新しいキナーゼタンパク質の堅牢な生化学的アプローチを用いて分子レベルでの特性解析

要約

我々は、堅牢な生化学的アプローチを用いた新しいキナーゼタンパク質を特徴付けた:異なる細胞株および組織上の専用の特異的抗体を用いたウェスタンブロット分析、共免疫沈殿実験による相互作用、西洋で検出されたキナーゼ活性ホスホ特異的抗体およびγ[32P]ATP標識を用いたブロット。

要約

広範な全ゲノムシーケンシングは、多くの潜在的なタンパク質を提供する多くのオープンリーディングフレーム(ORF)を同定しました。これらのタンパク質は、細胞に重要な役割を持ち、新しい細胞プロセスを解明する可能性があります。タンパク質の中でも、キナーゼは細胞シグナル伝達経路に属し、細胞の成長、分裂、分化、運動性、死など、細胞の運命に不可欠な多くのプロセスをオンまたはオフにする能力を持つ主要なアクターです。

本研究では、新しい潜在的なキナーゼタンパク質LIMK2-1に着目した。我々は、特定の抗体を用いてウェスタンブロットがその存在を実証した。我々は、共免疫沈殿実験を用いて上流調節タンパク質との相互作用を評価した。共免疫沈殿は、2つの標的タンパク質間の相互作用を検出できる非常に強力な技術です。また、餌タンパク質の新しいパートナーを検出するために使用されてもよいです。餌タンパク質は、その配列に対して設計されたタグを介して、またはそれを特異的に標的とする抗体を介して精製されてもよい。これらのタンパク質複合体は、SDS-PAGE(ナトリウムドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル)によって分離され、質量分析法を用いて同定され得る。免疫沈殿LIMK2-1はまた、γ[32P]ATP標識によってインビトロでのキナーゼ活性^を試験するためにも使用された。この確立されたアッセイは、多くの異なる基板を使用し、また、餌の変異バージョンを使用して、特定の残基の役割を評価するために使用され得る。薬理学的薬剤の効果は、この技術は、非常に敏感かつ定量的であるため、評価されることもできます。それにもかかわらず、放射能処理には特に注意が必要です。キナーゼ活性はまた、修飾アミノ酸のリン群を標的とする特異的抗体で評価されてもよい。これらの種類の抗体は、すべてのリン修飾残渣について市販されているわけではない。

概要

何十年もの間、多数のシグナル伝達経路が解明され、細胞分裂、分化、運動性、プログラムされた細胞死、免疫および神経生物学などの重要な細胞プロセスへの関与が示されている。キナーゼは、多くの場合、活性化または不活性化を細かく調節し、外部刺激1、2、3に応答する一過性汎用性の高い複合体の一部である^として、これらのシグナル伝達経路において重要な役割^を果たす。キナーゼの突然変異および調節不変は、しばしばヒトの疾患を引き起こすため、過去40年間で最も重要な薬物標的の一つとなっている4.

この文脈では、上流のレギュレータや下流の基板とのキナーゼ相互作用を検出し、新しいパートナーを特定できることが重要です。アフィニティ精製および免疫沈殿は、タンパク質複合体5の単離のための非常に強力な技術である。餌タンパク質またはキナーゼは、ペプチドを標的とする抗体と共有結合した市販ビーズの使用を可能にする特定のペプチド配列でタグ付けされてもよい。この材料は実験6、7、8の高い再現性を可能^にする。内因性タンパク質は、餌タンパク質を直接標的とする抗体を用いて免疫沈殿することもできる。抗体は、タンパク質Aまたはタンパク質Gアガロースビーズに架橋されるか、または単にリサートを添加する前にこれらのビーズでインキュベートされてもよい。溶解バッファーは、相互作用を失うことなくタンパク質可溶化を可能にし、タンパク質の劣化を避けるために最適化する必要があります。このアプローチの主な欠点は、相互作用が細胞リシス時に検出されるということです。したがって、一時的または弱い相互作用は、細胞内のコンテキストを必要とする相互作用と共に見逃される可能性があります。その他の技術は、近接リゲーションアッセイ(PLA)9、生体内架橋支援親和性精製(XAP)10、生物発光共鳴エネルギー伝達(BRET)またはフェルスター共鳴エネルギーなどの細胞で直接働くために使用することができる。転送 (FRET)^11,12.さらに、免疫沈殿は、表面プラズモン共鳴、イソテル微量カロリーム、マイクロスケール熱泳動などの物理的な技術が必要^{とされる結合の熱力学的定数を決定することは適切ではありません。13、14}.

