グリルス・ビマキュラトゥス・エッグを注入する

要約

ここでは、クリケットの卵を注入するプロトコルを提示します, を含むが、これらに限定されないクリケットの多くの実験で基礎的な方法として機能する技術, RNA干渉とゲノム操作.

要約

発達中の生物の遺伝子機能を変えることは、さまざまな種類の実験の中心である。従来のモデルシステムでは非常に強力な遺伝子ツールが開発されていますが、他のほとんどの生物では遺伝子やメッセンジャーRNA(mRNA)を操作することは困難です。同時に、進化的および比較的アプローチは、多くの異なる種における遺伝子機能の探索に依存しており、現在遺伝的に扱いやすい外で発現を操作する技術の開発と適応を必要とする。種。このプロトコルは、胚または幼虫の発達に対する所定の操作の影響をアッセイするために、クリケットの卵に試薬を注入する方法について説明する。卵を採取し、ベベラ針で注入する方法について説明する。この比較的簡単な技術は、他の昆虫に柔軟で適応可能です。1回の実験で数十個の卵を集めて注入することができ、バッファーのみの注射の生存率は練習で改善し、80%も高くなる可能性があります。この技術は、薬理学的薬剤の注射、目的の遺伝子を発現するインビトロキャップmRNA、RNA干渉を達成するための二本鎖RNA(dsRNA)、クラスター化を定期的に使用するなど、いくつかのタイプの実験的アプローチをサポートします。CRISPR関連タンパク質9(Cas9)と組み合わせて間隔をあけた短いパリンドロミックリピート(CRISPR)とゲノム修飾のための試薬、および転移可能な要素を使用して、過渡性または安定なトランスジェニックラインを生成します。

概要

生物におけるゲノムを改変したり、遺伝子発現に影響を与える能力は、機能的因果関係をテストする多くのタイプの実験の設計の基礎である。また、ゲノムおよび非ゲノム修飾技術が、従来の遺伝的実験動物モデルシステム(例えば、ムスマス、ダニオ)以外の生物で利用できる、比較および進化的に関連する研究にとっても重要である。 レリオ、ショウジョウバエメラノガスター、カエノラブディス症エレガンス)。組織の多様性1を理解する願望であろうと、クローの原理に対する自分の遵守であろうと、すべての生物学的疑問に対して、その解決策2、3、ゲノムを改変する能力に最も適した生物があること、または遺伝子発現に影響を与えるのは、現代の実験計画に不可欠である。

クリケットのグリルス・ビマキュラトゥスは、新しいモデルシステムです。神経学^実験4で最後の世紀に使用され、過去20年間は、特にこの生物の進化と発達に焦点を当てたクリケットへの実験的関心の増加を目撃しています^5.クリケットは、D.メラノガスターやトリボリウムカスタネウム6などのよく研究されたホロ代謝昆虫に基流域に分岐するヘミメタボラス昆虫です。進化の木に有用な位置のために、科学者は、G.ビマクラトゥスでの使用のための分子ツールを適応させることに関心が高まっているこの昆虫で近代的で洗練された実験的な質問に興味を持っています。

クリケットの卵への分子試薬の注入は、胚における遺伝子発現の非ゲノム操作と同様にゲノム修飾実験に使用することができる。例えば、eGFP挿入物を運ぶトランスジェニックG.ビマクラタスは、トランスポザーゼピギーバク7、8を用いて作成されている。研究者は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)および転写活性化剤(TAL)エフェクターヌクレアーゼ(TALENs)を用いてノックアウトG.バイマキュラトゥスを作成し、特定のゲノム領域9に二本鎖破断を導入することに成功した。ZFNとTALENは、大きな4つのモデルシステムを超えて動物のサイト固有のターゲティングを可能にしますが、これらの試薬は、使いやすく、より効率的で、柔軟性の^高い10のCRISPR/Cas9システムによって急速に上回っています。CRISPRはG.バイマクラトゥスでノックアウト11とノックインライン12、13ゲノム修飾に加えて、dsRNAを卵に注入してmRNA発現をノックダウンするために使用されています。胚は、研究者が開発14、15を通じて特定の転写物の役割を理解することを可能^にする。クリケットの卵を注入する方法に関するいくつかの限られた詳細は、以前^に12が公開されています.

