イメージング インテグリン張力と細胞の力でサブミクロン解像度統合テンション センサーで

要約

インテグリンの緊張は、様々 な細胞機能に重要な役割を果たしています。統合テンション センサーとインテグリンの緊張はピコニュートン (pN) 感度を校正、サブミクロンの分解能でイメージします。

要約

インテグリン ・ リガンド結合によって送信される分子の緊張は、多くの細胞機能や行動に重要な役割を果たしているインテグリン経路で基本的な機械的信号です。調整し、高いフォース感度と空間分解能とインテグリン緊張のイメージに統合張力センサー (ITS)、DNA ベースの蛍光張力センサーを開発しました。ITS はこうして力を分子レベルで蛍光シグナルに変換する蛍光分子の張力を維持する場合にアクティブになります。その活性化のため緊張のしきい値は 10-60 pN も細胞のインテグリン緊張のダイナミック レンジをカバーするの範囲で可変です。ITS をグラフトした基板、付着細胞のインテグリン緊張は蛍光で可視化したし、サブミクロンの分解能で撮像します。ITS は生きているセルの固定セル セル構造のイメージングと互換性も。ITS は、血小板の収縮や細胞遊走の研究に正常に適用されています。本稿は、合成およびインテグリン転送細胞力における ITS のアプリケーションの手順を詳しく説明します。

概要

細胞は付着細胞外マトリックスへの細胞力を発揮してインテグリンに依存します。インテグリンを介した細胞接着および力伝達は拡散^1,2移行^3,4存続^5,6,7セルのために重要です。長期、インテグリン生体シグナルも細胞増殖^8,9,10と分化^11,12を影響します。測定する様々 な方法が開発されて、細胞マトリックス界面強制的にマップ インテグリン送信携帯。これらのメソッドは、弾性下地¹³に基づいて、配列 micropost¹⁴、または原子力の顕微鏡 (AFM)^15,16。弾性下地および micropost メソッドは、細胞ストレスを報告し、空間分解能の点で限界がある強制的に感度の基板の変形に依存します。原子間力顕微鏡、高感度化、しかし、それは同時に複数のスポットで力を検出できない、インテグリンによって送信される細胞力をマップし難い。

近年、分子レベルで細胞の力を研究するいくつかの技術を開発しました。ポリエチレング リコール^17,18、スパイダー シルク ペプチド¹⁹、および DNA^20,21,22,23に基づく分子張力センサーのコレクションが開発されました。可視化し、分子蛋白質によって送信される張力を監視します。これらの技術の間で張力で合成素材ゲージ テザー (TGT) 生きているセル^22,24のインテグリン緊張の上限値を調節する破裂可能なリンカーとして DNA は初採用。その後、DNA と蛍光共鳴伝送結合されたヘアピン DNA ベースの蛍光張力検出器を作成する最初 chen's グループ²³と Salaita のグループ²⁰。ヘアピン DNA を用いた張力センサー レポートをリアルタイムでインテグリン張力と細胞機能²¹の一連の研究に正常に適用されています。その後、Wang の実験室はレポート インテグリン緊張する fluorophore クェンチャーのペアと TGT を組み合わせます。このセンサーは、その^25,26という名前です。ITS は、二本鎖 DNA (dsDNA) に基づいており、インテグリン張力調整の広いダイナミック レンジ (10-60 pN)。ヘアピン DNA ベースのセンサーと対照をなして ITS リアルタイム細胞力を報告しないが、細胞力のフット プリントとして歴史的なインテグリンのすべてのイベントを記録この信号蓄積プロセスは、イメージング、それに実行可能なイメージの細胞力をローエンドの蛍光顕微鏡とも細胞の力の感度を向上させます。ITS の合成は、2 つの単一座礁させた Dna (ssDNA) を交配させることによって作成されるそれより比較的便利です。