キナーゼ活性は、複数の技術を用いて評価されてもよい。本明細損では、ホスホ特異的抗体およびインビトロγ[32P]ATP(アデノシン三リン酸)標識に焦点を当てた。リン特異的抗体は、タンパク質内の特定の残留物のリン酸修飾を標的とする。それらは、細胞リシス後のウェスタンブロットまたはELISA(酵素結合免疫ソルベントアッセイ)、免疫組織化学、およびフローサイトメトリーまたは免疫蛍光を用いた無傷の細胞に使用することができる。彼らの欠点は、標的タンパク質の変異バージョンを使用して評価することができ、特異性の欠如を含むことができ、およびそれらのすべてのタンパク質に市販されていない。インビトロγ[32P]ATP標識は、非常に堅牢で、確立された、高感度な方法15である。免疫沈殿タンパク質または組換えタンパク質を使用して、異なる基質を試験してもよい。薬物の効果は、この方法が定量的であるとしても評価されてもよい。その主な欠点は、アプローチに関連する放射能は慎重に処理する必要がある点です。蛍光または発光ペプチド基質の測定に基づいて、リン酸化時に変化した蛍光/発光特性を利用する代替方法も可能です。このような方法はまた、高いスループットを可能にし、これは、例えば、標的キナーゼの潜在的な阻害剤でありうって可能な分子のスクリーニングにおいて必要とされる。実際、キナーゼは^{製薬会社16}が追求する最大級の薬剤標的の1つである。

本研究では、LIMK2-1タンパク質(LIMK2-1はLin11、アイル1、Mec3キナーゼアイソフォーム2-1を表す)に着目した。LIMK2キナーゼタンパク質は、1995^年17月に最初に記載された。LIMK2の3つのアイソフォームは、LIMK2a、LIMK2bおよびLIMK2-1の代替スプライシングによって生成される。現時点では、LIMK2-1は単一の^研究18においてmRNAレベルでのみ記載されている。本明細物では、堅牢な生化学的アプローチを用いて、この潜在的な新しいキナーゼタンパク質を分子レベルで特徴付ける。まず、LIMK2-1が実際に合成されたことを示す。LIMK2aおよびLIMK2bの2つの対応するのと同様に、上流のキナーゼROCK(Rho関連タンパク質キナーゼ)と相互作用する。LIMK2-1はミエリン基本タンパク質(MBP)にキナーゼ活性を有するが、LIMキナーゼの正規基質であるコフィリンには活性を示す。

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プロトコル

1. トランスフェクションのための細胞製剤

注意:細胞培養のすべてのステップは、専用の実験室で行う必要があり、細胞はクラス2の微生物学的キャビネット内で操作されます。

1. 種子HEK-293(ヒト胚性腎臓)細胞を10mLのDMEM(ダルベッコの改変イーグルス培地)で10cmプレートに入れ、10%の胎児子牛血清を補充した。5%CO2の下で3〜5日間培養し、37°Cで、細胞が約90%の合流に達するまで。
2. コラーゲンRでØ 10 cmプレートを処理し、プラスチックプレートへの細胞接着性を高める。
   1. コラーゲンRの溶液の5 mLを加え、10cmプレートにリン酸生理食塩分バッファー(PBS)で200倍希釈した。プレートの表面全体に液体をオーバーレイします。
   2. バイオセーフティキャビネット内で少なくとも1時間室温でインキュベートします。
   3. コラーゲン溶液を取り出し、捨てます。PBSの5 mLを追加し、プレートの表面全体に広げ、それを削除し、廃棄します。この洗浄を1回繰り返します。
   4. 10%の胎児の子牛の血清を補充したDMEMの8 mLを加える。準備されたプレートは、バイオセーフティキャビネット内に保管してください。
3. バイオセーフティキャビネット内のステップ1.1からHEK-293プレートを取ります。プレートから媒体を取り出し、専用の漂白剤のゴミ箱に捨てます。添加したDMEMの2 mLを追加し、1 mLマイクロピペットの流れを使用してそれらを取り外すために細胞をフラッシュし、泡を作ることを避けるために注意してください。
4. 15 mLチューブで細胞を収集し、補足DMEMの4 mLを追加します。10mLのピペットで均質化し、上下に3回ピペットを打ち込みます。
5. この細胞溶液の2 mLを取り、ステップ1.2.4から補充されたDMEMを含むコラーゲン処理プレートに追加します。
6. 5%CO2および37°Cでインキュベーターで24時間成長する。細胞はトランスフェクション時に50〜80%のコンフルエントでなければなりません。

