免疫標識可能な3D^{イメージング)14}の開発と添加は、互換性のある免疫染色プロトコルであり、既存の方法に対する別の利点を構成し、抗原の深部組織標識を可能にした関心のあるだけでなく、免疫染色サンプルの長期保存。したがって、iDISCO¹⁴とuDISCO¹³の組み合わせは、従来のCLSMを使用して、大きな組織切片(最大1mm)における抗体標識タンパク質の高解像度イメージングを可能にします。

すべての次元で臓器の複雑な構造の保存は、脳組織のために特に重要です。ニューロンは、その神経突起に基づいて非常に多様な3D形態を有する非常に不均一な細胞サブ集団を含む(マス^ランド15によってレビュー)。さらに、脳は多数のコンパートメントおよびサブコンパートメントから構成され、それぞれがグリア細胞およびニューロンを含む異なる細胞細胞亜集団およびその比率で構成される(von Bartheld et al.¹⁶によるレビュー)。神経型ウイルスとして、狂犬病ウイルス(RABV、Fooks et al.17によってレビュー)は、主にニューロンに感染し、その輸送機械を使用して、感染の一次部位から中枢神経系(CNS)に軸方向に沿って移動する。ここで説明するプロトコル(図1A)は、感染した脳組織から得られる大きな一貫性のある画像スタックにおけるRABVおよびRABV感染細胞の免疫染色支援検出および可視化を可能にする。これにより、感染環境の公平な3D高解像度評価が可能になります。これは、様々な種からの脳組織に適用可能であり、固定後、またはパラホルムアルデヒド(PFA)中のサンプルの長期保存後に行うことができ、数ヶ月間染色およびクリアされたサンプルの保存および再画像化を可能にする。

プロトコル

RABV感染、PFA固定アーカイブ脳材料が使用された。それぞれの動物実験研究は、メクレンブルク西部ポメラニア(LALFF M-V)の農業、食品安全、漁業のための国家オフィスの責任ある動物のケア、使用、倫理委員会によって評価され、許可を得て承認を得ました。7221.3-2.1-002/11 (マウス) および 7221.3-1-068/16 (フェレット)。動物実験で使用される一般的なケアおよび方法は、承認されたガイドラインに従って行われた。

注意:このプロトコルは、PFA、メタノール(MeOH)、過酸化水素(H2 O_2)、アジ化ナトリウム(NaN3)、TBA、BA、BB、およびDPEを含む様々な有毒および/または有害物質を使用しています。MeOHおよびTBAは非常に可燃性である。適切な個人用保護具(ラボコート、手袋、目の保護具)を着用し、ヒュームフードで実験を行うことで、暴露を避けてください。適切な容器に別途廃棄物を回収し、現地の規制に従って処分します。狂犬病ウイルスは、バイオセーフティレベル(BSL)-2病原体として分類され、したがって、一般的にBSL-2条件下で処理することができます。エアロゾルを生成する手順、高いウイルス濃度で作業する手順、または新しいリッサウイルスを使用する手順を含むいくつかの活動は、BSL-3分類を必要とする場合があります。暴露前予防は、動物の世話人や実験室の労働者を含むリスクの高い人員に推奨されます^18,19.地方自治体の規制を参照してください。

1. 脳組織の固定と断面

1. リン酸緩衝生理食べ物(PBS[pH 7.4])で4%のPFAの適切な体積で脳サンプルを4°Cで48時間(概算組織対固定比1:10[v/v])で固定します。
2. 組織サンプルをPBSで3倍に洗い、各洗浄で少なくとも30分間洗浄し、使用するまで4°Cで0.02%NaN₃/PBSに保存します。
3. ビブレーターを使用して組織を1mm厚のセクションに切り分けます(ブレードフィードレート:0.3~0.5mm/s、振幅:1mm、スライス厚さ:1,000μm)。
4. 正しいスライス配列を保持するには、各組織部をマルチウェル細胞培養プレートのウェルに別々に保存します。0.02% NaN₃/PBS を追加し、使用するまで 4 °C で組織セクションを格納します。

