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要約

提示された、ラットの異なるタイプの中央値神経(MN)病変および修復を産生するプロトコルである。さらに、プロトコルは、いくつかの非侵襲的な行動検査および生理学的測定を用いて神経の機能的回復を評価する方法を示す。

要約

この調査の主な目的は、ラット内の異なるタイプの中央神経(MN)病変を作成し、修復する方法を示す方法です。さらに、術後理学療法をシミュレートするさまざまな方法が提示される。複数の標準化された戦略は、末梢神経病変および修復のMNモデルを使用して運動および感覚回復を評価するために使用され、結果の容易な比較を可能にする。MN損傷を受けたラットに術後理学療法のような環境を提供するためのいくつかの選択肢が含まれています。最後に、本論文は、いくつかの非侵襲的な試験(すなわち、把握試験、ピンプリック試験、はしごラング歩行試験、ロープクライミング試験、および歩行トラック分析)および生理学的測定(赤外線サーモグラフィー、電子電子顕微鏡、屈曲強度評価、および屈曲カルジライ筋体重決定)を用いてMNの回復を評価する方法を提供する。したがって、このモデルは、ヒト種への結果の外挿を促進し、臨床シナリオを複製するために特に適切であると思われる。

坐骨神経は末梢神経研究において最も研究された神経であるが、ラットMNの分析は様々な利点を提示する。例えば、MN病変研究において、関節拘縮および罹患した四肢の突然変異の発生率が減少している。さらに、MNは筋肉塊で覆われておらず、坐骨神経の解剖よりも容易に解剖を行う。また、MN回復は、MNが坐骨神経よりも短いため、早く観察される。また、MNは腕の尺骨神経への平行経路を有する。したがって、尺骨神経は、MN損傷を修復するための神経移植片として容易に使用することができる。最後に、ラットのMNは、ヒト上肢に似た前肢に位置する。ヒトでは、上肢は最も末梢神経病変の部位である。

概要

末梢神経病変は、外傷、感染症、血管炎、自己免疫、悪性腫瘍、および/または放射線療法11、22の結果として定期的に起こる。残念ながら、末梢神経修復は臨床的に予測不可能で、しばしば失望する結果33、44を提示し続ける。影響,5,6,を受ける人々の見通しを改善するためには、まだかなりの基礎的研究と翻訳研究が必要であるというコンセンサスが広く存在します。

ラットMNは、ヒト88,99と大きな類似点を示す(図1)。腋窩部の上腕神経叢から生じるこの神経は、腕の内側の側面に下降し、肘に達し、前腕の腹側コンパートメントの筋肉の大部分に分岐する。MNは手に到達し、そこではラットの手の皮膚9の一部に加えて、ナーナル筋肉と最初の2つの腰筋を内面的にする(図 1)。

ラットMNを用いて、ヒト,10、11、12,11における末梢神経病変を適切に複製することができる。12この神経は、慣用坐骨神経に対していくつかの潜在的な研究上の利点を有する。MNはラットの前肢(ヒト上肢に似た)に位置するため、骨盤四肢13のかなりの部分を内面化する坐骨神経と比較して、ラットの幸福に対するはるかに小さな影響で実験的に損傷を受けることができる。さらに、ヒトでは、ほとんどの臨床的病変は、,ラットの前肢10、11、12、14、15、16,11,12,14,に相当する上肢に起こる。1516

本論文は、ラットに異なるタイプのMN病変を作り出す方法を示す。さらに、術後理学療法をシミュレートするさまざまな方法が提示されます。最後に、MNの機能的回復を評価する試験について説明する。末梢神経病変および修復のMNモデルを用いて運動および感覚回復を評価するために利用可能な複数の標準化された戦略があり、結果の容易な比較を可能にする。MNモデルは臨床シナリオを複製するのに特に適し、結果の外挿をヒト種に促進する。

プロトコル

動物の被験者に関するすべての手順は、ポルトガルのリスボンにあるノヴァ大学医学部の制度的動物ケアと使用委員会と倫理委員会によって承認されました(08/2012/CEFCM)。

1. 神経の中枢手術

注意:手術中に無菌のテクニックに従ってください。個人用保護器具(PPE)を使用し、無菌手術用ガウン17を着用してください。手術前に必要なすべての手術器具をオートクレーブします(材料表を参照)。

