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要約

我々は、巨大な小胞(GV)内の細菌の単細胞培養を実証する。細菌細胞を含むGVは液滴転写法により調製し、ガラス基板上の支持膜上に固定化し、細菌増殖を直接観察した。このアプローチは、他の細胞にも適応可能である。

要約

我々は、巨大小胞(GV)内の単細胞レベルで細菌細胞を培養する方法を開発した。細菌細胞培養は、自然環境における細菌細胞の機能を理解するために重要である。技術の進歩により、限られた空間内の単細胞レベルで様々な細菌細胞機能が明らかになります。GVは、親和性脂質分子からなる球状の微小サイズのコンパートメントで、細胞を含む様々な材料を保持することができます。本研究では、液滴転写法により10~30μm GVに単一の細菌細胞を封入し、細菌細胞を含むGVをガラス基板上の支持膜上に固定化した。本手法は、GV内の単一細菌のリアルタイム増殖を観察するのに有用である。大腸菌(大腸菌)細胞をGV内のモデルとして培養したが、この方法は他の細胞型に適応できる。微生物学、生物学、バイオテクノロジー、合成生物学の科学・産業分野で活用できます。

概要

単細胞レベルでの細菌細胞の培養が注目を集めています。限られた空間内の単細胞レベルで細菌細胞を培養すると、表現型変動性1、2、3、4、細胞挙動5などの細菌機能を解明できる。6,7,8,9、および抗生物質耐性10、11。近年の培養技術の進歩により、単一細菌の培養は、ウェルチップ4、7、8、ゲル液滴12、13などの限られた空間内で達成することができる。、および水中油(W/O)液滴5、11.単一細菌細胞の理解や利用を促進するためには、栽培技術のさらなる技術開発が必要である。

生体細胞膜を模倣する小胞は、両生類分子からなる球状の区画であり、様々な物質を保持することができる。小胞はサイズに応じて分類され、小さな小胞(SV、直径<100 nm)、大きな小胞(NEV、<1 μm)、および巨大な小胞(GV、>1 μm)が含まれます。SVまたはNEVは、生体細胞膜14に対する親和性のために薬物担体として一般的に使用される。GVは、原始電池15または人工細胞16の構築のための原子炉システムとしても使用されている。生体細胞をGVに封入すると17、18、したがってGVは、反応器系と組み合わせると細胞培養システムとしての可能性を示す。

ここでは、実験手順のビデオと共に、GVを新規細胞培養器19として使用する方法について説明する。細菌を含むGVは、液滴転写方法20により作製され、次いでカバーガラス上の支持膜上に固定化した。このシステムを用いて、GV内部の単細胞レベルで細菌の増殖をリアルタイムで観察した。