2. メタノールによるサンプル前処理

注:穏やかな振動ですべてのインキュベーションステップを実行し、そうでなければ、室温で示されていない場合。サンプルを光から保護します。サンプル前処理は、MeOHおよびH2O2への曝露による抗体拡散を改善し、組織の自己蛍光を減少させる全体的な目的を果たし、^{それぞれ14。}

1. 蒸留水に20%(v/v)、40%、60%、80%のMeOH溶液を準備します。例えば、20%MeOHの場合は、適切なシール可能な容器に蒸留水の40 mLに100%MeOHの10mLを追加し、それを反転して混合します。
2. サンプルを合理的な大きさの容器(例えば、5mL反応管)に移す。このプロトコルで使用される試薬に対して化学的に耐性のある材料を使用するように注意してください。例えば、ポリプロピレンは適しているが、ポリスチレンは適していないことに注意してください。
   注:このプロトコルの体積仕様は、5 mL反応管を参照してください。別の容器を使用する場合は、それに応じて音量を調整します。
3. 調製された一連のMeOH溶液の各濃度の4mLでサンプルを1時間の昇順でインキュベートする。
4. サンプルを純粋な(100%)でそれぞれ1時間2xインキュベートするメタノール。
5. サンプルを4°C(例えば、実験室で安全な冷蔵庫で)冷却します。
6. 漂白液(MeOHで5%H2O2)を調剤し、例えば、純度(100%)で1:6で30%H2O2ストック溶液を希釈するMeOH、4°Cで冷やします。
7. 冷蔵サンプルから100%MeOHを取り出し、4mLのチルド漂白液(MeOHではH2O2)を添加します。4°Cで一晩インキュベートします。
8. 漂白液を80%MeOHの4mLと交換し、1時間インキュベートし、20%MeOHの4mLでサンプルが1時間インキュベートされるまで、各1時間の降下順序で調製された一連のMeOH溶液を使用し続けます。
9. サンプルを1時間1xで洗浄し、4 mLのPBSで洗浄します。

3. 免疫染色

注:穏やかな振動ですべてのインキュベーションステップを実行し、そうでなければ、室温で示されていない場合。サンプルを光から保護します。微生物の増殖を防ぐために、このセクションの溶液に0.02%の最終濃度にNaN₃を追加します。組織試料は、非イオン性洗剤トリトンX-100および第二性20による処理によりさらに透過化される。正常な血清は、非特異的抗体結合をブロックするために使用される。グリシンおよびヘパリンは、免疫標識の^背景14を減少させるために添加される。

1. 0.2%トリトンX-100/PBSの4 mLでサンプルを1時間2x洗浄します。
2. 0.2%トリトンX-100/20%DMSO/0.3 Mグリシン/PBSの4 mLで37°Cで2日間サンプルを透過化します。
3. 0.2% トリトン X-100/10% DMSO/6% 正常な血清/PBS の 4 mL で 37 °C で 2 日間サンプルをインキュベートすることにより、抗体の非特異的結合をブロックします。
   注:理想的なブロッキング結果を達成するために二次抗体が上げられた同じ種からの正常な血清を使用する。
4. 一次抗体溶液の2mL(3%正常血清/5%DMSO/PTwH[ヘパリン付きPBS-Tween 20]+一次抗体/抗体)で5日間37°Cでサンプルをインキュベートします。2.5日後に一次抗体溶液をリフレッシュします。
   1. PTwHの場合、蒸留水中のヘパリンナトリウム塩を再構成し、10mg/mLのストック溶液を作ります(この溶液を保存し、アリクォートし、4°C)。ストック溶液を0.2%のツイエン20/PBSに10 μg/mLの最終濃度に加えます。
      注:正しい抗体希釈を選択するには、最適化が必要な場合があります。一般に、標準的な免疫組織化学濃度は良い出発点です。
5. PTwHの4mLで1日サンプルを洗浄し、一日の間に少なくとも4x-5xの洗浄バッファーを交換し、一晩で最終的な洗浄を残します。
6. 2mLの二次抗体溶液(3%正常血清/PTwH+二次抗体/抗体)でサンプルを37°Cで5日間インキュベートします。2.5日後に二次抗体溶液をリフレッシュします。
   1. 二次抗体/抗体を二次抗体溶液中で1:500で希釈する(すなわち、2mLで4μL)。
7. ステップ3.5に記載されているように1日間サンプルを洗浄し、一晩で最終洗浄を残します。