ITS は、インテグリン ペプチド配位子 (図 1) 共役環状 arginylglycylaspartic 酸 (RGD) ペプチド²⁸クェンチャー (ブラック ホール クェンチャー 2 [BHQ2])²⁷日、fluorophore ビオチン 18 ベース ペア dsDNA です。蛍光体と下の鎖を共役 (Cy3 cy5 の組合せまたは Alexa の系列などの他の染料は、ながら、この原稿で使用されて、また私たちの研究室で可能であるが証明されている) と、ITS がビオチン-アビジン結合によって基板に固定化ビオチン タグ。上部のストランドは、RGD ペプチドと約 98% 焼入効率^26,と²⁷Cy3 を消光するブラック ホール クェンチャー共役です。本稿で提示されたプロトコル、その基板上のコーティングの密度は 1,100/μ m²の周り。これは、我々 は以前次の同じプロトコル²⁹をコーティングを施した neutrAvidin 修飾基板上 18 bp ビオチン dsDNA のキャリブレーション密度です。セルは、ITS でコーティングされた基板に付着、インテグリンは RGD を ITS をバインドし、ITS に緊張を送信します。ITS は、機械的に 2 s²²内 ITS の dsDNA を分ける緊張しきい値として定義されている特定の緊張耐性 (T_許容差) を持ちます。インテグリンの緊張によってその破壊はその後蛍光を発する色素から、クェンチャーの分離に します。結果として、目に見えないインテグリン緊張が蛍光信号に変換され、蛍光イメージングによる細胞力をマップできます。

ITS の適用を示すためには、魚ケラトサイトここ、セル移行研究^30,31,32の広く使われている細胞モデル、CHO ‐ K1 セル、一般的に使用される非運動性細胞および NIH 3T3 繊維芽細胞を使用します。インテグリンの張力と細胞の構造の coimaging も行われています。

プロトコル

ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC、8-16-8333-I) アイオワ州立大学によって承認されています。

