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要約

非アルコール性脂肪性肝炎 (NASH) に対する簡便で信頼性の高い食餌誘発げっ歯類動物モデルについては、特定の高脂肪食の動物及び投与の SPF 以外の住居を通じて達成される。我々は、マウスを環境細菌に曝露することにより、ヒトの免疫学的状態を不在するための肝および脂肪免疫細胞サブセットの同定について述べる。

要約

肥満は、慢性的な低品位の炎症およびインスリン抵抗性と関連しており、2型糖尿病および非アルコール性脂肪性肝炎 (NASH) などの慢性代謝性疾患の罹患率の増加に寄与している。最近の研究では、炎症性免疫細胞が肥満の肥大脂肪組織と肝臓に潜入することを確立しています。代謝恒常性の文脈における免疫細胞の重要性の出現を考えると、2型糖尿病と NASH の発症中にそれらの修飾を定量化し、特徴付けることが重要な必要性がある。しかしながら、ヒト NASH の典型である病態生理学的特徴を誘導する動物モデルはまばらである。

本稿では、非特異的病原体を含まない (HFD) マウスによって確立された NASH の信頼できるマウスモデルにおける肝臓および脂肪組織から分離された免疫細胞サブセットを同定するための詳細なプロトコルを提供する。少なくとも7週間の障壁.我々は、非 SPF 条件でのマウスの取扱い、組織の消化およびマクロファージ、ナチュラルキラー (NK) 細胞、樹状細胞、B および T 細胞サブセットの同定をフローサイトメトリーによって示す。SPF HFD マウスおよび非 SPF マウスからの代表的なフローサイトメトリープロットが提供される。信頼性が高く解釈されたデータを得るためには、抗体の使用、組織消化のための正確かつ正確な方法、およびフローサイトメトリーの実験における適切なゲーティングが不可欠です。

非 SPF 条件でそれらを収容することによって、マウスにおける生理的抗原曝露を回復するための介入および微生物抗原への非特異的暴露は、免疫学的変化の間のリンクを調査するための関連したツールを提供することができ、食餌誘発肥満および関連する長期合併症。

概要

肥満は多因子性障害であり、心臓疾患、脳卒中、非アルコール性脂肪性肝炎 (NASH)、2型糖尿病 (T2D) およびある種の癌を発症する主要な危険因子である。肥満の罹患率は急速に世界的に増加している。今日では、世界の人口の約 30% に21億人が肥満または太り気味の1です。肥満関連インスリン抵抗性は、T2D につながる可能性があり、枯渇した膵島ベータ細胞がグルコースホメオスタシス2を維持するためにインスリンの必要性の増大を補うのに失敗する。

脂肪組織は、脂肪細胞を含む様々な細胞タイプ、内皮細胞、線維芽細胞および免疫セルから構成される。肥満の進行中に、免疫細胞の数および活性の変化は、肥厚性脂肪組織の低悪性度の炎症をもたらす可能性があります3,4.具体的には、過剰なエネルギー摂取が、慢性的に上昇した血糖値、トリグリセリドおよび遊離脂肪酸を伴うことが、脂肪細胞低酸素症、小胞体ストレス、ミトコンドリア機能障害をもたらす、サイトカイン分泌の亢進は、炎症性脂肪免疫細胞5,6の活性化をもたらす。これまでの研究は自然免疫に着目してきましたが、最近では適応免疫細胞 (T 細胞、B 菌) がグルコース恒常性の重要な調節因子として浮上しています。それらは、炎症性 (CD8+ T 細胞、Th1、および B 細胞を含む) または主に調節機能 (調節 T (Treg) 細胞、Th2 細胞を含む) を有し、そしてインスリン抵抗性7、8に対して両方を増悪または保護することができる,9.