4. 核染色

注:穏やかな振動ですべてのインキュベーションステップを実行し、そうでなければ、室温で示されていない場合。サンプルを光から保護します。核染色が不要な場合、またはTO-PRO-3の励起波長/発光スペクトルが別の蛍光色素の励起または検出に必要な場合は、この手順をスキップします。

1. PTwHで1:1,000の核酸染色TO-PRO-3を希釈し、5時間核染色溶液の4mLでサンプルをインキュベートします。
2. ステップ3.5に記載されているように1日間サンプルを洗浄し、一晩で最終洗浄を残します。
   注:洗浄後、サンプルは光学クリアリングまで4°CでPBSに保存することができます。

5. 組織クリア

注:穏やかな振動ですべてのインキュベーションステップを実行し、そうでなければ、室温で示されていない場合。サンプルを光から保護します。組織サンプルはTBAの等級シリーズで脱水される。免疫染色には水溶液が必要なため、組織の除去前にすべての染色手順を完了する必要があります。光学クリアランスと屈折率の一致は、BA、BB、およびDPEの混合物による処理によって達成される。クリアリング溶液は、抗酸化^剤13としてDL−α-トコフェロールを補充する。

1. 蒸留水に30%(v/v)、50%、70%、80%、90%、96%のTBA溶液を調剤します。例えば、30%TBAの場合、適切なシール可能な容器に蒸留水の35 mLに100%TBAの15 mLを追加し、反転して混合します。
   注:TBAは25-26 °Cの融点を有する;したがって、室温で固体になる傾向があります。TBA溶液を調製するために、密封されたボトルをインキュベーターまたは水浴で37°Cで加熱します。
2. 調製された一連のTBA溶液の各濃度の4mLでサンプルを2時間の昇順で脱水します。96% TBA を一晩放置してください。
3. 純粋な(100%)でサンプルをさらに脱水する2時間のTBA。
4. クリアリングソリューションBABB-D15を準備します。
   注: BABB-D15 は BA と BB (BABB) の組み合わせで、x :1 の比率で DPE と混合され、この場合は 15 でxが指定されます。
   1. BABBの場合は、1部のBAを2つのパーツBBと混ぜます。
   2. BABBとDPEを15:1の比率で混合します。
   3. 0.4 vol%DL-α-トコフェロール(ビタミンE)を加えます。
      注:例えば、BABB-D15の20 mLの場合、BAの6.25 mLをBBの12.5 mLと混合します。DPEの1.25 mLを追加し、DL-α-トコフェロールの0.08 mLでそれを補います。
5. 光学的に透明になるまで(2~6時間)、クリアリング溶液のサンプルをクリアします。
6. サンプルはBABB-D15の4 °Cで貯えることができる、取付けおよびイメージ投射まで光から保護される。

6. サンプル取り付け

1. 3Dプリンターを使用して、イメージングチャンバと蓋(材料:コポリエステル[CPE]、ノズル:0.25mm、層高さ:0.06mm、壁厚さ:0.88mm、壁面数:4、インフィル:100%、サポート構造なし、対応する。STLファイルは、このプロトコルの補足資料で見つけることができます)。
2. 撮像室を組み立てる(図2)。
   1. RTV-1(1成分室温加硫)シリコーンゴムを使用して、イメージングチャンバに丸いカバースリップ(直径:30mm)を取り付けます。水で濡れた綿棒で余分なシリコーンゴムを取り除き、一晩硬化します。
   2. RTV-1シリコーンゴムで蓋に丸いカバースリップ(直径:22mm)を取り付けます。水で濡れた綿棒で余分なシリコーンゴムを取り除き、一晩硬化します。
3. サンプルをイメージングチャンバに入れ、少量のBABB-D15を加え、蓋を挿入します。低皮針(27 G x 3/4インチ[0.40 mm x 20 mm])を使用して、入り江を通してBABB-D15でチャンバーを充填します。
4. 入り込みとRTV-1シリコーンゴムでイメージングチャンバを密封します。暗闇の中で一晩治療する。

