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要約

ここでは、急性脳スライスにおける全細胞パッチ クランプ電気生理学を使用して機能的なシナプスの多様性を評価するためのプロトコルを提案する.

要約

中枢神経系のニューロンのペアはしばしば複数のシナプスの連絡先および/または機能神経伝達物質のリリース サイト (シナプス多重度) を形成します。シナプスの多様性は開発中とされているシナプス伝達の有効性の重要な決定要因、さまざまな生理的条件で変化とプラスチック。ここでは、我々 は終了急性脳スライスにおける全細胞パッチ クランプ電気生理学を使用して指定されたシナプス後ニューロンにシナプスの多様性の程度を推定するための実験を概説します。具体的には、自発性興奮性シナプス電流 (sEPSCs) の振幅とミニチュア興奮性シナプス電流 (mEPSCs) の違いを比較する電圧クランプ記録がされます。このメソッドの背後にある理論は、多様性を示す求心性入力は各シナプスの接触時に発生する同期のリリースのための大きい、電位依存性 sEPSCs を表示すること。対照的に、活動電位に依存しないリリース (これは非同期) 小さい振幅 mEPSCs が生成されます。この記事は一連の実験とシナプスの多様性の存在を特徴付けるための分析の概要し、要件と技術の限界について説明します。この手法は、生体に影響を与える異なった頭脳区域でシナプスの連絡先の組織でどのように異なる行動、薬理学的または環境介入を調査に適用できます。

概要

シナプス伝達機構はニューロン間のコミュニケーションのため、したがって、脳の機能。シナプス伝達は、不安定なも、変調信号1への応答ようにも活動に依存した方法でその効果を変更できます。したがって、シナプス機能を調べると、神経科学研究の主要な焦点がされています。全細胞パッチ クランプ電気生理学は私たちを案出する実験デザインとデータ解析によるシナプス伝達の詳細な生物物理・分子機構を理解することができる汎用性の高いテクニックです。一般的なアプローチ、おそらく技術とコンセプトのシンプルさ、ためにミニチュア興奮性/抑制性シナプス後電流の測定は (私/Ips) 電圧クランプ構成2,3,4,5,6個々 Mpsc は、それぞれ神経伝達物質シナプス前ターミナル7 から解放の結合への応答のイオン型シナプス後受容体 (例えば AMPA とギャバA受容体) を介してイオンの流れを表す。.電位依存性 Na+チャネル ブロッカー テトロドトキシン (TTX) の存在下で記録を取得するとため、リリースの活動電位非依存および通常単一シナプス小胞神経伝達物質が含まれているが含まれます。この仮定に基づいて、Mpsc の平均振幅広くとして粗見積もり素量のサイズは、数と反対のシングル リリース サイト シナプス後受容体の機能を表します。その一方で、Mpsc の周波数は、シナプス シナプス後細胞とその平均放出確率に終了の合計数の組合せを表すと見なされます。ただし、これらのパラメーターは、シナプスのシナプスの多様性別変数 multiplicativity を測定しない-シナプス伝達の有効性のために重要であります。

シナプス伝達7,8,9の量子理論に基づく、ニューロンのペア間の特定の接続の強さは 3 つの要因に依存している: 機能性シナプス (N) の数、単一シナプス小胞 (量子サイズのリリースにシナプス応答Q) および神経伝達物質のリリース (Pr) の確率。シナプスの多様性は、 Nと同じです。乗法性シナプスの刈り込みやシナプスの多様性の開発は、開発全体と別の病気の状態3,4,6,10にプラスチックです。このため、健康と病気におけるシナプス伝達の有効性を理解するための重要な含意をシナプスの多様性を特徴付けます。電子顕微鏡などの手法は、同じシナプス後ニューロン11,12、上に同じ軸索からシナプスの複数の連絡先を検出することによりシナプスの多様性の構造的な証拠を識別できます。 13,14。しかし、これらの構造的に識別された multisynapses は機能的サイレント15,16をすることができます。指定された接続は、複数の機能リリース サイトかどうかを識別することができます対の全体セルの録音などの電気生理学的アプローチを技術的に困難なNの精密機能検査が必要最小限と単一推定軸索を募集することを目指す刺激アプローチ。