  1. 12週齢のウィスターラットを使用してください。手術の7日前に12時間の明暗サイクルでアドリビタム食品と水を提供します。麻酔の前に、ラットの重量を量って必要な麻酔薬の量を決定する。
  2. ケタミン(40〜80 mg/kg体重)とキシラジン(体重5〜10mg/kg)の混合物の腹腔内注射でラットを麻酔します。つま先ピンチへの応答の欠如によって麻酔の深さをチェックし、全体の手順18、19,19全体の呼吸速度を観察することによって。110サイクル/分以上の呼吸数またはつまみつまみへの運動応答が観察された場合、追加の鎮痛を提供する18,,20.
  3. 先制鎮痛20、21,21を提供するために皮下に1mg /kgのメロキシカムを注入する。
  4. 手術中に角膜の擦りやめを避けるために、両眼に眼科ゲルを塗布してください。
  5. 右側の内側の側面の上に髪を取り除くために脱毛クリームを使用してください。一度行われたクリーム17を除去するために暖かい生理食い物で洗います。
  6. 加熱パッドの仰向けの位置にラットを置きます。ヨウ素またはクロルヘキシジンベースの外科スクラブを手術部位に塗布する。少なくとも15 sのためにそれを残し、エタノールで拭きます。アプリケーション 3x を繰り返します。手術を進める前に、スクラブが少なくとも2分間皮膚に接触していることを確認してください。
    注意:外科現場の感染を防ぐための代替プロトコルについては、研究ユニットの感染管理機関に連絡してください19.
  7. 手術領域17をドレープ.
    注:厳格な無菌条件下ですべての手順を実行します19.
  8. 15個のメスの刃を使用して、右腕と胸部の内側の側面の皮膚を深い筋膜に切り開きます。電気焼灼器を使用して、あらゆる出血の容器を慎重に焼灼する。
  9. 腕の内側の側面の血管および神経構造を損傷しないように注意して、熱焼きまたは鈍いはさみを使用して、筋肉を覆う白っぽい鞘として提示する腕筋膜を慎重に分割します。
  10. 胸筋の末端挿入の下に、下側の腋窩動脈や静脈から、また腕神経叢の末端枝から離れてこの筋肉をいじめるために、一対のはさみをぶっきらぼうに開ける。
  11. 大胸部の挿入を電気焼灼で分ける。軽度の筋肉を露出し、切除する。
  12. 腕管から、腋窩から肘まで始まる尺骨神経からMNをぶっきらぼうに解剖する。これにより、腕神経叢の異なる末端枝、すなわち中央値、尺骨、放射状、腋窩および筋骨格系神経の暴露が可能である(図2)。
  13. 以下に説明する異なる実験群を分離する。
    1. MN を解剖するだけで、シャムグループを作成します。
    2. 5個のマイクロサージャリー鉗子または同様の器具22、23,23を使用して15 sのアームの中央部のMNを圧縮することによって、クラッシュグループを作成する。
    3. マイクロサージャスハサミを使用して切除グループを作成し、アーム内のMNの中央部から長さ10mmのセグメントを切除します。軸索の成長を防ぐために、8/0ナイロン縫合糸で神経の近位切り株をリゲートします。
    4. 後者のステップで説明したMNの10 mm-long-segmentを使用して、グラフトグループを作成し、180°回転させます。切り込まれた10/0ナイロンステッチを使用して、切片MNの近位および遠位切り株を神経移植片に縫合する。
  14. 中断された5/0ナイロンステッチ10、24,24を使用して皮膚の傷を閉じます。
  15. 43 mLの水道水25と混合したチェリー風味アセトアミノフェンの7 mLで術後鎮痛を提供し、ラットに対して3日間25日間に利用可能になった4.48mg/mLの濃度を得た。

2. 住宅・理学療法

  1. ラットが手術の2~4週間前に理学療法装置と接触させ、運動の設定に対する適応をより簡単かつ迅速に行えるようにします。以下の手順に従って、演習を実行します。
  2. 1日1回、各ラットを個々の理学療法球の中に入れ、その後、障害物の少ない部屋に球体を置きます。ラットをアンブレートさせ、30分間自由に部屋を探索しましょう。
  3. ラットを運動に役立つランニングホイールを組み込んだ孤独なケージに個別に収容します。
  4. 4~5匹の動物のグループを形成し、これらのグループをパーソナライズされたケージに収容する。はしご、ロープ、ランニングホイール、その他の環境を豊かにする要素を含めることによってケージをパーソナライズします。
  5. 手術の翌日に個々のラットをパーソナライズされたケージに戻します。
  6. 手術後3日で理学療法の練習を再開する。