ここでは、早期G.ビマクラトゥス卵を注入するための詳細なプロトコルについて説明する。このプロトコルは、様々な実験室の設定、注射材料、およびおそらく他の昆虫に効果的かつ容易に適応可能です。ゲノム修飾およびノックダウン実験の設計と実装に関する追加の詳細は、他の場所^で12、13に公開されていますが、これらのアプローチは最終的にここで説明する注入プロトコルに依存します。

プロトコル

1. ハードウェアのセットアップと材料の準備

注:ソリューション、試薬、および機器の詳細の準備については、表1および材料表を参照してください。

1. 卵を見て注射針を導くために解剖顕微鏡を設置します。(図1Aは、蛍光を備えた解剖顕微鏡を示す。蛍光能力は有利であるが、必要ではない。
2. 3軸マイクロマニピュレータを配置して、注射針を所定の位置に操縦します(図1A)。
3. チューブ付きのマイクロインジェクターと針ホルダーを設置し、少量の材料を注入する(図1A)。必要に応じて、図に示されていないフットペダルを使用します。
4. 3Dプリンターまたはレーザー彫刻機で目的のパターンの逆を印刷して、卵の井戸を作成するスタンプを作成します(図1C)。
   注:示されている3Dプリントサンプルスタンプは、個々の井戸を作成するための4.5 cm x 5 cmと128、3 cm x 1 cm x 1 mmの突起です。様々なカスタマイズ可能な金型を作る方法の詳細は、他の場所で公開されています¹⁶.
5. 10xインジェクションバッファー、HEPES緩衝生理食生(HBS)、およびテトラメチルロダミンデキストラン色素のストック溶液を調作し、4°Cで保存する。
6. dsRNA、CRISPR/Cas9^12、転移可能元素、インビトロキャップmRNA 7、8、薬理学薬剤17、ZFN、またはTALENS⁹などの注入される実験溶液を調調す。
7. ガラススライドの上に1mmほどのプラットフォームを作成するために、標準的なラボテープのいくつかの層にダブルスティックテープを置き、評価のために針を保持するために使用されます。
8. 空気循環のためのメッシュで覆われた開口部を持つ蓋とサイズ約40 cm x 60 cmのクリケット容器を準備します。
9. 食料、水、避難所の材料を追加します。
10. 数ダースの健康な男性と女性の大人のコオロギを追加します。翼の存在によって大人のクリケットを識別します。
    注:ポスト想像上の年齢の範囲は、卵の収量を増加させる可能性があります。実験のために十分な卵を集めることができるように、コオロギの密度は比較的高くあるべきであるが、カニバリズムが起こるほど混雑していない。例えば、約2ダースの健康なコオロギは、男性と女性の比率がほぼ等しい場合、上記の大きさの容器で、1〜2時間の期間に約200個の卵を集めるのに十分である。コオロギは室温で保つことができますが、コオロギが暖かい(23.5~26°C)、湿度(40~60%相対湿度)のインキュベーターで維持される場合、開発と行動が最適です。

2. 注射用針の製造

1. フィラメントでボロシリケートガラスキャピラリーを使用してください(サイズの詳細については、材料の表を参照してください)。注射が完了する前に、同じ日に、または数日までプル針を準備します。
2. 毛細血管ガラスを引き出しに入れ、フィラメントの上にガラスを中央に置き、ノブを締めて所定の位置にガラスを固定します。
3. ガラスランプ温度(-5 °C~+10°C)の近くに引き出し機温度を設定します。
4. 単一ステップの高熱プロトコルを使用して、小さな開口部で長いテーパを引っ張りますが、両端を閉じないようにします。
   注:例えば、ボックスフィラメントを装備した材料の表に詳述されているマイクロピペットプーラーを使用する場合は、ランプ温度が478:ヒート478のガラスに次のパラメータを使用します。プル 45;ベル 75;デル120。図2Bに示す形状を持つ針を製造するための最適な条件は、各ユーザによって経験的に決定されるべきである。
5. 注射の準備のための斜めの針の先端。
6. ベバラー(図2A)の紡糸粉砕機面を滴下水で濡らします。逆浸透(RO)またはジエチルピロ炭酸塩(DEPC)処理蒸留水のいずれかを使用してください。
7. 引っ張られた針をベブラーに入れ、20°の角度に変える。
8. それはちょうど粉砕面に触れるまで針を下げ、2~3分間ベベル。
9. ガラス顕微鏡スライドに付着したダブルスティックテープに斜めの針を置くことによって斜めを評価する。
10. カメラと画像取得ソフトウェアを搭載した複合顕微鏡のステージに針を持つスライドを置きます。
11. 20倍の目的を使用して針先の画像を取得します。
12. イメージングソフトウェアを使用して、針の内内側の内膜の直径をベベル開口部に近い値で測定します(図2C)。最適サイズは10 μm + 2 μmです。
13. 8 μm以下、12μm以上の開口部を持つ針を廃棄します。
14. ほこりを避けるために、蓋付きの容器に針を保管してください。先端を壊すことを防ぐために、ワックスまたは類似の材料のストリップを使用して、容器の底から針を上げます。