さらに、脂肪組織10によるサイトカインの産生増加を含めた肥満が脂肪肝炎を増加させる方法を説明するためのいくつかのメカニズムが提案された。NASH は、先進国における非アルコール性脂肪肝疾患と主要な健康負担の進行性形態であり、組織学的にはバルーン化された肝細胞、脂質蓄積、線維症および pericellular 炎症を特徴とし、進行肝硬変、末期肝疾患または肝細胞癌。いくつかのレジメン (例えばメチオニンおよびコリン欠乏性食餌11) は、非ヒト動物モデルにおいて NASH 様肝病理を誘発することが知られているが、これらのアプローチのほとんどは、nash 及びその代謝のヒト状態を不在しない結果は、それらが特定の遺伝子ノックアウト、非生理的食物操作を必要とするか、またはヒト NASH の典型的なインスリン抵抗性を欠いている。さらに、代謝性疾患の根底にあるメカニズムに関する我々の理解は、現在、標準特定病原体フリー (SPF) 条件下に収容された実験室マウスで行われる実験に基づいている。これらのバリア施設は異常に衛生的であり、人間が遭遇しなければならない微生物の多様性を考慮していないため、動物実験の翻訳プロセスが困難である可能性がある。臨床アプローチ12,13,14です。

ヒトの免疫学的状態を再現する高度なマウスモデルにおけるインスリン抵抗性および NASH の発症中の脂肪組織および肝臓における異なる免疫細胞サブセットを調査するために、マウスを半無菌で個々のケージに収容した障壁のない条件。抗原暴露状態の下に収容されたマウスは、既に15週目の高脂肪食 (HFD) 摂食13の後に NASH 様肝病理を発症した。年齢に一致した SPF マウスと比較して、彼らは macrovesicular 脂肪症、肝浸潤および免疫細胞の活性化を開発しました。

本稿では、マウスの脂肪組織と肝臓からの免疫細胞サブセットを NASH のモデルとして定義・カウントする、頑健なフローサイトメトリー解析について述べる。フローサイトメトリー解析により、RT-PCR または免疫組織化学アプローチとは対照的に、個々の細胞の複数のパラメータを同時に検出することができます。

要約すると、我々の研究は、インスリン抵抗性および NASH の発症を調査するための短期 HFD のマウスモデルと、人間の状態に対しても忠実さを示す基礎的なメカニズムを提供する。

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プロトコル

本研究は、当社の動物愛護・使用委員会の監督下において、国立衛生研究所および動物福祉法の実験動物の診療及び使用に関するガイドに従って実施した。動物のプロトコルは、ドイツのシャリテベルリンの制度的倫理ガイドラインに従って行われ、Landesamt für Gesundheit と Soziales によって承認され、到着ガイドラインに準拠していました。

1. 脂肪性肝炎のダイエット誘発動物モデル

  1. マウス (C57Bl/6J、オス) を4週齢で非 SPF 住宅に移し、広範囲の環境病原体/抗原に対して継続的に暴露する。抗原がこのように空気通路によって配られるように実験動物の毎日の処理によって露出を保証します。
  2. マウス (C57Bl/6J、オス、12週齢) を22° c の温度で 12 h:12 の光/暗サイクル上に従来のフィルターで開いたケージングシステムで維持する。実験的な食事と寝具を照射またはオートクレーブしないでください。マスクまたは通気性なしで動物収容施設にアクセスしてください。動物の部屋の間のドアを開けます。エアワッシャーは使用しないでください。
  3. 抗原が空気通路によって分配されるように定期的に実験動物およびスイッチ部屋の毎日の処理を保証します。実験室のマウスの隣の部屋に収容されている哺乳類の実験動物の寝具からの抗原への毎日の非特異的な微生物曝露で汚れた住宅を補います。
  4. フローサイトメトリー (refefence 13に記載) を使用して、血液および脾臓に CD44-CD62L エフェクターメモリー CD4+および CD8+ T 細胞の比率を測定します。
    注:この点で、我々は、CD8+ t 細胞からのエフェクターメモリ CD8+ t 細胞の 20% の増加を十分な微生物曝露の証拠として定義した。
  5. 開始 HFD (60 の脂肪からの kJ%、19から kj% のタンパク質、および炭水化物からの 21 kj% と、5週間の古い C57Bl/6J 雄マウスで 6% スクロース含量のある水の摂取量は7-15 週。HFD は、実験の過程を通してインスリン抵抗性の発達を誘導するために (前述のように) 脂肪から 60% kJ を含むべきである。
    注:ヘマトキシリンの染色は、肝細胞バルーン、マロリー Denk 体、免疫細胞浸潤および macrovesicular 脂肪症が NASH 様肝病理学を示すものであることが明らかにされるべきである (参考13)。