3. 機能テスト

  1. 機能試験を開始する1週間前に、陽性補強として使用される食品のお菓子でラットを理解してください。各テストが正常に完了した後、手術の前後にこの補強を提供します。3週間の最初のトレーニング期間の後、手術後1週間ですべての検査を再開します。
  2. ラットが自然により活発である夕方にテストを行います。手術後1週間でテストを再開します。
  3. ラットをグリッド上に配置して把握テストを実行し、尾で持ち上げ、前足11、26,26でグリッドをつかむことができます。ラットが両方の前足でグリッドをつかむことができる場合は、「ポジティブ」スコアを割り当てます。ラットが負傷した足でグリッドをつかむことができない場合は、「負」スコアを割り当てます。
    注: 正の把握テストは、MN のモーター コンポーネントが16、27,27で機能していることを示します。
  4. ピンプリックテスト28、29を29実行します。
    1. 4 mm x 4 mm の正方形のグリッド パターンを持つプラスチックプラットフォームを作ります。21 cmの長さの金属フレームとこのグリッドにサポートを提供します。
    2. ラットをプラットフォームに置き、15.5 cm x 15.5 cm x 11 cm の透明なプラスチックボックスでグリッドを覆います。通常の活動(例えば、探索的および主要なグルーミング)が収まるまで数分待ちます。
    3. ラットが静止し、その4つの足の上に立っているときにテストを開始します。
    4. ミラーの助けを借りて、メッシュを通して、麻酔計(例えば、25gの曲げ力を持つ4フォン・フレイの髪)を挿入し、前足の手のひら面をMNの皮膚領域に突き刺す(図1)。各フォアポーに対して評価5xを代わりに繰り返し、各評価の後数秒待ちます。
    5. 正しい評価のためにフォン・フレイフィラメント30の曲げを確認します。引き出し応答を次のようにスコア付けする:離脱応答なしの「0」、ラットがゆっくりとフィラメントから足を取り除く場合は「1」、ラットが刺激に迅速に反応して足を取り除くか、足を舐める場合は「2」。
      注:フィラメントのアンビュレーションと噛みが観察された場合、これらはあいまいな応答と見なされるため、刺激を繰り返します。
  5. トレーニングセッション
    注:低照度環境で夕方に手術を行う前に、ラットを毎日3週間訓練してください。トレーニングセッションは、ロープクライミング、ラダーラング、ウォーキングトラックテストに特にお勧めします。これらは、ロープクライミングテスト、はしごラング、そして最後に歩行トラックテストから始まり、前に提示された順序で行うことができます。新しいテストの前に、同じ動物に数分の休息を許可します。
    1. 最初の週は、箱の入り口の近くにあるはしご/ロープ/廊下の最後の3分の1にネズミを置きます。動物が尾の先端にそっと触れたり引っ張ったりして、箱の開口部に向かって動くように条件を付けます。ラットが箱に入ったら食べ物のお菓子を提供し、テストを繰り返す前に数秒の休息を許可します。毎日5倍の5日間繰り返します。
    2. 2週目の間に、動物をはしご/ロープ/コリドーの2分の1に置く 3.5.1 のステップを繰り返します。
    3. 第3週目は、箱の入り口の反対側にあるはしご/ロープ/廊下の底にネズミを置きます。3.5.1 の手順を繰り返しますが、テストが正常に完了したときにのみ動物に報酬を与えます。
  6. ラダーラン検定を実行します。
    注:このテストは、前肢の強さ、踏み、配置、および配位31を評価するために使用されます。
    1. ラットをはしごの底部(120cm x 9 cm x 2 cm、18段の厚さ1.5cm、間隔4cm)に置き、ラットの尻尾をそっと触れます。はしごが10°の傾斜に置かれ、暗い木製の31.5 cm x 35 cm x 35 cmの箱の13.20 cm x 11 cmの開口につながっていることを確認してください。
    2. ラットがはしごを登り始めたらタイマーを開始し、ラットの切り抜きが箱の入り口を横切ったらタイマーを停止します。
    3. 時間を記録し、テスト3xを繰り返し、それぞれ少なくとも1分間隔で分離する。
  7. ロープクライミング
    注:このテストは、MN回復32に依存する把握強度を評価するために使用されます。
    1. ロープの底にネズミを置き、そっと尾に触れて登るように説得します。動物が登り始めたらタイマーを開始し、ラットのスアウトがプラットフォームの入り口を横切った瞬間に停止します。
    2. 各テストについて、プラットホームに登るのにかかった時間と、ラットがロープを登る間に負傷した足のスリップの数を記録する。動物がタスク中に躊躇しないか、または登山を停止しない場合は、テストを有効と考えてください。正しくタスクを実行した後、おやつをラットに提供します。
    3. 時間を記録し、テスト3xを繰り返し、それぞれ少なくとも1分間隔で分離する。
  8. ウォーキングトラック
    注:このテストは、前肢運動回復33、34,34の評価に使用されます。
    1. 高さ16.5cmの狭い歩道、幅8.7cm、長さ43cmの器具を設置します。これは、黒い木製の23 cm x 36 cm x 28 cmボックスの壁の1つで長方形の8.8 cm x 8.2 cmの開口部につながることを確認してください。箱の入り口を素早く閉じるための垂直スライドドアを含めます。ラット33,34を取り出すために使用する取り外し34可能なトップを含める。
    2. 廊下の床にグラフ用紙を置きます。その尾でラットをつかみ、メチレンブルーに浸した絵画ブラシを保持してみましょう。廊下の入り口にネズミを置いて箱の中を歩くようにします。廊下の床からグラフ用紙を取り出し、両方の前足の良好な代表的な印象が得られるまでテストを繰り返します。
    3. 取得したプリントから、連続した連続したプリントをクリアしたものを選択し、tiffまたはjpeg形式で撮影し、オープンアクセスソフトウェアFIJI35を使用して次のパラメータを測定します。
      注:まず、グラフ用紙のマーキングを使用して各画像をキャリブレーションします(分析 |スケールを設定) 第 2, 8 ビット形式に各画像を変換します (画像 |タイプ |8 ビット)。その後、矩形選択ツールを使用して、足のプリントを選択します。画像のこの部分をトリミングする (画像 |クロップ各画像で、画像を選択して、足跡をハイライト表示し、背景を削除します (Image |調整 |しきい値)。
      1. 足の印象領域を測定してスタンス係数を測定します。矩形選択ツールを使用して、足のプリントを選択し、Control + Mキーを押します。
      2. 足の印象の長さが最も長い値を測定して印刷長率を測定します(ステップ 3.8.3.2 ~ 3.8.3.6 の場合、直線選択ツールを使用して最も遠い 2 つの点を選択し、Control + Mを押します)。
      3. 足の印象の最も広い幅を測定することによって、指の広がり係数を測定します。
      4. 第2指と第3指の最も広い幅を測定することによって、中間指の拡散率を測定する。
      5. 特定の側の連続した足の印象の相同点間の距離を測定することによって、ストライドの長さを測定します。
      6. 足印象の中央部と移動方向29,33,36との間の垂直距離を測定することによって29支持33の底部を測定する。
        注:代表的な連続した両側足の印象33の2組で最後の2つの測定を行います。