7. 画像処理・画像処理

1. 使用する蛍光色素に合わせてそれぞれのレーザー線を選択して画像集録を設定します。各検出器の検出範囲を調整して、チャネル間の信号の重複を防ぎます。
   注:Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 568、およびTO-PRO-3の例示的な検出範囲は、それぞれ500~550nm、590~620nm、645~700nmです。
2. 取得パラメータを選択し、Z スタックの上下の境界線を定義し、イメージ スタックを取得します。
   注:例示的な取得パラメータは、60-90 nmのピクセルサイズ、0.5 μmのZステップサイズ、ライン平均1、スキャン速度400Hz、および1 Airyユニットのピンホールサイズを持つシーケンシャルスキャンです。
3. 適切な画像解析ソフトウェア(フィジーなど)を使用して画像スタックを処理し、3D投影を生成したり、詳細な解析を実行したりできます。
   注: 取得したイメージ・ファイルのサイズが大きいため、通常はワークステーションの使用が必要です。
   1. フィジーで取得ファイルまたはイメージ ファイルを開く (ファイル|開く|ファイルを選択してください)。
      1. たとえば、 を使用する場合は、 を使用します。LIF ファイルは、[生体フォーマット] ダイアログ ウィンドウで目的のオプションを選択または選択解除します。ハイパースタックを使用してスタックを表示します。それ以外は、特定の選択や目盛りは必要ありません。[OK]を押します。
      2. ファイルに複数のイメージ スタックが含まれている場合は、分析対象の画像を選択し、[OK]を押して確認します。
   2. マージしたイメージを個別のチャンネルに分割して漂白剤補正を行う (画像|色|チャンネル ツールを選択し、[その他]を選択します |チャンネルを分割します)。チャンネルごとに漂白剤補正を選択(画像|調整|漂白剤補正)を選択し、単純比(背景強度:0.0)を選択します。
      注:例えば、信号の線形減衰がない場合や、信号が全体的に弱すぎると、単純比が失敗する場合があります。または、指数フィットを試すか、漂白剤補正をスキップしてください。
   3. スライダーを使用して各チャンネルの明るさとコントラストを調整します (画像|調整|明るさ|コントラスト)。
   4. チャンネルをマージする (画像|色|チャンネルをマージし、コンポジットを作る (画像|色|チャンネル ツールを選択し、[その他]を選択します |コンポジットを作成し、RGB 形式に変換します (画像|色|チャンネル ツールを選択し、[その他]を選択します |RGB に変換します)。
   5. 必要に応じて、画像スタックのサイズを変更して計算時間とファイルサイズを小さくします (画像|調整|サイズ、両方のオプションがチェックとバイリニア補間)。
   6. 3D 投影を生成する (画像|スタック|3Dプロジェクト)。投影方法として[最も明るい点]を選択し、取得した画像スタックのZステップサイズに合わせてスライス間隔を設定します。品質を高めるには、回転角度の増分を1に設定し、補間を有効にします。必要に応じて、回転の合計、透明度のしきい値、および不透明度を変更します。
   7. 必要に応じて、3D投影を 8 ビット形式に戻してコントラストと明るさを戻します (画像|タイプ|8ビット)。それぞれのスライダーを使用する (画像|調整|明るさ|コントラスト)ステップ 7.3.4 で説明したように、イメージ スタックを RGB 形式に再変換します。
   8. 3D 投影を として保存します。TIF ファイル (イメージ ファイル形式) および .AVIファイル(ビデオファイル形式)。

結果

iDISCO¹⁴およびuDISCO¹³の組み合わせは高リゾリューションCLSMと結合され、脳組織および周囲の細胞文脈のRABV感染の時空間的な決断および可塑性に深い洞察を提供する。

RABVリンタンパク質(P)の免疫染色を用いて、感染した神経細胞の複雑な層をマウス脳の厚い部分で可視化することができる(図3)。その後、取得した?...