1. 統合張力センサーの合成

1. カスタマイズして、見出された環状 Ssdna (材料の表を参照) を注文します。
   注: 一本鎖 Dna シーケンスは次のとおりです。上の鎖は/5ThioMC6-D/GGG AGG ACG CAG CGG GCC/3BHQ_2/です。下の鎖は次のとおりです。
   12 pN ITS: GGC CCG CTG CGT CCT CCC/3Bio//5Cy3/
   23 pN ITS: GGC CCG CTG CGT CC/iBiodT//5Cy3/CCC
   33 pN ITS:/5Cy3/GGC CCG CTG CG/iBiodT/CCT CCC
   43 pN ITS:/5Cy3/GGC CCG C/iBiodT/G CGT CCT CCC
   54 pN ITS:/5Biosg//iCy3/GGC CCG CTG CGT CCT CCC
   ここでは、/5ThioMC6-D/5' 端にチオール修飾 C6 S (ジスルフィド結合) を表します。/3BHQ_2/は、3' 末端にブラック ホールを癒す 2 を表します。/3Bio/5Biosg/と/iBiodT/は、それぞれ内部の DNA のチミン、最後に 3'、5' 端、ビオチン化です。/iCy3/は、ssDNA の内部バックボーンに挿入される Cy3 を表します。これらのコードはここで使用される特定の商業製造業者によって使用され、他の DNA の会社で異なる場合があります。
2. SH ssDNA クェンチャーに共役 RGD ペプチド。
   注: 使用する試薬は、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、sulfosuccinimidyl 4-(N maleimidomethyl) シクロヘキサン-1-カルボン酸 (スルホ SMCC)、RGD ペプチドとトリス - 2 カルボキシエチルリジン ホスフィン塩酸塩として知られている TCEP HCl。
   1. TCEP 溶液を用いた上部鎖 DNA のチオール修飾を deprotect します。
      注: 商業ソースから注文したチオール修飾 Dna は、RGD DNA 活用前に減らす必要があるジスルフィド結合によって保護されて硫黄原子の酸化型で出荷されます。TCEP はチオールの脱保護に使用される無臭化試薬です。
      1. 水の 300 μ L で TCEP HCl の 14.3 mg を溶解します。PH 試験紙を使用して ~7.2–7.4 に 1 M 水酸化ナトリウム溶液 (約 150 μ L) の TCEP 溶液の pH を調整します。0.5 mL の最終巻を作るために純粋な水を追加します。最終的な TCEP 濃度は 100 mM です。
         注: 新鮮な DNA チオール脱保護について毎回 TCEP ソリューションを確認することをお勧めします。長い間 TCEP ソリューションをストッキングは避けてください。
      2. TCEP ソリューションに 0.5 M エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) 溶液を 100 μ l 添加し、水を 400 μ L を追加します。
      3. TCEP + EDTA 溶液 10 μ L を 1 mM チオール-DNA-BHQ2 PBS での 20 μ L に追加します。解決策は室温で 30 分間反応をみましょう。
         注: チオール修飾 5' この ssDNA の C6 S 活用のジスルフィド結合は、チオール グループを次の手順でマレイミドと反応の準備ができて出て TCEP によって裂かれます。次のチオール マレイミド反応; と、TCEP が干渉しません。したがって、このステップの後 TCEP をパッシベーションする必要はありません。
   2. RGD NH₂スルホ SMCC を共役します。
      1. RGD NH₂の 11 mM RGD NH₂を取得する PBS 100 μ L に 5 mg を溶解します。
      2. 2 mg スルホ SMCC (製造業者によって構内) の管に純粋な水の 200 μ L を追加します。ピペット チップとスルホ SMCC 固体を粉砕し、積極的に水の中 SMCC の溶解を容易にする同時にピペットします。スルホ SMCC の濃度は 23 mM になります。
         注: スルホ SMCC の NHS エステル加水分解される、数分の寿命を持つためこの溶解手順は NHS エステル加水分解のための過剰な損失を避けるために 1 分以内完了する必要があります。PBS または他のバッファーに溶解性が悪いために、スルホ SMCC を解消するためには、純粋な水を使用します。
      3. 100 μ L RGD NH₂ソリューションにスルホ SMCC 溶液 40 μ L を追加し、20 分間インキュベートします。
         注: スルホ SMCC の NHS エステル RGD とスルホ SMCC リンク RGD NH₂、アミド結合を形成アミン グループと反応します。
   3. SH-ssDNA-クェンチャーの RGD SMCC を共役します。
      1. 1.2.1、1.2.2 の手順で準備ソリューションを混合し、室温で 1 h の混合物を孵化させなさい。4 ° C で冷蔵庫をソリューションに移動、さらに一晩反応します。上部鎖 DNA の共役チオールはスルホ-SMCC 上部本鎖 DNA を持つ RGD をリンクによるチオエーテル グループ形成のマレイミドと反応します。
   4. TCEP、RGD、未反応スルホ SMCC RGD ssDNA クェンチャーを浄化するためにエタノールの沈殿物を実行します。
      1. 少なくとも 30 分-20 ° C のフリーザーで 15 mL の円錐管の 100% エタノール 10 mL を冷やします。
      2. 3 M 塩化ナトリウム水溶液、DNA 溶液と冷やしたエタノール 1:10:25 の容積比で混ぜます。混合液を 30 分間または DNA を沈殿するまで-20 ° C のフリーザーにおいて。
      3. 30 分間遠心 10,000 × gで液体は、上澄みを廃棄します。
      4. DNA の餌に PBS を追加します。分析器を用いた DNA 濃度を測定します。
   5. (省略可能)高い RGD ssDNA 純度を得るために DNA を電気泳動を行います。
      注: 上記プロトコルを使って ssDNA の約 70%-90% は RGD と共役します。高い純度が要求される場合、非 DNA から共役 DNA を分離するもこの DNA 電気泳動を実行できます。
      1. 垂直電気泳動システムを組み立てます。
      2. 純粋な水、40% アクリルアミド ゲル、tris ホウ酸 EDTA (TBE) バッファー x 10 の 8 mL、10% 過硫酸アンモニウム (AP) の 800 μ L の 20 mL 50 mL を混ぜて 10% ポリアクリルアミド ゲル溶液を準備します。
      3. テトラメチルエチレンジアミン (TEMED) の 80 μ L をゲル ソリューションに追加します。電気泳動システムのガラス容器に溶液を注ぐ。ゲルの上に井戸を作成する単一ウェル櫛を挿入します。ゲルは架橋まで 10 分間待機します。
      4. DNA 溶液を 1:1 の容積比で 100% グリセリンに混ぜてください。櫛を削除してもゲルに DNA ソリューションを読み込みます。
      5. 電圧 200 v. 観察 2 DNA バンド 1 つ遅れ、共役 DNA ゲルを実行します。
      6. 共役 dna ゲルのバンドを切って、小さな断片にサイコロします。
      7. フィルターと 2 つの 1.5 mL 遠心チューブにさいの目に切られたゲルを収集します。各チューブに 500 μ L の PBS を追加します。
      8. 1 日常温で暗いところで PBS 浸したゲルを置きます。DNA は、PBS にゲル部分から拡散します。
      9. 2 分間 1,000 x gでチューブを遠心分離で DNA ソリューションを収集します。
      10. エタノールの沈殿物 (ステップ 1.2.4) DNA を収集するための別のラウンドを実行します。
3. RGD ssDNA クェンチャーと色素 ssDNA ビオチンを交配させることによって、ITS を合成します。
   1. 上の鎖と 1.1: 1 のモル比で低い鎖 Dna ソリューションをミックスします。4 ° C で DNA ハイブリダイゼーションによる ITS を生成するために一晩の混合物をしてください。
      注: DNA の交配のため 1.1: 1 のモル比が 1:1 の代わりに使用されます。過度の RGD-ssDNA クェンチャーを使うことですべて色素 ssDNA-ビオチン、RGD ssDNA クェンチャーと交配させること。RGD ssDNA-クェンチャー交配なしは、その表面の塗装品質は影響しません表面コーティング中に洗浄されます。
   2. 因数と長期保管のための-20 ° C で ITS ソリューション ストア。
      注: ストレージ バッファーは、PBS とストレージ濃度が 10 μ M 以上になるはず。定期的な使用を顕著な品質劣化することがなく、数週間、4 ° C でそのソリューションを格納できます。