生理学的測定

  1. 赤外線サーモグラフィー (IRT)37,,38,39.
    1. 測定が行われる部屋の温度が、0.1 °Cの熱分解能を持つ通常のデジタルハイドロ温度計を使用して18°C-25 °Cの間であることを確認してください。重要な熱源(例えば、コンピュータや冷蔵庫)が存在しないようにしてください。
    2. 評価前に2時間評価室にラットを持ち込んで順応させる。実験を開始する前に、上記の手順(ステップ1.3-1.6)または機関のプロトコルに従ってラットを麻酔してください。実験を開始する前に、つま先ピンチに対する応答がないかどうかを確認してください。
    3. 赤外線サーモグラフィーカメラの電源を入れてから15分前に、評価中はオフにしないでください。カメラの放射率パラメータを、ラットの皮膚の放射率パラメータ(ε = 0.98)37、40、41 に一致するように設定します。37,40,41
    4. ポリエチレンスポンジで清潔で安定した表面にラットをドーサムに置きます。反射材料や他の可能なアーティファクト源がないことを確認してください。二重顔の接着剤テープでスピネーションで慎重にその前足を修正します。直腸の内側にデジタル温度計2cmを挿入し、すべての評価中にラットの中心温度を監視します。
    5. サーモグラフィーカメラをラットから90°の角度と30cmの距離で保持します。カメラを動物の体全体に合わせます。30 s間隔の赤外線サーモグラフィー画像を3枚得る。
    6. 取得した温度計をコンピュータに転送し、解析ソフトウェアを使用して分析します。MNの足底領域における関心のある固定長方形領域(例えば、9 x 11ピクセル)を用いて、両方の前足の足底面の温度を定義する(図1)。無料のFLIRツールソフトウェアを使用して、それをダブルクリックしてサーモグラフィーを選択します。左側のツール バーで[ボックスの測定ツールを追加]ボタンを選択し、両方の前足の足底領域の上に 9*11 ピクセルの四角形を描画します。長方形を調整しながら、ピクセル単位でその寸法を確認することができます。両方の前足でそれを実行します。画像の右側には、最高温度、最低温度、平均気温が表示されます。
    7. 以前に描画した ROI 上で右クリックし、エクスポートを選択します。平均、最大、および最小温度、および ROI の温度のマトリックスは.csv ドキュメントにエクスポートされます。これらのデータは、後でデータ分析ソフトウェアを使用して探索できます。
  2. 電子ユーロ顕微鏡(ENMG)評価
    1. 電気刺激装置を設定します。使用しすべり針(0.25mm x 25mm)を、ごくわずかなインピーダンス[<1 Ω])と25mmのテープでテープで貼り付け、刺激用の電極を作成します。今度は、データ取得ユニットに刺激装置と電極を接続して、受信信号を取り込み、コンピュータソフトウェアで処理できるデジタル信号に変換します。
    2. 同じ部屋で評価を行い、常に同じ制御環境条件42、43、4443,の下で評価を行います。42データ取得を開始する前に、ラットが深く麻酔されるようにフォアポーをつまみます。
      注:深部麻酔は、ラット43による自発的および/または不随意運動に関連する変動を最小限に抑えるために最も重要である。
    3. ステップ 1.8~ 1.13 で説明されているように、外科用顕微鏡の下で両側の MN を露出します。数15メスの刃を使用して、腹側中線切開で腕切開を前腕に延ばします。
    4. 虹彩はさみを使用して上方の前陰部筋膜を鈍く分離することによって、フレクタージジットラムサブリミス筋肉の表面的な側面を露出させる。左後肢の四頭筋にグランドニードルを挿入し、信号グランドプラグを接続します。
    5. 右前足から開始し、記録電極を前足の屈折体ジギソラムの筋肉腹に入れ、刺激電極をMNの病変部位に近い位置に置きます。これらの電極を生理的に湿らせよ。
    6. ソフトウェアが次のように設定されていることを確認します: チャネル入力ポート 1 (CH1) – 0 ~ 10 V の刺激装置;チャネル入力ポート 2 (CH2) - EMG から 30 ~ 30 ~ 1,000 Hz. 10 mV の刺激振幅を選択して開始し、40,000 ms の期間で複合筋肉作用電位の CmAP サンプル レートを記録します。左足42、43、44,43,44についても同じことを繰り返します。
      注:信号は1,000xに増幅され、30〜1,000 Hzの帯域を使用してフィルタリングされます。刺激出力は、1 ms,42、43、44,43の持続時間を持つ単一のパルスに設定されます。44
    7. 記録装置ソフトウェアで記録されたファイルを開きます。
      注:デフォルトでは、画面は赤で上にトウウィンドウ、刺激パルス、および下にレコーダーENMGを青色で表示されます。タイムスケールの下の水平スクロールバーをスライドすると、完全なレコードを視覚化できます。2 つの主要なツール、ズームツールとI ビームツールは、パネルの右下にあります。ズームツールを使用して、CMAPの可視化を最適化し、グラフィックスを探索することができます。可視化画面に適切なフィットを保証するために、ズーム後に表示を調整する必要がある場合があります。これを行うには、[表示] を選択します。波形を自動スケールする。Iビームツールは、グラフの特定の領域と所望の測定の性能を選択することができます。グラフの上には、測定値が表示される小さなウィンドウが3つあります。P-Pは、選択された領域の平均振幅値を電圧(刺激装置レコードとENMGsの両方)で示し、デルタ-Tはその選択の時間間隔を示す。
    8. ソフトウェアプラグインの同音異義測定ツールを使用して複合筋作用電位(CMPA、表1を参照)からパラメータを測定する " EMG "45におけるMUAPおよびアクション電位の教師なし分類のためのツールボックス。
    9. 各ラットについて、CMAPの振幅がこれ以上増加しない刺激電圧の最小値を決定します。0.05 mVの刺激から始め、0.05 mVの増分電圧で連続的な増加刺激を与える。
    10. この電圧より20%以上の刺激を加えて、超最大刺激値を得てください。
    11. 後者の値が決定され、対応する刺激が適用された後、次のCmAPパラメータを記録します。
  3. 屈曲強度評価
    1. ステップ 4.2 と同じ刺激電極と刺激電極を使用して、MN を電気的に刺激します。入力チャンネルCH1を刺激装置(0~10 V)に設定し、刺激持続時間を30秒の出力設定に設定し、パルスは1msの周波数と1Hzの周波数を持つ。d = 0.001 N の解像度でダイナモメーターをコンピュータにリンクします。
      注:データのリアルタイム視覚化は、以前にコンピュータにインストールされ、ダイナモメーター46にリンクされたソフトウェアを使用して、時間あたりの力のプロット(N /秒)を構築することによって得ることができます。
    2. ステップ 4.1.4 に記載されているように、ラットを配置します。両方の前足の第2の間腔を通して5/0シルク縫合ループを置きます。縫合線に過度の負担をかけることなく、ダイナモメーターのフックと前足をダイナモメーターに合わせて縫合ループを取り付けます。
    3. ダイナモメーターの測定値にスプリアスの動きの干渉を避けるためにテープで対側足を固定します。
    4. ゼロボタンをクリックして、ダイナモメーターをゼロに設定します。
    5. 電圧結び目を調整して、刺激装置を1.5Vの上の最大振幅刺激に調整します。
    6. PCで、ソフトウェアAFH-01を開きます。"デバイス" の区切り記号を開き、デバイスFH5を選択します。新しいファイルを作成し (「測定1」はデフォルトで指定された名前です)、ファイルの名前を変更します。
    7. MNの近位部分に電極を置き、プログラムの下部にある遊びをクリックし、30 sのダイナモメーターの引っ張りを記録します。
    8. 取得した値をデータ分析ソフトウェアにインポートします。各評価の強度 x 時間グラフの最大力と平均力値と曲線下の面積 (AUC) を計算します。
    9. 左前足について繰り返します。
  4. 筋肉の重量
    1. エグザンギネーション47、48によって全身麻酔下でラットを48安楽死させる。
    2. 両方の前腕から屈筋カルピラジアルを収穫し、その起源から遠位腱挿入まで筋肉を解剖し、数15メスの刃を使用する。
    3. 精密スケール99、4949で筋肉の重量を量る。