2. 一時的なトランスフェクション

1. プレートから培地を取り出し、専用の漂白剤ゴミ箱に捨て、新鮮なサプリメントDMEMを10mL加えます。トランスフェクション混合物を調製しながら、37°Cでプレートをインキュベーターに戻します。
2. 15 mLチューブに、10mMトリス-HCl pH 7.5/1 mM EDTA(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、エチレンジニトリロテトラセチン酸用EDTA溶液の450 μL、2.5M CaCl₂溶液の50μLを添加します。反転によって混合します。
3. 専用プラスミドで形質転換した細菌の液体培養にミディ製剤から調製したプラスミド系DNA(デオキシリボ核酸)を10μg添加する。反転によって混合します。
4. 渦上の滑らかな攪拌の下で、BESバッファド生理食塩水2x濃縮物の500 μLを加える(組成:BES、10.7 g/L、NaCl、16.0 g/L、Na₂HPO 4、0.27 g/L;BESはN,N-ビス(2-ヒドロキセチル)-2-アミノエタンスルホン酸、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)タウリンをゆっくりと低下させます。
5. バイオセーフティキャビネット内の室温で少なくとも15分間(最大45分)インキュベートします。渦を混ぜないで!DNAとリン酸カルシウムの複雑な形成を妨げないように、チューブを非常に慎重に動かします。
6. ステップ2.1から安全キャビネットにプレートを取ります。DNA複合体を非常に慎重に追加し、プレートの表面全体の細胞にドロップしてドロップします。
7. インキュベーターで24~72時間インキュベートを37°Cでインキュベートします。通常、最大タンパク質発現は48時間以内に到達する。

3. リシス

注:氷の上で、そしてタンパク質の劣化を防ぐためにコールドバッファーで作業します。

1. 準備リシスバッファー: 50 mM トリス-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% トリトン X-100, 50 mM NaF, 10 mM ピロリン酸ナトリウム, 1 mM Na₃VO_4,20 mM p-ニトロフェニルリン酸, 20 mM β-グリセロリン酸, 10 μg/mL アプロチン, 0.0μg/mL、1 μg/mLルペプチン、および1 mM PMSF(フェニルメチルスルホニルフッ化物)。トランスフェクトされたプレートごとに約4mLのリシスバッファーが必要です。
2. インキュベーターからトランスフェクトされた細胞を持つプレートを取り出します。氷の上に置いて
   注:このステップから、「通常の」ベンチで作業することが可能です。
3. メディアを取り外し、専用の漂白剤のゴミ箱に捨てます。
4. 冷たいPBSの3 mLで2回洗浄する:トランスフェクトされた細胞を取り外すことを避けるために、プレートドロップの側面にPBSの3 mLを追加し、プレートの表面全体に広げ、PBSを除去し、それを廃棄します。この手順をもう一度繰り返します。最後に、次のステップのためのリシスバッファー希釈を防ぐためにプレートを傾けることによって、PBSの残りの部分を慎重に取り除きます。
5. トランスフェクト洗浄細胞に500 μLの冷たいリシスバッファーを追加します。プレートの表面全体に広げます。
6. 氷の上で10分間インキュベートします。時々(少なくとも2回)、プレートの表面全体にバッファを再び広げます。
7. 細胞をスクラップし、マイクロ遠心管でそれらを収集します。
8. 4°Cで10,000 x gで10分間遠心分離機。
9. 新しいマイクロ遠心管で上清を収集します。この画分は、ライサート(全細胞抽出物)に相当する。細胞膜破片に相当するペレットを捨てる。
10. この分画のアリコートを新しいマイクロ遠心管(約50μL)に集めます。この画分は、「総画分」または「細胞リサート」または「全細胞抽出物」に対応し、トランスフェクトされたタンパク質がウェスタンブロットによって発現されるかどうかの分析を可能にする。
    注: この時点で、サンプルはウェスタン ブロット解析に直接使用できます。Laemmliバッファをサンプルに加え、95°Cで5分間加熱し、10,000 x gで5分間遠心分離し、適切なSDS-PAGEにロードする必要があります。試料は-80°Cで保存することもできる。