2. ガラス底ペトリ皿上の ITS を固定化してその表面の準備

注: 使用する試薬は、ビオチン化牛血清アルブミン (BSA ビオチン)、アビジン タンパク質と。すべての試薬、氷のバケツに氷の上約 0 の ° C に PBS バッファーを冷やします。

1. 0.1 mg/ml BSA ビオチン PBS でガラス底シャーレ (直径 14 mm も 29 mm) の井戸に 200 μ L をロードします。それを冷蔵庫で 4 ° C で 30 分間インキュベートします。BSA ビオチンは物理的にガラス表面に吸着しました。
2. ピペットを使用して、ソリューションを吸うし、200 μ L の PBS を表面を洗浄する井戸に追加します。この 3 倍、洗濯を完了するを繰り返します。
3. 4 ° C で 30 分間よく 50 μ G/ml アビジン蛋白質の 200 μ L をインキュベートします。それを洗う PBS の 3 倍。この手順の後アビジン蛋白質は BSA ビオチンにバインドし、ガラス表面に離れなくなります。
4. 0.1 μ M に 4 ° C で 30 分間も ITS の 200 μ L をインキュベートします。PBS の 3 倍が付いている皿を洗ってください。セルめっきまで井戸の PBS を残します。この手順の後ビオチン タグとそのアビジン タンパク質に結合し、表面に離れなくなります。
   注: その塗装品質とその固定化の間に同質性の重要な 1 つの予防は決してペトリ皿表面を乾燥をさせることです。4 ° C または洗浄のステップの間に水の蒸発量を抑える氷バケットにより氷に 0 ° C 前後ですべての試薬と PBS を維持、とき PBS が引き出される井戸から。