結果

合計34匹のラットをランダムに次のグループに分けた:シャム(n=17)、切除(n=17)、および神経移植片(n=10)の操作を行った。すべてのラットは手術と術後の期間を無事に生き延びた。手術後1週間、その後100日間、すべての動物は週に1回上記の機能検査を受けた。これらの各テストの代表的な結果を以下に説明します。

把握テスト

把握テストで陽性反応を示したラットの割合は、シャム群で最も高かった。この値は、クラッシュ群および神経移植群のラットにおいて時間の経過とともに徐々に増加した(図3)。

ピンプリックテスト

シャム群のラットは、神経移植群のラットに対する累積ピンプリックテストで最高のスコアを有していた。どちらも切除群のラットよりもスコアが優れていた(図4)。

ラダーランニングテスト

はしご走行試験におけるラットの速度は、MN病変に提出されたラットよりもシャム群で最も高かった。後者の中で、ラダーを実行する時間は時間の経過とともに減少する傾向があり、MNリカバリと.並行して(図5)。

ロープテスト

はしご走行試験と同様に、ラットがロープを登るのにかかった時間は、MNが負傷したグループと比較してシャムグループで短かった。MNが回復すると、このテストでラットの速度が上がりました(図6)。

ウォーキングトラック解析

歩行トラックの解析は、足のプリントの形態の変化を示す傾向があった(図7)。これらの変化は、多くの場合、セグメント神経病変50よりも破砕傷害でより顕著であった。

赤外線サーモグラフィー

サーモグラフィーは、手術後の最初の30日間の前足間の温度差を調べるときに有用であった。温度差は、切除群のラットなど、より重傷を負ったMNを有するラットにおいてより顕著であった(図8および図9)。

電子電子顕微鏡学

表1は、電子性度法測定の生物学的重要性を要約し、異なる実験群の代表的な結果を提供する。電子的な図法では様々なパターンが観察された。通常のCMAPはシャム群のラットの典型であり、ポリファシズムCMAPはクラッシュおよび神経移植群のようにMNの可変的な程度の病変と関連していた(図10)。切除グループでは、CmAP は認められなかった。