このプロトコルではもともと夏ら2によって開発された方法を採用することによりシナプスの多様性を推定するための簡単な方法をについて説明します。この手法には、自発の Psc (sPSCs) ・ Mpsc 全体細胞のパッチ クランプ電気生理学、特定のニューロンに対するすべての入力間シナプスの多様性の程度を推定することができますを使用しての測定が含まれます。 以前に定義した、シナプスの多様性は、与えられた前及びシナプス後ニューロン間のシナプスの数を反映します。複数のシナプス活動電位によって同調で募集、大きい振幅 PSC を生成する個々 の (すなわち素量) Psc の時間加算の高確率になります。 MPSC 録音で (どの活動電位 TTX によってブロックされる) で個々 の (非同期) Mpsc の時間加算の確率は低い。この原理を使用して、mPSC 振幅に (活動電位依存型リリース) 用の振幅を比較することによってシナプスの多様性を推定できます。

多様性の存在を確認するには、は、4 つの実験とその解析例としてグルタミン酸作動性工を使用してについて説明します。高速の同じ方法を使用することができますただし、gaba 作動性/グリシン作動性神経伝達 (Ips)。各実験のための簡単な理論的根拠を説明します。まず、前述のように、シナプスの多様性は mEPSCs に sEPSCs の振幅を比較することによって推定できます。このアプローチの 2 つの要件があります。1) シナプス前の軸索は、録音中は、活動電位の十分な数を発火しなければならないし、複数のシナプス活動電位の到着時に神経伝達物質を解放するように、2) Prが高くなる必要があります。これらの要件を満たすために sEPSCs を最初低 Ca2 +人工髄液 (アプライド) に記録された、K+のチャネル拮抗薬 4 アミノピリジン (4 AP) を行動を高めるための低濃度存在下で記録されます。潜在的な発砲と Pr。その後、活動電位発火は TTX と電位依存性 Ca2 +チャネル ブロッカー Cd2 +減 Pr によってブロックされます。MEPSC の sEPSCs (4AP) での振幅を比較 (4AP、TTX、Cd と2 +)。2 番目の実験では、Ca2 +に置換されますモル Sr2 + desynchronize 小胞の放出にアプライドで。Ca2 +は小胞の同期のリリースに必要な Sr2 +交換多重度を示している大振幅 sEPSCs を削除してください。第三に、機械論的に、多様性起因できるいずれかの複数のシナプス連絡先同じシナプス後ニューロンまたは多胞性のリリース (すなわち複数小胞の放出単一シナプスの接触内)17,18。多様性の 2 つのタイプを区別するために第 3 実験使用低親和性、高速分離競争力の拮抗薬 AMPA 受容体 γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,18大きいかどうかを決定するにはsEPSC は、独立したシナプスのシナプス後受容器の重なり人口に作用する多胞性のリリース時間の加算の結果です。多胞性のリリースから大振幅イベントが発生した場合、複数のシナプスの接触の時間の総和から生じる大規模な sEPSCs によって同様に影響されるに対し γ-DGG は大きいのより小さいのに比べて sEPSCs を抑制することで有効性が低くなりますΓ-武神。4 番目の実験より生理学的方法を使用して、活動電位発火、すなわち求心性のシナプス刺激を強化します。シナプスのバーストは、刺激の求心性神経の自発性活動電位発火と放出確率を促進/増加できる一過性。したがって、このアプローチはより生理的な方法でマニフェストに多様性をことができます。

次のプロトコルは、マウス視床下部組織のこれらの実験を行う方法を説明します。具体的には、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン (CRH) (PVN) 視床下部の室傍核ニューロンが使用されます。全体細胞のパッチ クランプ電気生理学を実施するための手順について説明し、シナプスの多様性をテストする特定の実験を説明します。

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プロトコル

すべての動物実験は、動物のケア委員会のウェスタン オンタリオ大学動物ケアのガイドライン (AUP #2014-031) のカナダの評議会に従ってによって承認されます。