2. 試薬および溶液の調製

  1. 準備 70% エタノール、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS、カルシウムおよびマグネシウムを含まない) は、0.5% BSA および ACK (アンモニウム-塩化カリウム) 溶解緩衝液を添加した。
  2. 染色バッファー
    1. 10 mL のウシ胎児血清 (FCS) を 500 mL の PBS に溶解し、2% FCS PBS を得た。使用前に氷の上に染色緩衝液を置きます。
    2. 4° c のプラスチックボトルに溶液を保存します。
  3. 脂肪組織消化のためのコラゲナーゼ溶液
    1. 2.5 g のウシ血清アルブミン (BSA) を 500 mL の PBS に溶解し、0.5% BSA/PBS を得た。
    2. 74.5 g の CaCl2を10ml の 0.5% BSA/PBS に溶解し、10 mM CaCl2溶液を得た。
    3. 10 mM CaCl2 PBS で 0.5% BSA の各 mL に 1 mg のコラゲナーゼ II 型 (材料表を参照) を加えます。
    4. 脂肪組織サンプルの g あたり 3 mL のコラゲナーゼ消化液を調製します。各分離のための新鮮なコラゲナーゼ溶液を準備する。
  4. 肝組織消化のためのコラゲナーゼ溶液
    1. 0.5% BSA HBSS を得るために、2.5 g の BSA をハンクのバランス・ソルト・ソリューション (HBSS) の 500 mL に溶かします。
    2. 0.5% BSA/HBSS の 500 mL の FCS 10 mL を加えて、2% FCS 0.5% BSA/HBSS を得ます。
    3. 2% FCS 0.5% BSA/HBSS の各 mL に 0.5 mg のコラゲナーゼタイプ IV (材料表を参照) を加えます。
    4. 追加 0.02 mg DNase あたり 2% FCS 0.5% BSA/HBSS コラゲナーゼ溶液.
    5. 肝臓組織サンプルごとに 13 mL のコラゲナーゼ消化液を調製する。
    6. 各分離のための新鮮なコラゲナーゼ溶液を準備する。

3. 単一細胞懸濁液の生成

  1. 脂肪組織消化
    1. 子宮頸部脱臼に続いて、イソフルラン麻酔による Euthanize マウス。70% のエタノールで胸をスプレーします。慎重に胸膜腔と心臓を露出させるために胸郭の全長に沿って外皮と腹壁を通して5-6 センチ中央切開を行います。
      注:基礎臓器を損傷し、はさみのヒントを維持しないでください。
    2. 26 G 針を用いて左心室の頂点に少なくとも10ml の 0.9% の食塩水を注入する。
      注:正常な灌流は肝臓のブランチングによって認められる。
    3. はさみで腹腔を開き、細かい湾曲したはさみでそれぞれの側に perigonadal 脂肪パッドを切ります。微細な湾曲したはさみで性腺組織を解剖し、脂肪組織を計量します。
    4. はさみを使用して機械的な解離を実行し、4° c でペトリ皿の細かい部分にカット脂肪組織。脂肪組織を 50 mL の円錐形遠心管に移し、0.5% BSA/PBS で1ml のペトリ皿をすすぎます。
    5. 脂肪組織の1グラムあたり (ステップ2.3 で調製したように) 3 mL の脂肪組織ダイジェスト溶液を加えます。穏やかな動揺 (200 の rpm) の下の37° c で20分のための脂肪組織の解決をインキュベートしなさい。
    6. 脂肪組織の1グラムあたり 0.5% BSA/PBS の 5 mL を追加し、氷の上に置きます。10ml の血清学的ピペットで溶液を何度も Triturate し、プランジャーを使用してストレーナー (100 μ m) を通過させる。
    7. 500 x gで、4° c で10分間遠心します。
    8. ピペッティングによって、浮動脂肪細胞を削除します。細胞ペレット (間質血管分画) を 1 mL の ACK 溶解バッファーに再懸濁 (材料の表参照)。2% FCS PBS の10ml を追加します。
    9. 500 x gで、4° c で10分間遠心します。
    10. デカントの上清および再懸濁細胞ペレットを 2% FCS PBS の250μ l で培養した。
    11. トリパン青の除外を使用して、血球計数器上の実行可能なセルの数をカウントします。
  2. 肝組織消化
    1. 肝臓を PBS で満たした円錐状の遠心管に保管し、氷上で輸送します。
    2. 4° c のシャーレにシリンジを使用して機械的な解離を行います。10 mL の温かい肝消化液を含む 50 mL の円錐形遠心管に肝臓組織を切開して入れます。3 mL の肝臓ダイジェスト溶液でペトリ皿をすすいでください。
    3. 穏やかな動揺 (200 rpm) の下の20分の37° c で肝臓ティッシュの解決をインキュベートしなさい。
    4. 20 mL の HBSS を加えます。10ml の血清学的ピペットで溶液を何度も Triturate し、プランジャーを使用してストレーナー (100 μ m) を通過させる。
    5. 500 x gで、4° c で10分間遠心します。デカントを再懸濁し、細胞ペレットを20ml の HBSS で培養する。
    6. 室温で1分間 30 x g で遠心分離し、肝細胞マトリクスを除去します。細胞ペレットを廃棄する。
    7. 上清を4° c で10分間 500 x gで遠心分離します。再懸濁は、ペレットを 33% の低粘度密度勾配培地溶液 (材料の表を参照) に次いで遠心分離 (800 x g; 30 分; 室温; ブレーキなし) で行います。
    8. 再懸濁は、1 mL の ACK 溶解バッファーにペレットを使用し、室温で4分間インキュベートします。その後、10 mL の HBSS を加えます。
      注:上清を廃棄するには、interphase (肝細胞) で上清を吸引し、転写ピペットで非常に注意深く (可能な限り、免疫細胞および赤血球でペレットを取ることなく)。
    9. 15 mL の円錐形の遠心管で30μ m のストレーナーを通して細胞を渡し、4° c で10分間 500 x gで遠心分離します。デカントの上清および再懸濁細胞ペレットを 2% FCS PBS の250μ l で培養した。
    10. トリパン青の除外を使用して、血球計数器上の実行可能なセルの数をカウントします。