3. 卵の採取と準備

1. 卵を収集しようとする前に、一晩または少なくとも8〜10時間の任意の湿った敷設材料(水バイアル、卵料理)のコオロギを奪うことによって産卵の数を最大化します。
   注:女性は内部的に精子を保存する能力を持っているので、慎重にタイミングを合った受精が実験的に不可欠である場合、異なるタイミングの手順が必要な場合があります18.
2. 水に1%アガロースの40 mLを作り、10センチのペトリ皿に注ぎます。
3. アガロースの表面に卵ウェルスタンプを置き、固化させます。
4. スタンプを取り外し、アガロースが固まったら、井戸を明らかにする(図1C)。
5. 1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むHBSでアガロースウェルプレートを埋めます。
6. 皿の上に蓋を置き、パラフィルムで包み、4°Cに保存します。
   注:料理は4°Cで数日間保存することができますが、結露を避けるために使用する前に室温まで温める必要があります。
7. 35mmのペトリ皿に白い遊び場の砂を入れ、コオロギが卵を産む卵のコレクション皿を作ります(図1B)。
   注:材料表に指定された砂は、適切な粒径です。砂粒が大きすぎると、砂が卵にダメージを与えます。
8. 卵皿を約18cm×18cmのペーパータオルで覆い、皿の上に砂を置きます。このペーパータオルを通して、満たされた皿を水道水で覆います。
9. ペトリ皿を傾け、余分な水を除去するために上を静かに絞ります。
10. 皿の下にペーパータオルの正方形の角をタックし、反転した蓋に卵皿を置くと、ペーパータオルカバーを所定の位置に保つのに役立ちます。
11. 卵皿をクリケットのビンに入れ、成虫の雌が卵を1~2時間卵子に入れるようにします。
    注:ここで比較的短い時間は、すべての卵が注射時の発達の段階で類似していることを保証します。細胞化前の注射が重要な場合、注射は卵産卵19の14時間以内に起こるべきである。
12. 一方、アガロース皿(ステップ3.6から)は、注射用の卵を保持する準備として室温に暖めます。
13. 卵の採取皿を取り出し、作りたての卵をクリケットのビンから取り出し、ペーパータオルカバーを取り外します。少なくとも500 mL容量のビーカーの上に0.5-1 mmの細孔サイズのストレーナーを置きます(図1B)。
14. 卵を産む皿(砂と卵)の内容物を、砂粒がストレーナーメッシュを通して下のビーカーの水に落ちるように、ストレーナーの下のストレーナーの下に落ちるように、ストレーナーの下のストレーナーの卵をストレーナーバスケットに残して、ストレーナーの下にストレーナーの中に入れます。
15. 容器にRO水を入れ、トレイに入れます。容器の上にストレーナーを反転し、水に卵を取り除くために皿に対してそれをタップします。卵は容器の底に沈む。
16. P1000ピペット先端をはさみで切り、直径約3mmの開口部を作ります。P1000ピペットにこの先端を置き、できるだけ少ない水を転送し、コンテナからアガローズ卵型皿に卵を転送するためにそれを使用します。
17. プラスチックピンセットを使用して、HBSプラス1%ペニシリン/ストレプトマイシンで満たされたアガローズ井戸に卵を並べます。各卵は、個々の井戸の底に沈みます。注入する準備ができるまで、ペトリ皿の蓋で覆います。

4. マイクロインジェクターの準備

1. マイクロインジェクタを圧縮空気またはガス源に取り付けます(このプロトコルは圧縮空気またはN2のいずれかを使用して最適化されました)。
   注:ポータブルエアタンクを使用する場合は、少なくとも75 psiに充填してください。タンクは、注射中に空気圧を失い、補充する必要があります。注射は40psi以下に困難になります。
2. マイクロインジェクターの電源を入れます。射出時間を 0.17 s に設定し、圧力を 10 ~ 15 psi に設定します。
   注:必要な正確な圧力は針の開口部に依存し、使用される注射および/または新しい針のあらゆるラウンドのために経験的に決定されなければならない。
3. マイクロインジェクターのBALANCEノブが0(通常は反時計回り)に変わり、マイクロインジェクタが加圧され、射出モードになっていることを確認します。