1. ソリューション

  1. ソリューションをスライス
    1. スライスの溶液組成は表 1を参照してください。
    2. 20 x の原液を事前に準備、4 ° C で 1 ヶ月保存できます。
    3. 1 x スライス ソリューション NaHCO3, グルコースおよびスクロースを ddH2O を溶解し、20 x の在庫を追加します。浸透圧は 315 320 mOsm の間を確保し、4 ° C で 1 週間以上のソリューションを保存
    4. 100 ml のソリューションをスライスの 2 つのビーカーを記入し、パラフィルムで覆います。ソリューションは部分的 (-80 ° C のフリーザーで約 20 分) をフリーズになるまで冷凍庫でソリューションを冷やします。氷の上の 95% O25% CO2 20 分のソリューションをスライスの両方のビーカーをバブル ガス分散管を用いたします。
液濃度 (mM)
スライス通常アプライド低 Ca2 +アプライドSr+アプライドピペット/内部
塩化ナトリウム87126126126-
KCl2.52.52.52.58
CaCl2 0.52.50.5--
SrCl2 ---2.5-
MgCl2 71.52.51.52
NaH2PO4 1.251.251.251.25-
NaHCO3 25262626-
グルコース25101010-
ショ糖75----
K グルコン酸----116
-グルコン酸 Na----12
HEPES----10
K2 グリコールエーテルジアミン四酢酸----1
K2ATP----4
Na3GTP----0.3

表 1: 様々 な溶液の組成。

  1. (スライス回復およびメンテナンス) のアプライド
    1. アプライドの組成は表 1を参照してください。
    2. 20 x の原液を事前に準備、4 ° C で 1 ヶ月保存できます。
    3. 1 x アプライド NaHCO3と ddH2O 中のブドウ糖を溶解し、20 x の在庫を追加します。298 300 mOsm の間、浸透圧の変化を確認します。1 日以内のソリューションを使用します。
  2. アプライド (低 Ca2 +のための記録)
    1. 低 Ca2 +アプライドの組成は表 1を参照してください。
    2. 20 x の原液を事前に準備、4 ° C で 1 ヶ月保存できます。
    3. 低 Ca2 +アプライド x 1、溶かし NaHCO3と ddH2O のグルコース (CaCl2と MgCl2無料) x 20 を追加して株式、CaCl2 MgCl2濃度を指定します。浸透圧は、298-300 の間を確認します。1 日以内のソリューションを使用します。
  3. アプライド (Sr2 +のための記録)
    1. Sr2 +アプライドの組成は表 1を参照してください。
    2. 20 x の原液を事前に準備、4 ° C で 1 ヶ月保存できます。
    3. Sr2 +アプライド x 1、溶かし NaHCO3と ddH2O にグルコース (CaCl2と MgCl2無料) x 20 を追加して株式、SrCl2 MgCl2濃度を指定します。浸透圧は、298-300 の間を確認します。1 日以内のソリューションを使用します。
  4. 内部ソリューション
    1. K グルコン酸ベースの内部液の組成は表 1を参照してください。
    2. 内部溶液 20 mL をするためには、50 mL のチューブに 15 mL の分子生物学グレードの水を追加します。氷の上の後続の手順を実行します。
    3. グレード水早めに分子生物学の 1 M ストック濃度以下のソリューションを準備します。(ML) 追加: 2.32 K グルコン酸、グルコン酸 Na 0.24-0.16 0.20 HEPES KCl、0.05 K2-グリコールエーテルジアミン四酢酸、0.04 MgCl2 50 mL のチューブ。
    4. 0.3 M Na3GTP の 100 μ L を追加します。
    5. K22 mL 遠心チューブ ATP 44.08 mg の重量を量ると分子生物学グレードの水の 1 つの mL を追加し、50 mL のチューブ追加。
    6. 1 M コで 7.2 7.4 に pH を調整します。283-289 mOsm の間、浸透圧の変化を確認します。