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プロトコル

1. 液滴転写法による細菌細胞を含むGVの調製

  1. 1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC、 10 mM、1 mL)および1,2-ジステアロイル-snグリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[ビオチニル(ポリエチルネグリコール)-2000](ビオチン-PEG-DSPE、0.1mM、1mL)メタノール溶液(2/1、v/v)を保存し、-20°Cで在庫を保存します。
  2. 脂質含有油溶液の調製
    1. POPC溶液の20μLとビオチン-PEG-DSPE溶液の4μLをガラス管に注ぎます(図1b(i)))。
    2. 空気の流れによって有機溶媒を蒸発させ、脂質フィルムを形成し、フィルムを1時間のデシケータに入れ、有機溶媒を完全に蒸発させる(図1b(ii)))。
      注:ヒュームフード内の有機溶媒を蒸発させる必要があります。
    3. ガラスバイアルに200μLの鉱物油(0.84g/mL、材料の表)をガラスバイアルに加えます(図1b(iii)))。
    4. ガラスバイアルの開口部をフィルムで包み、超音波浴(120W)で少なくとも1時間(図1b(iii))で超音波処理します。POPCおよびビオチン-PEG-DSPEの最終的な濃度はそれぞれ1 mMおよび0.002 mMである。
  3. 細菌細胞の前培養
    1. 大腸菌を1x LB培地(酵母エキス1g、バクテリアトリプトン2g、脱イオン水200mLの塩化ナトリウム2g)に接種し、37°C(一晩)でインキュベートします。
    2. インキュベーション後、培養液の20μLを回収し、新鮮な1xLB培地の1.98mLに移し、細胞を2時間再培養した。
    3. プレカルチャ溶液の600nm(OD600)値(ステップ1.3.2で調製)で光学密度を確認してください。OD600 = 1.0-1.5 のプレカルチャ ソリューションを使用する必要があります。
  4. GVの外側および内側水溶液の調製
    1. グルコースを1x LB培地に溶解させ、GVの外水溶液を調出し、ストックグルコース溶液(500mM)の20mLを調出す。
    2. 1x LB培地でストックグルコース溶液を200mMに希釈する(表1)。
    3. 1x LB培地にスクロースを溶解し、GVの内部水溶液を調出し、ストックショ糖溶液(500mM)の20mLを調剤する。
    4. プレカルチャ溶液(OD600 = 1.0~1.5)、スクロース溶液(500mM)、および1x LB培地(表1)を混合します。培養液の最終的なOD600値は0.01~0.015で、最終的なスクロース濃度は200mMでなければなりません。
      注:浸透圧を避けるように注意してください。内側と外側の水溶液との濃度のバランスをとる必要があります。
  5. 細菌細胞を含む水中油(W/O)液滴の調製
    1. 脂質を含む油液(POPCとビオチン-PEG-DSPEを含む鉱物油)を0.6mLの蓋付きプラスチックチューブ(図1b(iv))にGVの内部水溶液の2μLを50μLに加えます。
    2. チューブを手でタップしてプラスチックチューブ内の2つの成分を乳化します(図1b(v)))。
  6. 細菌細胞を含むGVの形成
    1. GVの外側水溶液の50μL(ステップ1.4.2で調製)を1.5mLの蓋付きプラスチックチューブ(図1b(vi)))に加え、脂質を含む油溶液(POPCとビオチン-PEG-DSPEを含むオイル溶液の150 μL)を外側の表面に穏やかに層状に加えます。溶液(図1b(vii)))このサンプルを室温(RT、25°C)で10~15分間インキュベートし、油と水溶液の界面が平らであることを確認してください。
    2. ピペットを使用して油と水溶液の界面にW/O液液(ステップ1.5.2で調製)の50 μLを追加します(図1b(viii)))。
    3. デスクトップ遠心分離機のRTで1,600 x gで10分間1.5mLの蓋付きプラスチックチューブ(ステップ1.6.2から)を遠心分離します(図1b(ix))。遠心分離後、ピペットを使用して1.5mL蓋付きプラスチックチューブから油(上層)を吸引し、細菌細胞を含むGVを集めます(図1b(x)))。

2. GV観察システムの調製(細菌細胞培養システム)

  1. コンストラクティのための小胞(SV)の調製ng aサポートされる二層膜
    1. POPC溶液の20μLとビオチン-PEG-DSPE溶液の4μLをガラス管に注ぎます(ステップ1.1でGV調製に使用したのと同じ脂質組成物を使用)。
    2. 空気の流れで有機溶媒を蒸発させ、脂質膜を形成し、このサンプルを1時間のデシケータに入れ、有機溶媒を完全に蒸発させます。
    3. ガラスバイアルに1x LB培地(GVの外水溶液)に200mMのブドウ糖の200 μLを加えます。
    4. ガラスバイアルの開口部をフィルムで包み、超音波浴(120W)で少なくとも1時間超音波で超音波処理します。
    5. 押出方法21によりSVを100nmの細孔サイズのミニ押出機及びポリカーボネート膜を用いて調製する。
  2. 手作りの部屋の準備
    1. 両面シール(10 mm x 10 mm x 1 mm)に中空のパンチで 7 mm の穴を開けます。
    2. 両面シールをカバーガラス(30 mm x 40 mm、厚さ 0.25~0.35 mm)に貼り付けます。
  3. チャンバの穴のカバーガラス上の支持された二層膜の調製
    1. チャンバーの穴(セクション2.2で調製)にSV溶液の30 μLを追加し、RTで30分間インキュベートします。
    2. ピペッティングにより200mMのブドウ糖(GVの外水溶液)を含む1x LB培地の20μLで2回静かに洗浄します。
  4. 上のGVの固定化チャンバーの穴のカバーガラスに支えられた二層膜
    1. GV(1mg/mL)の外側水溶液を入れた10μLのニュートラビジンを穴に入れ、RTで15分間インキュベートします。
    2. ピペッティングにより200mMのブドウ糖(GVの外水溶液)を含む1x LB培地の20μLで2回静かに洗浄します。
    3. GVを含むすべての溶液(ステップ1.6.3で調製)をチャンバーの穴に入れ、カバーガラス(18mm x 18 mm、厚さ0.13~0.17mm)でシールします(図2b)。
  5. GV内部の細菌細胞増殖の顕微鏡観察
    1. 40x/0.6の数値開口(NA)対物レンズを搭載した反転顕微鏡で顕微鏡加熱ステージシステムを設定します(図2b)。
    2. 顕微鏡加熱ステージシステム(図2b)にチャンバーを置きます。37°Cで6時間の静電気状態でチャンバ内の細菌細胞を含むGVをインキュベートします。
    3. 科学的な相補的な金属酸化物半導体(sCMOS)カメラを使用して、GV内部の細菌細胞増殖の顕微鏡画像を30分ごとにキャプチャし、記録します。