4. 免疫沈殿

1. 適切な抗体と相まってアガロースビーズを穏やかに再中断:HA(ヒトインフルエンザヘマグルチニン)、フラグ、またはGFP(緑色蛍光タンパク質)を滑らかな反転によって再び再び中断する。
2. マイクロピペットから200μLの先端の端を切り取り、ビーズが先端に入るようにします。ビーズを上下に数回ピペットし、ビーズの正しいボリュームを取るために先端を飽和させる。
3. マイクロ遠心管に40μLのビーズを取ります。
4. TENET (30 mM トリス-HCl pH 7.5、120 mM NaCl、5 mM EDTA、1% トリトン X-100) バッファーを追加します。反転によって混合します。4 °Cで1,000 x gで2分間遠心分離機。慎重に上清を取り除き、廃棄します。TENET の 500 μL を追加します。回転ホイール上の4°Cで少なくとも1時間インキュベートします。
   注:TENETのこのインキュベーション前のステップは、非特異的相互作用を減らし、バックグラウンド信号を減少させる。
5. 500 μL のリシスバッファーでビーズを 2 回洗います。
   1. 4°Cで1,000 x gで遠心2分。
   2. 慎重に上清バッファーを取り外し、廃棄します。
      注:これらの洗浄手順中にビーズを吸引しないように注意してください。
   3. 500 μL のリシスバッファーを追加します。チューブを反転して均質化します。
   4. 手順 4.5.1 ~ 4.5.3 を繰り返します。
6. 4°Cで1,000 x gで2分間遠心分離機。上清バッファーを慎重に取り外し、廃棄します。
7. 回転ホイールで4°Cで2~4時間、ステップ3.9からリザートでビーズをインキュベートします。
8. 免疫沈殿ビーズを洗浄します。
   注:この時点で、免疫沈殿ビーズは、ライシスバッファーで5回洗浄し、次にLaemmliバッファーでelemmliを放熱してもよい。溶出物は、ウェスタンブロット分析に使用したり、-80°Cで保存したりしてもよい。あるいは、ビーズは、ライシスバッファーで2回洗浄し、次にキナーゼバッファーで3回洗浄し、γ[32P]ATP標識を行う。

5. コイノチノシプチ化解析

1. 工程4.7から免疫沈殿ビーズをリシスバッファーで洗浄します。
   1. 4°Cの冷蔵遠心分離機で1,000 x gで2分間遠心分離機。
   2. 上清を慎重に取り除き、捨てます。
   3. 500 μL のリシスバッファーを追加します。チューブを反転して均質化します。
   4. 手順 5.1.1-5.1.3 を 4 回繰り返します。
2. 溶出
   1. 4°Cの冷蔵遠心分離機で1,000 x gで2分間遠心分離機。
   2. 上清を慎重に取り除き、捨てます。ビーズの吸引を避けるためにハミルトン注射器で上清の最後の滴を取り除き、上清を廃棄します。
   3. 4xレームリバッファーの40 μLを加える(200 mMトリス/HCl pH 6.8、4%SDS、40%グリセロール、0.5M β-メルカプトエタノール、0.02%ブロムフェノールブルー)。チューブを軽く叩いて均質化します。
   4. 室温で5分間インキュベートします。
   5. 室温で10,000 x gで5分間遠心分離機。
   6. ハミルトン注射器で上清を取り出し、新しいマイクロ遠心管に集めます。この画分は、-80°Cで保存するか、またはウェスタンブロットによって直接分析されてもよい「溶出」に対応する。