2. スライス標本

  1. ツールを準備します。
    1. (4 井戸とネッティング 250 mL ビーカーから構築) 回復室にアプライドの 200 mL を追加し、水浴 (35 ° C) の回復室を配置します。
    2. パラフィン フィルム室をカバーし、常にバブル、アプライドの 95% O25% CO2を少なくとも 20 分間ガラス拡散管を使用します。
    3. 郭清を準備するには、ツール (メス、角度のついた高級ハサミ、鉗子、細かいペイント ブラシ、プラスチック スプーン) を設定します。
    4. 1.1.4 のステップから冷たいスライス溶液約 15 mL と 60 mL の注射器を入力します。
    5. 郭清のプラットフォームを準備するには、ウェル プレートの蓋のフィルター ペーパーを配置します。
    6. スライスの商工会議所を準備するには、製氷皿にそれを置くと氷のトレイを充填します。
    7. ブレード ホルダーに替刃を確保することにより、vibratome を設定します。
    8. パスツール ピペットの先端を破り、壊れた終わりゴム球を置くことによって転送ピペットを作る。
  2. マウスの脳を解剖します。
    1. 4% イソフルランで飽和状態に脊髄反射が欠席になるまで室内で動物を麻酔します。
    2. ギロチンを使用して動物の首をはねるし、脳をすぐに削除します。
      1. 尾側吻側から第 22 メス刃で正中切開を行います。
      2. 横方向に頭の両側に頭皮の皮をむきます。
      3. 尾から一側吻側 (を含むを頭骨の側面)、頭蓋骨を切るに使用高級はさみは、脳に損傷を与えないように注意を使用してください。
      4. 頭蓋骨部分を解除する使用鉗子脳と 15 ml の冷たいスライス ソリューション ステップ 2.1.4 から注射器を使用しての脳はすぐに冷却します。
      5. 頭蓋骨から脳を持ち上げます。
      6. 場所 (ステップ 1.1.4) から冷たいスライス液でいっぱいビーカーの一つで脳は 95% O25% CO2バブル。
  3. マウス視床下部のスライスを準備します。
    1. 必要な脳領域の脳をブロックし、角をカット (視床下部辺縁系の視交叉に吻側と尾側橋のブレードを使用する組織を切り落とすし、仙骨ブロックは脳の基底に平面の垂直を確保するなど)。
    2. フィルター ペーパーのカット部分を使用して、前面側から脳を拾う、瞬間接着剤を使用して固定プレートを後方側を接着します。
    3. すぐにスライスの室に保持プレートを置き、1.1.4 の手順で 2 つ目のビーカーからソリューションをスライスとチャンバーします。
    4. Vibratome のスライス商工会議所と氷のトレイを保護します。
    5. (前部と後部脳) のスライス領域を定義し、250 μ m 厚コロナ スライスをスライスを開始します。推奨パラメーター: 0.10 mm/s、振幅を高速化 2 mm。
    6. 必要な脳領域の適切なサイズにスライスをトリムします。
    7. 30-45 分の 35 ° C でスライスを回復します。地球温暖化のお風呂から回復室を削除回復追加 30 分常温で日の残りのための部屋の温度で保つスライス スライスを許可し、25% 95 %o で常にバブルバスに引き続き CO2.