3 その表面にセルめっき

1. 文化魚実質細胞。
   注: ここでは、金魚 (キンギョ) などとして使用されますが、他の魚種も正常に動作します。
   1. フラット チップ ピンセットを持った魚類から魚のウロコの部分を摘み取る。連絡、ガラス スケールの内側もグラスボトム ・ シャーレの上にスケール優しく押してください。〜 30 を待つ皿のガラス表面によく付着する魚のウロコの s。
   2. Iscove の 1 mL ダルベッコ媒体 (IMDM) 完全培地魚のウロコを完全にカバーするために変更を追加します。室温で 6-48 h の暗くて湿気のあるボックスでペトリ皿を維持します。
      注: IMDM 完全培地には、79 %imdm + 20% 牛胎児血清 (FBS) 1% ペニシリンが含まれています。酸素や CO₂の余分な供給は不要です。水に浸したいくつかティッシュ ペーパー ロールは、ボックスで高湿度を維持するために箱に残ってすることができます。魚実質細胞は数時間後の細胞シートとして魚のウロコから移行されます。これは培養顕微鏡で観察することができます。セルは、一般的に 48 時間で実行可能です。
2. 外し、その表面に実質細胞細胞をプレートします。
   1. 魚のウロコを培養したシャーレからメディアを削除します。ソリューションをデタッチされているセルも 1 x を洗浄し、魚のウロコをカバーし、3 分間インキュベート デタッチ ソリューションを追加します。
      注: EDTA 溶液をデタッチ セルのレシピのとおりです: 10 x ・ ハンクスのバランスの取れた塩ソリューション (HBSS) + 1 M HEPES (pH 7.6) の 10 mL を 100 mL + 10 mL 炭酸水素ナトリウム 7.5% の + 500 ミリメートルの EDTA + H₂o. の 1 L の 2.4 mLPH を 7.4 に調整します。
   2. ソリューションをデタッチすべての細胞を吸い出す、IMDM 完全培地を追加します。穏やかなピペッティングにより、実質細胞を分散させます。必要なレベル (1 × 10⁴– 1 × 10⁵/mL) 細胞液の濃度を調整します。(セクション 2 によると準備) その表面の細胞をプレートします。細胞イメージングの前に 30 分間室温で孵化させなさい。
      注: ソリューションをデタッチとセルをデタッチ後診断を実行できますセルを数えます。実質細胞があるたくさんの移行する表面積、密度をめっきセルは比較的低いです。
3. プレート CHO ‐ K1 細胞とその表面に NIH 3T3 細胞。
   注: CHO ‐ K1 細胞用培地は 89% ハム f12 キー + 10 %fbs + 1% ペニシリンです。NIH 3T3 細胞用培地は、89% ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) + 10% ウシ血清 (CBS) + 1% ペニシリン。培養条件が 37 ° C および 5% の CO_{2 です}。
   1. 培養 CHO ‐ K1 細胞、またはペトリ皿 (または培養用フラスコ) 80-100% 合流する NIH 3T3 細胞。
   2. 細胞液と培養液を 37 ° C をデタッチをウォーム アップします。
   3. ピペットでシャーレの培地すべてを削除します。洗浄セル 1 x 携帯ソリューションをデタッチします。ソリューションをデタッチとセルをカバーし、10 分の 37 ° C でそれを孵化させなさい。
   4. ピペッティングにより細胞を分散させます。携帯ソリューションを収集し、3 分間 300 × gで遠心分離機します。
   5. 上清を吸い出すし、完全培地または無血清培地を追加します。
   6. 必要なレベル (1 x 10⁵ -1 × 10⁶/mL) 細胞液の濃度を調整します。(セクション 2 によると準備) その表面の細胞をプレートします。録画前にイメージング、または 30 分前に 1-2 h を 37 ° C でセルを孵化させなさい。