6. キナーゼアッセイ

1. キナーゼバッファーを準備する:50 mM HEPES-NaOH pH 7.5(HEPESは4-(2-ヒドロキセチル)-1-ピペラジネエタンスルホン酸を表す)、150 mMNaCl、5mM MgCl 2、5mM MnCl 2、5mM NaF、1mM Na3 VO4、20mmルペプチン、および 1 mM PMSF。各免疫沈殿条件には約2mLのキナーゼバッファーが必要である。
2. 500 μL のリシスバッファーで、ステップ 4.7 から免疫沈殿ビーズを 2 回洗浄します。
   1. 4°Cの冷蔵遠心分離機で1,000 x gで2分間遠心分離機。
   2. 上清を慎重に取り除き、捨てます。500 μL のリシスバッファーを追加します。反転によって均質化します。
   3. 手順 6.2.1 と 6.2.2 を繰り返します。
3. 500 μL のキナーゼバッファーで免疫沈殿ビーズを 3 回洗浄します。
   1. 4°Cの冷蔵遠心分離機で1,000 x gで2分間遠心分離機。
   2. 上清を慎重に取り除き、捨てます。キナーゼバッファーを500μL追加します。反転によって均質化します。
   3. 手順 6.3.1 と 6.3.2 を 2 回繰り返します。
4. 4°Cの冷蔵遠心分離機で1,000 x gで2分間遠心分離機。
5. 上清を慎重に取り除き、捨てます。ビーズの吸引を避けるためにハミルトン注射器で上清の最後の滴を取り除き、上清を廃棄します。
6. 免疫沈殿ビーズに40μLのキナーゼバッファーを添加します。チューブを軽くたたいてビーズを再び吊り下げます。
7. ^γ[32P]ATP標識(最終容積は22.5μL、キナーゼバッファーを完備)のミックスを安全なロックチューブに用意します。
   1. 22.5 μL の最終体積に達するために、キナーゼバッファの必要な体積を追加します。
   2. マイクロピペットの20 μL先端の端を切る。ステップ6.6から免疫沈殿ビーズを数回上下にピペッティングして再中断する。これらのビーズの10 μLを安全ロックチューブに集めます。
   3. 10 μM ストック溶液から ATP を追加し、フィナーレ濃度の 50 mM に達します。処理されたサンプルの数に応じて、キナーゼバッファー内のATPのストック溶液の希釈は、体積が正しいことを確認するためにピペット1~2μLを可能にすることを示唆している。
   4. 基板の2.5 μgを加える(コフィリンまたはミエリン塩基タンパク質、本研究例ではMBP)。
8. γ[32P]ATP(3,000 Ci/mmol)の5 μCiを加えて反応を開始します。ゆっくりと上下にピペッティングして混ぜます。
   注意:この時点から、作業は、慎重な予防措置、専用の保護と適切な制御(放射性シールド、ガイガーカウンター、特定の廃棄物収集、個人の胸とと適切な制御と放射能操作専用の安全場所で行う必要があります。放射性暴露を検出するための指バッジ、フィルターチップ)。
9. 30°Cで20分間インキュベートします。
10. 5x Laemmliバッファーの6 μLで反応を停止します。
11. 95°Cで5分間熱します。
12. 室温で5分間10,000 x gの遠心分離機。
13. SDS-PAGE にロードします。移行に進みます。
    注:フリーγ[32 P]ATPの最前線が移行タンクの汚染を避けるためにゲルから出ないことに注意してください。
14. ゲルを室温で染めます。
    1. ガラス板からゲルを取り出します。
    2. 室温で3つの水浴を進めます。
    3. 室温でクマシーブルーで一晩ゲルを染めます。
    4. 温度で水でいくつかの洗浄浴でゲルを汚します。
15. ゲルをラップで包みます。
16. 蛍光体の画面上で1泊以上露出します。
17. リンメージャーの画面を読み取り、ラベル付きバンドを検出します。

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結果

LIMK2-1タンパク質を合成
LIMK2-1はデータバンクで言及されているが、これまでのところ、そのmRNA¹⁸の存在を示した論文は1つしかない。LIMK2aおよびLIMK2bの2つのホモログと比較して、LIMK2-1はタンパク質ホスファターゼ1阻害ドメイン(PP1i)として同定された余分なC末端ドメインを有する。このドメインのペプチドを標的とする抗体を設計し、...