手首の屈曲強度

手首の屈曲が主にMNに依存していることを考えると、このテストは、この神経の領域での運動回復を評価するために使用されました。回復が最大であった場合、手首の屈曲強度は通常に最も近かった.(図 11)。

筋肉の重さと形態

この筋肉はMN,9、10によって排他的に内面化されるように、屈筋カルピラジリスの筋肉の重量と形態は、MN9回復に依存していた。従って、シャム群では正常な重量および形態が観察された。クラッシュ、神経移植、および切除群で体重および筋萎縮の喪失が観察された(図12)。

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図1:ラットの神経の中央値の解剖学の模式図。
(1) ラット脳の中央神経の起源と終了(緑領域=一次運動領域;青領域=一次感覚領域)。(2) C7セグメントレベルの脊髄の横断面;(3) 腋窩神経;(4) 筋神経神経;(5) 放射状神経;(6) 中央値神経;(7)尺骨神経;(8) 腕の内側皮枝;(9) 前腕の内側皮枝;(10) 腋窩動脈;(11) 腕動脈;(12) 動脈の中央値;(13) 浅径動脈;(14) 尺動脈;(15) 中央神経の運動枝を原形筋に対して行う;(16) 神経中枢の運動枝を、放射状の屈筋屈筋に対する屈筋(17) 神経中枢の運動枝を、表在筋の屈筋ジクソウムに対する。(18) 神経中枢の運動枝を屈折体ジテナム・プロファンダス筋に対して(19) 中央神経の感覚枝をナー領域に対して行う。(20) 最初の間腔の共通の手触り動脈;(21) 最初の数字のラジアル・パルマーのデジタル動脈;(22) 中央神経の運動枝をナーの筋肉に(23) パルマー動脈アーチ;(24) 最初の数字のラジアルパルマーデジタル神経;(25) 最初の数字のウルナー・パルマー・デジタル神経;(26) 第3の間腔の共通の手触り動脈;(27) 最初の3つの腰筋に中央神経の末端部の分岐;(28)2桁目、3桁目、4桁目の尺門のデジタル神経。(29) ウルナール・パルマーデジタル動脈を4桁目と5桁目にする。(30)2桁目、3桁目、4桁目のラジアル・パルマー・デジタル神経(31) 5桁目のラジアル・パルマーデジタル動脈;(32) 前足の中央神経の皮膚領域 (青い色の領域).この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-4049
図2:腕および腋窩領域における中央神経の手術解剖を示すラットの右前肢の写真。
Cr, 頭蓋;私は、この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-4393
図3:手術後100日間の異なる実験群における陽性把握試験を有するラットの割合。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-4724
図4:累積ピンプリック試験を用いたノシセプション評価は、異なる実験群において対側足に正規化された操作前足で結果を示す。
垂直バーは、95% 信頼区間を表します。図の上部の水平線は、実験群間の統計的有意差を示す***p<0.001。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-5134
図5:異なる実験グループにおけるラダー実行テストにおける平均速度。
垂直バーは、95% 信頼区間を表します。図の上部にあるアスタリスクは、グループ間の統計的に有意な差 *p<0.001 を示しています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-5530
図6:シャムと切除群におけるロープ試験における平均上昇速度
垂直バーは、95% 信頼区間を表します。図の上部にあるアスタリスクは、グループ間の統計的に有意な差を示しています。**p<0.01。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-5939
図7:異なる実験グループの歩行トラックパラメータ。
操作された四肢の値は、反側の四肢に正規化された平均の割合として表されます。(A) スタンスファクター;(B) 印刷長;(C) 指のスプレッドファクター;(D) 中間指スプレッドファクター;(E) ストライド長;(F) サポートの基盤。垂直バーは、95% 信頼区間を表します。図の上部の水平線は、実験群間の統計的有意差を示す。D30、D60、D90 = 30、60、および手術後90日、*p<0.05;**p<0.01;0.001.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-6577
図8:赤外線サーモグラフィーで登録された平均温度差。
箱ひげ図は、操作側の中央分離神経(右側)とシャム(n = 17)と切除(n = 17)群の中の中央分離神経のパルマー領域の温度差を表します。**p<0.01。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-6996
図9:手術後最初の45日間の切除群からの動物の典型的な赤外線サーモグラフィーパターン。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-7331
図10:手術後90日のシャムと神経移植群の動物からの複合筋作用電位(CMP)の典型的なパターン。

figure-results-7690
図11:異なる実験群における90日後の両フォーポウの手首屈曲強度の評価
手首の屈曲強度を、30sの期間にわたって曲線下面積(AUC)を用いて評価し、上糖刺激を用いた。垂直線は 95% 信頼区間を表します。図の上部にある水平線は、グループ間の統計的に有意な差を強調します。**p<0.01。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-8139
図12:手術後100日のフレクターカルピラジアル筋体重および巨視的な外観。
(A) 異なる実験群における正規化された屈筋カルピラジアル筋体重を描いた箱ひげ図**p<0.01;0.001.(B)シャムと切除実験群の左右の筋肉の写真。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