3. 全体細胞のパッチ ClampRecording

  1. パッチ ピペットをプルします。
    1. ピペットの引き手のマニュアルから記録全体セルの推奨パラメーターを使用して、厚い壁に囲まれたガラスからパッチ ピペット ピペット抵抗 3 5 MΩ を引き出します。
    2. フィルタ リングの内部ソリューションと変らずの商業 (自家製)、塗りつぶしのピペット チップを使用してください。変らず、1 mL の注射器の先端を書き込むし、落ちる作成ヒントを許可するのには、長い罰金がヒントします。
  2. 全体セル構成を取得します。
    1. 電圧クランプ モードで現在スライスのオフセット ピペット上だけ記録ピペットを配置します。ピペットにわずかな肯定的な圧力を適用し、活栓をロックします。
    2. そのまま膜を健全なセルを選択し、ピペットで細胞にアプローチします。肯定的な圧力は、組織 (すなわち組織を入力するときに低速波) のわずかな障害を引き起こす必要があります。
    3. ゆっくりとピペットを形成する細胞の表面の小さなくぼみまで斜めのモーションを使用してセルに近いピペットをもたらし続けます。
    4. 陽圧ロックを解放します。セルは、シールを形成する開始され、1 GΩ 上抵抗が増加します。電圧クランプで-68 でセルを押しながら mV。
    5. 少し斜めに細胞から過剰な圧力を削除するセルから引き抜きます。
    6. 高速と低速のピペット容量を補正します。
    7. ピペット ホルダーのセルを突破し、全細胞構成を取得するに接続されている管を通して簡単な吸引を適用します。
    8. 膜セルモードへの切り替えは、ウィンドウ電気生理学データ集録と解析ソフトウェア (例えば、Clampex) をテストします。
    9. 記録それぞれの電圧クランプ、前に同じソフトウェアを使用して膜テストを実行し、演習帳 (膜抵抗、アクセス抵抗と静電容量) に関連するパラメーターを記録します。
    10. 27 ~ 30 ° C で録音お風呂とその後の実験のため 1.5-2.0 mL/min で流量の温度を維持します。

4. 多様性実験

  1. 実験 1: 推定 4 ap の多重度
    1. 電圧クランプで-68 でセルを押しながら mV。同じソフトウェアを使用して、低 Ca2 +アプライドと一緒にお風呂を灌中に、sEPSCs を記録します。シナプスの活性は、膜の画期的な直後後高可能性があります安定基準記録を確保するため全体セル構成の開始後、少なくとも 5 分の記録。
    2. 4 AP をアプライド、マイクロ ピペットを使用して追加し、風呂は 30 μ M 4 参加レコード sEPSCs における薬物効果が得られる少なくとも 10 分を適用します。
    3. 4 AP とアプライドに 0.5 の TTX μ M と 10 μ M Cd2 +を追加し、少なくとも 10 分間 mEPSCs を記録します。
    4. オフライン解析、ベースライン (低 Ca2 +アプライド) で 4 AP、4 AP アプリケーションの 10 分、TTX アプリケーションの 10 日分の適用直前の最後の 1 分を使用します。
  2. 実験 2: desynchronize 小胞の放出 Sr2 +を使用して
    1. 通常 Ca2 + (風呂アプライドと同じ) アプライド レコード sEPSCs 少なくとも 5 分と一緒にお風呂を灌中。
    2. 通常の Ca2 +アプライドから切り替え、灌 Sr2 +アプライド (から手順 1.4) とレコードの sEPSCs を開始します。
    3. オフライン解析のための小胞同期の放出による大振幅 sEPSCs かどうかをベースライン (通常アプライド) で Sr2 +アプライド アプリケーションの 10回分の最後の 1 分を比較します。
  3. 実験 3: 多胞性のリリースを使用してのテストΓ-武神
    1. 低 Ca2 +アプライド レコード sEPSCs 少なくとも 5 分。
    2. 灌流システムを介してアプライドに 30 μ M 4 AP を追加します。少なくとも 10 分のためのレコード sEPSCs。
    3. 4 AP とアプライドに 200 μ M γ-DGG を追加し、少なくとも 10 分間 sEPSCs を記録します。
    4. 別のセル制御実験の手順 1-3 が適用低濃度 (125 nM) γ 武神ではなく DNQX の。
    5. オフライン解析、各薬物のアプリケーションの最後の分を分析します。
  4. 実験 4: 活動電位発火の増加への求心性入力を刺激します。
    1. 通常 Ca2 +アプライドでレコード sEPSCs。
    2. 10 倍の 20 秒間バースト間隔の 2 s と繰り返しの 20 Hz のレートでアプライドでいっぱいモノポーラ ガラス電極を用いた求心性神経を刺激します。
    3. 分析のため基準として最初の刺激の前に 5,000 の ms を使用、最後の刺激後 10 300 ms と比較し、平均振幅と周波数変動以上 10 試験。