5. 注射

1. 1 mLシリンジと0.45 μmのシリンジフィルターを使用して、10x注入バッファーの約500 μLをフィルタリングします。
2. 混合注射試薬(以下の詳細は、12に記載されているように調製されたdsRNAの注射用である)。
   注:特にこのテクニックを最初に学習する場合は、いくつかのコントロールを設計して実行することをお勧めします。注入せずに卵を突き出す、バッファー+色素を単独で注入する、またはバッファー+色素+制御試薬(eGFP dsRNAなど)を注入することは、注入プロトコルの様々な要素がどれほど破壊的であるかの良好なテストである。さまざまなコントロールの生存率については、図 3を参照してください。
3. 4 mL dsRNA アリコートから始めます。
4. 濾過された10x注入バッファーの0.5 mLをdsRNAアリコートに追加します。
5. 50 mg/mL テトラメチルローダミンデキストラントレンストック溶液の0.5 mLを追加します。蛍光なしで解剖スコープに取り組む場合は、代わりにフェノールレッドを使用してください。
6. 射出期間中、すべての材料を氷の上に保管してください。
7. 20 mLローディングチップとp10ピペを使用して注射針に注入液をロードします。
8. 1.5 mLの注入液を引き出し、注入針の広い端にローディングチップを挿入します。
9. 可能な限り針に溶液を排出し、穏やかにフリックすることにより、気泡を排除します。針を折らないのは気をつけなさい。
10. 解剖顕微鏡の下に卵の皿を置き、約10倍の低倍率(1倍の目の目的を通して見た1倍の倍率)を選択します。
11. 注射ハウジングに針を挿入し、締めます。
    注:針が適切かつしっかりとハウジングに挿入されていることを注意してください。これを行うには、針の広い端を金属ハウジングから引き出し、シリコンチューブをハウジングに持ち込みます。針のガラス端がシリコンのすぐ向こうに突き出るようにシリコンチューブを調整します。これを行わない場合、シリコンチューブは、ガラスと金属ハウジングの間に挟まれ、針の端を塞ぐことがあります。
12. マイクロマニピュレータに付属の針で注入ハウジングを慎重に挿入します。針の鋭い端に注意し、それが表面にぶつかって壊れていないことに注意してください。
13. 顕微鏡で卵と針の両方を見ながら、皿グリッドの左上隅にある卵の近くに針を動かします。
14. 先端がHBSプラス1%ペニシリン/ストレプトマイシン緩衝液に入るまで針を下げます。
15. 視野に針を中央に入れ、卵皿を動かして、針が卵よりも皿の端に数mm近くあるようにします。
16. 針で卵のグリッドのビューを妨害しないでください。
17. ローダミンに適したフィルターに顕微鏡をセットし、針の蛍光を観察し、針の先端に焦点を合わせることができます。
18. マイクロインジェクターで、注入液が針からサスペンション溶液に漏れ始めるまで、バランスノブを時計回りにゆっくりと回します。マイクロインジェクターの画面上の残高数は増加し始めますが、数値は重要ではありません。次に、染料が針から漏れ出すのを止めるまで、ノブを反時計回りに少し回します。
    注:新しい針を使用するたびに、このバランスを設定することが重要です。バランスが適切に設定されていない場合、マイクロインジェクターは、注射がトリガされた後しばらくの間注入を続けます。不均衡な針が付いている注入ボタンの単一の押し押しは荷を積まれた針の内容全体の追放をもたらす可能性さえある。
19. 視野を中心に針を動かして、最初に注入する卵を狙った卵皿を動かします。注射は、配置された卵のグリッドの一角(例えば左上隅)から開始することをお勧めします。
20. 倍率を約50倍に調整します。この倍率では、単一の卵が視野のほとんどを埋めます。
21. マイクロマニピュレータと卵皿の手の両方を使用して、注射用の位置に針を動かします。
22. マイクロマニピュレータを使用して針を進め、注入する最初の卵に針の先端を挿入します。
23. 卵の後部(鈍い)端(図1E)から卵の長さ20〜30%の卵の長さで針を挿入し、卵の長い軸に垂直にします。
24. マイクロインジェクターの注入フィートペダルまたは注入ボタンで溶液を注入する。卵の中の蛍光材料の小さなボーラスは、注射が成功したことを示します(図1D)。
    注:注射中に卵黄が卵から排出されることは珍しくありません(図1F)。
25. 卵から針を引き込む。針の引き込み時に卵が意図せず井戸から持ち上げられた場合は、小さな鉗子を使用して、針を引き込みながら卵を井戸に押し戻します。
26. 注射中に針が詰まった場合は、卵から針を取り出し、HBSプラス1%ペニシリン/ストレプトマイシン溶液に浸した針を保ち、クリア機能を使用するか、注入を押すことによって詰まった針をクリアします。ボタン。
27. 同じ針を使用し続け、できるだけ多くの卵の注射手順を繰り返します。最初は、これは約20または30卵かもしれませんが、練習で100以上に増加します。
28. 針が詰まってクリアできない場合は、針を捨て、新しい針を満たし、再び開始します(すなわち、ステップ5.7に戻ります)。
29. 注入された卵の皿を、胚が分析のために開発の所望の段階に達するまで、わずかに湿気のある(蒸発を最小限に抑えるために)暖かいインキュベーター(23.5〜26°C)に保存します。
30. 少なくとも24時間ごとに、もはや生存不可能な卵を取り除き(図3A、B)、懸濁液を新鮮なHBSプラス1%ペニシリン/ストレプトマイシンに置き換えます。
31. 注射後2~3日後に、穏やかなピペッティングまたはプラスチック鉗子で卵をHBSプラス1%ペニシリン/ストレプトマイシンで湿らせてペーパータオルに移し、暖かく湿ったインキュベーターで開発を続けます。
32. 卵を監視し、毎日実行可能でなくなった卵を取り除きます(図3A,B)。