パラメーターパラメータの重要性シャムグループ切除グループNGグループ
神経学的刺激閾値 (%)神経再生の評価は、CMAPまたは可視筋収縮のいずれかを生成するために必要な神経線維の最小数がある12 281.63 ± 271.655359.98 ± 3466.522108.12 ± 2115.13
運動刺激閾値 (%)神経再生の評価は、CMAPまたは可視筋収縮のいずれかを生成するために必要な神経線維の最小数がある12 462.52 ± 118.911694.10 ± 503.241249.50 ± 503.24
レイテンシー (%)最も速い神経線維における神経伝導速度の評価、すなわち最大のミエリン繊維44 113.55 ± 25.04N/a132.80 ± 69.95
神経筋伝達速度 (%)最も速い神経線維における神経伝導速度の評価、すなわち最大のミエリン繊維44 92.01 ± 20.88N/a91.30 ± 26.51
CmAP の振幅 (%)再インナートモーターユニット34の数の評価 110.63 ±45.66N/a41.60 ± 24.84
CmAP の期間 (%)筋肉の神経化の同期の評価は、筋肉の再インナーベーションの程度に依存し、内面性の運動繊維の髄鞘形成44、45,45 101.12 ± 23.92N/a151.06 ± 54.52
NG、神経移植
CmAP、複合筋作用電位。
該当なし
すべてのパラメータは、平均対角値のパーセントで表されます。
数値変数は、平均の ±標準偏差として表されます。

表1:実験終了時の電子ユーロ顕微鏡評価

ディスカッション

本論文は、ラット内の異なるタイプのMN病変および修復を作成するためのプロトコルを提示する。さらに、いくつかの非侵襲的行動検査および生理学的測定を用いてこの神経の機能的回復を評価する方法を示す。

特に、本論文に記載されている機能試験のいくつか、すなわちラダーランニングテストとロープテストは、食品報酬51、52、53,52,53を得ることを期待して、ラットがタスクを実行する意欲に大きく依存している。特定のラット株は、このタイプの試験51、52、5352,53においてトレーニングおよび再現的に行うことにより51適当であることに留意すべきである。例えば、ルイスラットは、トレーニング段階と51、52、53,52,53の両方でこれらのテストで悪いパフォーマンスを発揮します。

ラットハウジングは、実験動物が機能テスト19に存在するいくつかの要素に精通することを可能にすることに加えて、彼らの自然な探索的行動と一致して移動の十分な自由を許可する必要があります。したがって、移動の自由度を高くするさまざまな形態の住宅が示されている。大きいケージは機能テスト(例えばロープおよび梯子)で後で使用される濃縮要素とカスタマイズされる。

間違いなく、これらの濃縮要素は、ランニングホイールおよび個々のトレーニング球を有するケージと同様に、末梢神経系10で手術されたヒト患者に提供されるのと同様の術後理学療法の形態を提供する。

重要なことに、一部の著者は皮下組織および筋緊張筋を鈍くまたは15番メスできれいな切断することによって解剖することを提唱しているが、これらの構造を解剖する際の熱質の使用は術後血腫のリスクを最小限に抑えることを推奨する。

なお、ラットにおける末梢神経修復の異なる側面、すなわち軸索再生、標的再閉塞、および機能的回復の様々な側面を試験するために多数の試験が考案されており、その一部は本研究29、54、55、5654,55,56の範囲を超えている。29例えば、運動学的分析29、36、5536,55および組織形態評価292929、36、5736,57は、複数の著者によって広く採用されている。さらに、これらのテストのいくつかは、効率および/または再現性を最大化するためのバリエーションを伴います54.例えば、機械的アルギセメトリー(すなわち、機械的痛みを伴う刺激に対する応答の評価)は、本論文に記載されているように、与えられたフォン・フレイフィラメントを用いて定性的に評価することができ、または、連続的に強いフォン・フレイ・フィラメントを使用するか、あるいは、引き出し応答が観察されるまで圧力を加える電子装置を定量的に使用して30,54。30,

同様に、いくつかの著者は、ラットの前肢神経修復を評価するために歩行トラック解析を使用するが、他の著者は、単一のMN病,変がしばしば10、58、5958のpawprintsで再現可能な変化を生じることができないと主張している。1059さらに、これらの変化は筋肉の回復10,60,に比例しない可能性があると述べている人もいます。これを念頭に置いて、一部の研究者は、セグメント神経再建10、50、61,50後ではなく、ネブ病変を破砕した後の回復を評価する際に、主に前足で歩行トラック解析の使用を61提唱している。

把握テストはMN16、27,によって制御される筋肉の運動回復を評価するために広く使用される。この試験で得られたデータの均一性と再現性を保証するために、Bertelliら16が提案する確立された方法論を用いて把握試験を適用することが推奨される。しかし、現在のプロトコルは、過度のストレス11、27を防ぐために、逆側の足を日常的に固定化しない点で27異なります。また、他の著者は、傷つけていない足を固定化した後、ダイナモ計またはスケール27、56,56を用いて把握試験を定量的に評価することにも留意すべきである。しかし、この定量的評価は、研究者がラットの尾部26に適用する強度の影響を受ける可能性がある。さらに、デジタル屈折筋(ラットのMNと把握試験9の対象のみによって内挿された)によって生じる強度を、尺骨神経99、10、2710,27からその内インベーションを受ける屈筋カルピウルナリスを含む手首屈筋によって生じる強さから区別することは困難である。これらの,潜在的なバイアスを回避しようとするために、このプロトコルは、ヒト10、11、62,11の筋力を等級付けるために一般的に使用される医学研究評議会スケールと同様の順序スケールを使用する。あるいは、他の著者は、ビデオ分析とビデオベースのスコアリングシステム11、63,63を使用して把握の詳細な評価を記述している。