ディスカッション

近年の組織浄化技術の復活とさらなる発展^2,3,4,5,6,7,^{8,9,10歳,11歳,12歳,13歳,}

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Benzyl alcohol	Alfa Aesar	41218	Clearing reagent
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich	BB6630-500ML	Clearing reagent
Dimethyl sulfoxide	Carl Roth	4720.2	Various buffers
Diphenyl ether	Sigma-Aldrich	240834-100G	Clearing reagent
DL-α-Tocopherol	Alfa Aesar	A17039	Antioxidant
Donkey serum	Bio-Rad	C06SBZ	Blocking reagent
Glycine	Carl Roth	3908.2	Background reduction
Goat serum	Merck	S26-100ML	Blocking reagent
Heparin sodium salt	Carl Roth	7692.1	Background reduction
Hydrogen peroxide solution (30 %)	Carl Roth	8070.2	Sample bleaching
Methanol	Carl Roth	4627.4	Sample pretreatment
Paraformaldehyde	Carl Roth	0335.3	Crystalline powder to make fixative solution
Sodium azide	Carl Roth	K305.1	Prevention of microbial growth in stock solutions
tert-Butanol	Alfa Aesar	33278	Sample dehydration for tissue clearing
TO-PRO-3	Thermo Fisher	T3605	Nucleic acid stain
Triton X-100	Carl Roth	3051.2	Detergent
Tween 20	AppliChem	A4974,0500	Detergent
Miscellaneous
5 mL reaction tubes	Eppendorf	0030119401	Sample tubes
Coverslip, circular (diameter: 22 mm)	Marienfeld	0111620	Part of imaging chamber
Coverslip, circular (diameter: 30 mm)	Marienfeld	0111700	Part of imaging chamber
Hypodermic needle (27 G x ¾” [0.40 mm x 20 mm])	B. Braun	4657705	Filling of the imaging chamber with clearing solution
RTV-1 silicone rubber	Wacker	Elastosil E43	Adhesive for the assembly of the imaging chamber
Ultimaker CPE 2.85 mm transparent	Ultimaker	8718836374869	Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber
Technical equipment and software
3D printer	Ultimaker	Ultimaker 2+	Printing of imaging chamber
Automated water immersion system	Leica	15640019	Software-controlled water pump
Benchtop orbital shaker	Elmi	DOS-20M	Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm)
Benchtop orbital shaker, heated	New Brunswick Scientific	G24 Environmental Shaker	Sample incubation at 37 °C (~ 150 rpm)
Confocal laser scanning microscope	Leica	DMI 6000 TCS SP5	Inverted confocal microscope for sample imaging
Fiji	NIH (ImageJ)	open source software (v1.52h)	Image processing package based on ImageJ
Long working distance water immersion objective	Leica	15506360	HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2
Vibratome	Leica	VT1200S	Sample slicing
Workstation	Dell	Precision 7920	CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB
Primary antibodies
Goat anti-RABV N	Friedrich-Loeffler-Institut		Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N Dilution: 1:400
Rabbit anti-GFAP	Dako	Z0334	Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) Dilution: 1:100
Rabbit anti-MAP2	Abcam	ab32454	Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) Dilution: 1:250
Rabbit anti-RABV P 160-5	Friedrich-Loeffler-Institut		Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) Dilution: 1:1,000
Secondary antibodies
Donkey anti-goat IgG	Thermo Fisher Scientific	depending on conjugated fluorophore	Highly cross-absorbed Dilution: 1:500
Donkey anti-mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	depending on conjugated fluorophore	Highly cross-absorbed Dilution: 1:500
Donkey anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	depending on conjugated fluorophore	Highly cross-absorbed Dilution: 1:500
Goat anti-mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	depending on conjugated fluorophore	Highly cross-absorbed Dilution: 1:500
Goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	depending on conjugated fluorophore	Highly cross-absorbed Dilution: 1:500