4. 表面染色

  1. T 細胞サブセット (パネル 1) および先天性免疫細胞 (パネル 2) についての抗体ミックスを、表 1および表 2に記載されているように調製する。容積は抗体の集中に関して1つのサンプル (100 μ l) のために最大限に使用される。
    注:リンパ球および自然免疫細胞は、自己蛍光の違いを提示し、別々に分析されるべきである。
  2. 表面染色用ポリスチレン FACS チューブで、100μ l で最大 3 x 106 個の細胞を使用します。Fc 受容体をブロックするために、抗 CD16/CD32 抗体を10μ l 添加し (1:100 希釈)、氷上で10分間インキュベートする。未染色ネガティブコントロールサンプルを使用して、側方散布 (SSC) と前方散乱 (FSC) を調整し、負のセル母集団の位置を特定します。
  3. 、パネル1およびパネル2に対して適切な量の抗体混合物をボルテックスして添加する。生と死の細胞弁別を可能にするために、各サンプルに1μ l の生存色素を加えます。4° c で20分間インキュベートし、光から保護します。
  4. 2 mL の 2% FCS PBS で2回洗浄し、4° c で 300 x gで5分間遠心分離します。
  5. 細胞ペレットを 2% FCS PBS 中の300μ l に再懸濁し、4° c で FACS 分析まで保存する。
    注:30μ m 細胞ストレーナーを通して測定通過細胞をポリスチレン FACS チューブとボルテックスに開始する前。フローサイトメトリーは、4° c で 2% FCS PBS に保存された標識細胞を用いて 1-3 h で行った。細胞は、最適化された結果を可能な限り早く分析する必要があります。

5. フローサイトメトリーの補償、取得、ゲーティング

  1. 未染色ネガティブコントロールサンプルを実行して、フローサイトメーターの FSC および SSC および調整電圧を設定し、潜血の集団を検出し、破片と生存細胞を区別します。破片や死んだ細胞を除外します。
    注:肝臓からの細胞懸濁液の生存率は、追加の密度分離ステップによる perigonadal 脂肪組織からの細胞懸濁液からの生存率よりも低い可能性がある。
  2. 多色補正用の単一染色制御サンプルを実行します。
    注:抗体捕捉ビーズは、関心のある細胞集団の細胞数が低すぎて細胞を使用して補うことができない場合に、スペクトルオーバーラップを調整するために使用することもできる。細胞の可能な自己蛍光シグナルを検出するために、全ての抗体について1つの (FMO) コントロールを使用することが推奨されるが、このプロトコルでは適用されなかった。
  3. 測定を開始し、適切な数のイベント (少なくとも5万イベント) を収集し、実験データを記録します。
  4. 分析のための FCS データ・ファイルをエクスポートし、ゲーティング戦略を設定します。CD45+分流上のゲートは、その後の細胞集団を同定する。

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結果

記載されているプロトコルにより、食餌誘導 NASH のモデルにおいてマウス perigonadal 脂肪組織と肝臓から分離した先天性および適応免疫細胞の表面マーカーの特徴付けが可能になる。このモデルでは、HFD の投与によって NASH が誘導されたが、スクロース (6%)C57Bl/6J マウスにおいて7〜15週間の飲用水において、以前に報告されたように13.重要なことに、マウスは半無菌状態で収...