4. イメージング、ビデオ録画とリアルタイム インテグリン テンション マッピング

1. 生きた細胞のインテグリン緊張した準リアルタイム イメージング
   1. 室温で 30 分間 (セクション 2 に基づき)、その表面に実質細胞を孵化させなさいまたは CHO ‐ K1 細胞または NIH 3T3 細胞 37 ° C でインキュベーターでその表面上で 1 時間インキュベート
   2. 蛍光顕微鏡のステージにペトリ皿をマウントします。1 の露光時間で細胞力イメージングを実行 s。倍率は 40 倍または 100 倍です。
   3. 20 のフレーム間隔でその画像のビデオを取る実質細胞、または CHO ‐ K1 細胞や NIH 3T3 細胞の 1-2 分の s。
   4. MATLAB または別の画像解析ツールを使用して、最新のフレーム間隔で新しく生成される周波数を計算する現在のフレームからそのビデオの前のフレームを減算します。新しく作り出されたその信号は、蘆準リアルタイムの方法で細胞の力をそれにより報告最新のフレーム間隔で生成されたインテグリン緊張を表しています。
2. インテグリン緊張と immunostained 細胞における細胞構造の coimaging
   1. 3.2.2 のステップ、ステップ 3.3.6 ターゲット構造蛋白質をマークする免疫染色を実行します。
      注: は、インテグリン緊張イメージングと細胞構造のイメージングと蛍光クロストークを回避するのに別の染料を使用します。本稿では、Cy5 蛍光ファロイジンの使用された、アレクサ 488 ビンキュリンの汚損のため使用されました。一次および二次抗体の濃度が 2.5 μ g/mL です。ファロイジンの濃度は 1.5 単位/μ L です。
   2. Multifluorescent チャネル イメージング インテグリン緊張マップと細胞構造イメージングの両方を取得するを実行します。

結果

ITS、魚の実質細胞のインテグリン緊張マップを攻略しました。それは、角化移行し、(図 2 a) 2 つの力のトラックでは、インテグリン緊張を生成することを示しています。力マップの解像度は、0.4 μ m (図 2 b) に調整されました。後部の縁 (図 3 a) 高インテグリン張力が集中しています。ITS は、別のセル...

ディスカッション

ITS は、まだ携帯電話の強力な技術力の合成とアプリケーションの両方の面でマッピングにアクセスが可能です。すべての材料は準備ができて、1 日以内に ITS を合成できます。実験中にセル メッキ前に表面コーティングの 3 つの手順が必要です。最近では、我々 はさらに ITS にウシの血清アルブミンをガラスまたはポリスチレン表面³³ITS の直接の物理的な吸着を可能にする?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA-biotin	Sigma-Aldrich	A8549
Neutravidin	Thermo Fisher Scientific	31000
Streptavidin	Thermo Fisher Scientific	434301
upper strand DNA	Integrated DNA Technologies	N/A	Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section
lower strand DNA	Integrated DNA Technologies	N/A	Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section.
sulfo-SMCC	Thermo Fisher Scientific	A39268
Cyclic peptide RGD with an amine group	Peptides International	PCI-3696-PI
IMDM	ATCC	‎62996227
FBS	ATCC	302020
Penicillin	gibco	15140122
TCEP	Sigma-Aldrich	C4706
200 uL petri dish	Cellvis	D29-14-1.5-N
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	N/A	spectrometer
SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit	Hoefer	SE410-15-1.5	Device for electroporesis
CHO-K1 cell line	ATCC	CCL-61
NIH/3T3 cell line	ATCC	CRL-1658
Anti-Vinculin Antibody	EMD Millipore	90227	Primary antibody for vinculin immunostaining
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A28175	Secondary antibody for vinculin immunostaining
Alexa Fluor 647 Phalloidin	Invitrogen	A22287
Eclipse Ti	Nikon	N/A	microscope