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結果

液滴転写法を用いて単一細菌細胞を含むGVを生成する簡単な方法を提示する(図1)。図1aは、細菌を含むGVの沈殿物の概略図を示す。細菌を含むW/O液滴は、遠心分離によって油水(脂質単層)界面を越えてGVを形成する。スクロース(内部水溶液)とブドウ糖(外水溶液)の密度の違いは、W/O液滴の油水界面の交差を助けます。これら?...

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ディスカッション

ここでは、GV内部の単細胞レベルで細菌細胞を培養する方法について述べている。この簡易方法は、液滴転写法を用いて単細胞レベルで細菌細胞を含むGVを形成することを含む。細菌細胞を含むGVを得るための他のアプローチと比較して、この方法には2つの利点があります:(i)開発が容易であり、(ii)GVを調作するためにサンプル溶液の少量(2μL)が必要である。細菌細胞を含むGVを用いた液滴転写...

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開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

この研究は、文部科学省の優秀若手研究者のためのリーディング・イニシアティブ(第16812285号)、若手科学者研究助成金(No.18K18157,16K21034)の支援を受けました。日本学術振興会(JSPS)からM.M.、文部科学省から株式会社への助成金(第17H06417号、17H06413)。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
BactotryptoneBD Biosciences211705
ChloroformWako Pure Chemicals032-21921
Cover glass (18 × 18 mm)Matsunami Glass Ind.C018181thickness 0.13–0.17 mm
Cover glass (30 × 40 mm)Matsunami Glass Ind.custom-orderthickness 0.25–0.35 mm
Desktop centrifugeHi-Tech Co.ATT101swing rotor type
Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm)NitomsT4613
Glass vialAS ONE6-306-01Durham fermentation tube
GlucoseWako Pure Chemicals049-31165
Inverted microscopeOlympusIX-73
MethanolWako Pure Chemicals133-16771
Microscopic heating stage systemTOKAI HITTP-110R-100
Mineral oilNacalai Tesque23334-85
Mini-extruderAvanti Polar Lipids610000
NeutravidinThermo Fisher Scientific31000
Objective lensOlympusLUCPLFLN 40×/0.6 NA
Polycarbonate membranesAvanti Polar Lipids610005pore size 100 nm
sCMOS cameraAndorZyla 4.2 plus
Sodium chlorideWako Pure Chemicals191-01665
SucroseWako Pure Chemicals196-00015
Ultrasonic bathAS ONEASU-3D
Yeast extractBD Biosciences212750
0.6 mL lidded plastic tubeWatson130-806C
1.5 mL lidded plastic tubeSumitomo Bakelite Co.MS4265-M
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocolineAvanti Polar Lipids850457PPOPC
1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000]Avanti Polar Lipids880129PBiotin-PEG-DSPE

参考文献

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