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ディスカッション

脂肪性肝炎は、肥満、インスリン抵抗性および脂質異常症15などの代謝異常との強い関連を有する。複数の研究は、脂肪組織の炎症は、先天性および適応免疫系の両方の細胞の変化したレベルを含む2型糖尿病の病因を駆動することができることを示しています4,5,16,17.さらに、肥...

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開示事項

作者は何も開示することはありません。

謝辞

学 Jurisch、ダイアナ Woellner、キャスリンウィッテとコーネリア・ヘックマンは、ゲーティング戦略に関する有用なコメントを Tiburzy からの実験的な手順とベンジャミン・ Biolegend の支援のために感謝しています。J.S. は、ヘルムホルツ許可 (ICEMED) によって支持されました。この研究は、ベルリン健康研究所 (ボスニア・ヘルツェゴビナ)、ドイツ連邦教育研究省とアインシュタイン財団の「BCRT」の臨床研究ユニットからの助成金によって支援されました。K.S.-B.そして、h. D.V. は FOR2165 によって賄われています。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
100 µm cell strainers Falcon352340
1 mL syringe BD  309659
26 G x 5/8 needles BD 305115
35 mm Petri Dishes Falcon353001
40 µm cell strainers Falcon352340
ACK lysis buffer GIBCOA1049201
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45Biolegend 103127AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127)
Analysis software FlowJo 10.0.8 software
APC anti-mouse CD11c AntibodyBiolegend 117309AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309)
APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) AntibodyBiolegend 138411AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411)
BV421 anti-mouse CD127 AntibodyBiolegend 135023AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023)
BV421 anti-mouse F4/80 AntibodyBiolegend 123131AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131)
BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) AntibodyBiolegend 135219AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219)
BV605 anti-mouse NK-1.1 AntibodyBiolegend 108739AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739)
BV650 anti-mouse/human CD11b AntibodyBiolegend 101239AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239)
BV711 anti-mouse/human B220 AntibodyBiolegend 103255AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255)
BV785 anti-mouse CD8a AntibodyBiolegend 100749AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749)
C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old Forschungseinrichtungen für experimentelle Medizin (FEM)
CaCl2 Charité - Universitätsmedizin BerlinA119.1 
Collagenase NB 4G Proved Grade SERVA 11427513
Collagenase Typ I Worthington LS004197
Conical centrifuge tube 15mL Falcon352096
Conical centrifuge tube 50 mL Falcon352070
DNAse  Sigma-Aldrich 4716728001
Fetal bovine serum BiochromS0115
Filter 30µm Celltrics 400422316
FITC anti-mouse CD3 AntibodyBiolegend 100203AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203)
Flow cytometry BD-LSR Fortessa 
Forceps Sigma-Aldrich F4142-1EA
HBSS Bioanalytic GmBH 085021-0500 
High-fat diet SSNIFE15741–34 60 kJ% from fat, 19 kJ% from proteins, and 21 kJ% from carbohydrates
micro dissecting scissors Sigma-Aldrich S3146used for dissection purposes 
PE anti-mouse CD25 AntibodyBiolegend 101903AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903)
PE/Cy7 anti-mouse CD62L AntibodyBiolegend 104417AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417)
PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) AntibodyBiolegend 107629AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629)
PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 AntibodyBiolegend 100565AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565)
Percoll solution BiochromL6115
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 AntibodyBiolegend 103031AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031)
PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 AntibodyBiolegend 108427AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427)
Phosphate buffered saline Gibco12559069
Round-Bottom Tubes with cell strainer capSTEMCELL Technologies 38030
TruStain fcX anti-mouse CD16/32Biolegend 101301AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301)
Trypan Blue Sigma-Aldrich T6146
Zombie NIR Fixable Viability KitBiolegend 423105viablity stain 

参考文献

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