5. 分析

  1. SEPSCs と mEPSCs のプログラムを検出し、分析し、シナプス電流 (例えば、ミニ解析ソフトウェア) を使用して分析します。
    1. このソフトウェアを使用して、AMPA 受容体工 (または抑制電流を記録する場合の GABA 受容体工) を検出するため推奨される検出パラメーターを使用します。
    2. ノンストップの解析関数を使用して、録音に工を検出します。
    3. プログラムは正確に各イベントの検出を確実に各記録を手動でスキャン (例えば、イベントがされていないことを確認逃したまたは 2 回カウント)。
    4. クリップボードにコピーすることによってイベント データをエクスポートし、データ管理ソフトウェア (Excel など) に貼り付けること
    5. 平均周波数/振幅各薬物治療のための計算し、関連性の高い統計解析の実行します。

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結果

上記のプロトコルでは、例としてマウス視床下部ニューロンを用いたシナプスの多様性の度合いを調べる細胞パッチ クランプ電気生理学を使用する方法について説明します。このスライスの準備方法は、腫れ膜または核 (図 1) を持っていない健康な生菌を得られるはず。プロトコルの各ステップは組織や録音の質の健康のために重要です。

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ディスカッション

成功したパッチ クランプ電気生理学実験のための重要な要件の 1 つが健康的なスライス/セルを取得します。ご説明されているプロトコルは、PVN ニューロンを含む視床下部のスライスに最適です。他の脳領域が必要があります変更・ スライス方法21,22,23,24。録音だけ膜抵抗などセルのプロパティ?...

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開示事項

著者がある何も開示するには

謝辞

J. s. は、オンタリオ州の大学院の奨学金を受け取った。ウィスコンシン. は、精神的な健康の研究のカナダから新しい研究者フェローシップを受けた。この作品は、健康の研究 (PJT 148707) 自然科学と工学研究会のカナダ (06106-2015 RGPIN) およびカナダの研究所から W.I に運営費交付金によってサポートされます。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringeBD309659
10 bladeFisher Scientific/others35698
22 bladeVWR/others21909-626
22 μM syringe filtersMilipore09-719-000
Adson forecepsHarvard Instruments72-8547
Angled sharp scissorsHarvard Instruments72-8437
ClampexMolecular DevicespClamp 10
Double edge bladeVWR74-0002
Filter paperSigma/others1001090
Fine paintbrushFisher/various15-183-35/various
Gas Dispersion TubeVWRLG-8680-120
IsofluraneFresenius Kabi/othersM60303
Krazy gluevariousvarious
Mini analysisSynaptosoftMiniAnalysis 6
OsmomoterWescor IncModel 5600
ParafilmSigmaPM-996
Pasteur pipetteVWR14672-200
ph meterMettler ToledoFE20-ATC
Rubber bulbVWR82024-550
Scalpel handle No. 3Harvard Instruments72-8350
Scalpel handle No. 4Harvard Instruments72-8356
Single edge bladeVWR55411-050
Vibratome slicerLeicaVT1200S
Water Purification SystemMilliporeMilli-Q Academic A10
Well plate lidFisher/various07-201-590/various
Chemicals/reagents
4-APSigma275875
BAPTAmolecular probesB1204
CaCl2*2H2OSigmaC7902
CdCl2sigma202908
DNQXTocris189
EGTASigmaE3889
glucoseSigmaG5767
HEPESSigmaH3375
K2-ATPSigmaA8937
KClSigmaP9333
K-gluconateSigmaG4500
MgCl2*6H2OSigmaM2670
Molecular biology grade waterSigmaW4502-1L
Na3GTPSigmaG8877
NaClBioshopSOD001.1
Na-gluconateSigmaS2054
NaH2PO4Sigma71504
NaHCO3SigmaS6014
PicrotoxinsigmaP1675
SrClSigma255521
sucroseBioshopSUC507.1
TTXAlamone LabsT-550
yDGGTocris6729-55-1

参考文献

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