坐骨神経と比較してMNを使用することの潜在的な欠点は、後者の神経に関してより多くの情報が利用可能であるということです。これは、順番に、MNで得られたデータと以前の実験作品のデータをより困難にする46、48、6448,64を作ることができる。46さらに、坐骨神経に比べてMNのサイズが小さいほど、手術操作は88、12、27、56、6512,27,56,65に挑戦的になります。

本論文に記載された方法論とは対照的に、電子的な電子学的評価は、腕及びnar領域51に配置された経皮的単極電極を用いて行うことができる。侵襲性が低いにもかかわらず、この方法は、腕領域99,5151における尺骨神経の共刺激の可能性による潜在的な混乱のリスクを運ぶ。

ほとんどの著者は、末梢神経修復はニューロン生存、軸索伸長および剪定、シナプトジェネシス、脱毛感覚器官および運動ユニットの再捕獲に成功し、脳可塑性77、10、50、66、67を含む複雑な因子配列に依存するため、ラットで使用されるすべての検査が一致する結果を提供するとは限らない。,10,50,66,67

最後に、げっ歯類モデルの重要な注意点は、ラット末梢神経が末端の器官にはるかに近く、相同の人間の構造よりもはるかに小さい断面領域を有することに留意すべきである。しかし、このサイズ差はげっ歯類の実験データの高速化を保証し、ヒトと比較してラットの全体的な結果が68であることが期待される。実際、いくつかの著者は、げっ歯類を用いて末梢神経修復で得られた実験データを人間77,6969に推定しようとするときに注意を使用しなければならないと警告している。霊長類モデルは、より匹敵する70と考えられています。それにもかかわらず、その使用は、倫理的、ロジスティック、および予算上の制約71に関連しています。

坐骨神経は末梢神経研究で最も一般的に使用される神経であるにもかかわらず、ラットMNは複数の利点を提示する。例えば、MN病変は、関節拘縮の発生率が小さく、罹患した足11、12、16、5612,16の突然変異と関連している。11有意には、坐骨神経の切除に続く自己切除術は、ラットの11〜70%を苦しめる。これは坐骨指数のような現在の評価を不可能にするかもしれない14.これは、次に、与えられた統計的な力を得るために必要な動物の数の推定を煩わしい15にする。

また、MNが坐骨神経よりも短いため、神経回復は早く58、72、73、74、75、7658,72,73,74,75,に観察される。さらに、MNは筋肉塊で覆われておらず、坐骨神経16の解剖よりも技術的に容易になる。さらに、MNは腕の尺骨神経への平行経路を有する。したがって、尺骨神経はMN傷害を修復するための神経移植片として容易に使用することができる。最後に、ヒトにおいて、ほとんどの末梢神経病変は上肢に生じ、これはさらにラット77、78,78におけるこの神経の使用を支持する。

間違いなく、げっ歯類は末梢神経修復48、79,79の領域で最も一般的に使用される実験動物です。図示のように、ラットMNは、末梢神経病変および修復の便利なモデルである。実際には、モーターと感覚回復を評価するために利用可能な複数の標準化された戦略があり、結果36、46、60、80、81、8246,60,80,81,の簡単な比較を可能にする。3682これらの方法の多くは非侵襲的であり、毎日の評価を可能にする。

さらに、理学療法は、末梢神経損傷から回復する患者のケアの標準の一部です。本稿で示したように、MN傷害,4,5に投入されたラットに術後理学療法のような環境を提供するための複数の戦略がある4。したがって、このモデルは、臨床シナリオを複製するのに特に適しています, ヒト種に結果の外挿を促進12,,27,,48,,56,,58, 83,83.

本論文に示すように、ラットのMNモデルにおける運動および感覚回復を評価するために、複数の標準化された戦略が利用可能である。これらの大部分は非侵襲的な手順であり、頻繁な評価を可能にする。さらに、ヒト種のほとんどの末梢神経病変が上肢に生じるので、言及された実験的理学療法の設定は、臨床文脈における回復をより適切に模倣することができる。間違いなく、これはヒト種に対する結果の外挿を促進し、ラットにおけるこの神経の使用をさらに検証することができる。

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

ディオゴ・カザルは、フンダサン・カルウースト・グルベンキアン、フンダソン・シャンパリモー、ミニステリオ・ダ・サウデ・エ・フンダソン・パラ・ア・シエンシア・エ・テクノロジア、ポルトガルが主催する高度医学教育プログラムから助成金を受けました。著者たちは、図1の例示的な描画のためにフィリペ・フランコ氏に非常に感謝しています。著者たちは、ビデオの撮影と編集におけるアルベルト・セヴェリーノ氏の技術的な助けに感謝したいと思います。最後に、著者たちは、動物の取得とメンテナンスに関するすべての物流面で彼女の助けにサラ・マルケス氏に感謝したいと思います。

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