結果

コオロギは湿った材料に卵を容易に産み、湿った砂や汚れなどの適切な材料を提供し、大量の卵を産むよう誘導します。これは、コオロギが最初に8-10 hのために卵を産む材料を奪われた場合に特に効果的です。解剖顕微鏡、マイクロインジェクター、マイクロマニピュレータ(図1A)を用いて、様々な材...

ディスカッション

この技術の2つの主な課題は、最適な針のサイズと生存性の関連する問題です。小さい針は生存率を向上させるが、より狭い内気管を持つ針は、作業中の毛細血管力の程度が大きいため、黄身が針に移動して詰まらせる可能性が高くなる。最良の場合、閉塞は、単に別の卵を注入するか、または上記のように針をクリアすることによってクリアすることができます。また、卵黄が針から押し出...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescent dissecting microscope	Leica	M165 FC	Stereomicroscope with fluorescence
External light source for fluorescence	Leica	EL 6000
Microinjector	Narishige	IM-300	-Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket-
mCherry filter cube	Leica	M205FA/M165FC	Filter cube for mCherry or similar red dye will work
Micromanipulator	World Precision Instruments, Inc.	M3301R	Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8)
Magnetic stand	Narishige	MMO-202ND
Pipette Holder (Needle holder)	Narishige	HD-21
Tubing to connect air source to microinjector
Egg well stamp	3D printed	custom	3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic
Microwave	various
Incubator or temperature controlled room	various		Temperatures of 23.5-26 °C are needed.
Cricket food	various		cat food or fish flakes are appropriate food.
Cricket water	vairous		Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls
Cricket shelter	arious		Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons
Glass capillary tubes	World Precision Instruments, Inc.	Item no. 1B100F-4	Kwik-Fil™ Borosilicate Glass Capillaries, 100 mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament
Micropipette puller	Flaming/Brown	Model P-97	Distributed by Sutter Instrument Co.
Beveller/Micro grinder	Narishige	Model EG-45/EG-400	EG-400 includes a microscope head
Petri dishes	CellTreat	Product code 229693	90 mm diameter
Play Sand	Sandtastik Products Ltd.	B003U6QLVS	White play sand
Agarose	American Bioanalytical	AB000972	Agarose GPG/LE ultrapure
Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers	US Kitchen Supply	Model SS-C123	Pore size should be between 0.5 - 1.0 mm
Penicillin Streptomycin	Gibco by Life Technologies	Ref 15070-063	Pen Strep
Plastic tweezers	Sipel Electronic SA	P3C-STD	Black Static Dissipative, 118 mm
Syringe filters, 25 mm diameter, 0.45 µm	Nalgene	725-2545	Use with 1 mL syringe
1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip	Becton Dickinson	309602	Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work
Air tank (optional)	Midwest Products	Air Works®	Portable air tank
Rhodamine dye	Thermofisher	D-1817	dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW,
20 mL loading tips	Eppendorf	Order no. 5242 956.003	epT.I.P.S. 20 μL Microloader
Compound microscope	Zeiss	Axioskope 2 plus
20x objective	Ziess	Plan-Apochromat 20x/0.75 M27
Camera	Leica	DMC 5400
Leica Application Suite  software	Leica	LAS	Version 4.6.2 used here