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ディスカッション

本明細物では、我々は、その配列およびそのホモログ、LIMK2aおよびLIMK2b²⁰に基づいてキナーゼであると考えられる新しいタンパク質LIMK2-1を分子レベルで特徴付けるために堅牢な生化学的ツールを使用した。

まず、特定の抗体を用いたウエスタンブロット分析を用いてタンパク質レベルでLIMK2-1の存在を実証した。その後、LIMK2aとLIMK2bを調節することが知?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody anti-actin	Sigma-Aldrich	A1978	for Western Blot
Antibody anti-c-Myc	Invitrogen	MA1-21316	for Western Blot
Antibody anti-cofilin	Cell signaling Technology	3312/5175	for Western Blot
Antibody anti-GFP	Santa Cruz	sc-9996	for Western Blot
Antibody anti-HA	Roche Applied Science	11687423001	for Western Blot
Antibody anti-phospho-cofilin	Cell signaling Technology	3313	for Western Blot
Antibody Anti-PP1i	Eurogentec	designed for this study	for Western Blot
Aprotinin	Euromedex	A-162B	for lysis buffer
ATP	Invitrogen	PV3227	for γ[32P] labeling
γ[32P] ATP	Perkin Elmer	NEG502A	for γ[32P] labeling
BES buffered saline	Sigma-Aldrich	14280	for transfection
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich	G9422	for lysis and kinase buffer
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	for Laemmli
BSA	Sigma-Aldrich	A3059	for blocking buffer
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B0126	for Laemmli
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3881	for transfection
Centrifuge	Sigma	111-541
Collagen R	Pan Biotech	P06-20166	for transfection
Control siRNA	Ambion	AM4611	for PP1i antibody specificity
Coomassie PageBlue Protein Staining Solution	Thermo-Fisher	24620	for gel staining
EDTA	Sigma-Aldrich	3690	for lysis buffer
Electrophoresis Unit	Biorad	Mini-Protean	for Western Blot
EZview Red anti-HA affinity gel	Sigma-Aldrich	E6779	for immunoprecipitation
GeneSys software	Ozyme		for Western Blot acquisition
GeneTolls software	Ozyme		for Western Blot quantification
GFP-trap beads	Chromtek		for immunoprecipitation
Glycine	Euromedex	26-128-6405	for transfer buffer
GST-cofilin	Upstate Cell signaling	12-556	for γ[32P] labeling
Hamilton syringe 100 mL	Hamilton	710	to remove carefully supernatant from beads without aspirating them
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	for kinase buffer
ImageQuant TL software	GE Healthcare		for radioactivity acquisition and quantification
LIMK2 siRNA	Ambion	s8191	for PP1i antibody specificity
Leupeptin	Sigma-Aldrich	SP-04-2217	for lysis and kinase buffer
MBP	Upstate Cell signaling	13-173	for γ[32P] labeling
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	for kinase buffer
MnCl2	Sigma-Aldrich	244589	for kinase buffer
NaCl	Euromedex	1112	for lysis and kinase buffer
NaF	Sigma-Aldrich	S-1504	for lysis and kinase buffer
Okaidic acid	Euromedex	0-2220	for lysis buffer
PMSF	Sigma-Aldrich	78830	for lysis and kinase buffer
p-nitrophenylphosphate	Euromedex	1026	for lysis buffer
PVDF membrane Immobillon-P	Merck-Millipore	IPVH00010 pore size 0,45 mm	for Western Blot
Rotating wheel	Labinco		for bead incubation
Safe lock eppendorf	Eppendorf	0030120.086	for kinase assay
SDS	Sigma-Aldrich	5030	for Laemmli and migration buffer
Sodium orthovanadate	LC Laboratories	S8507	for lysis and kinase buffer
Sodium pyrophosphate	Fluka	71501	for lysis buffer
Super Signal West Dura	Protein Biology	34075	for Western Blot
Syngene Pxi	Ozyme		for Western Blot
Tissue extracts	Biochain	P1234035 Brain P12345152 Lung P1234149 Liver P1234188 Pancreas P1234260 Testis	for Western Blot analysis
Transfer Unit	Biorad	Mini-Trans-Blot	for Western Blot
Tris	Euromedex	26-128-3094 B	for lysis buffer
Tween-20	Sigma-Aldrich	P7949	for blocking buffer
Typhoon FLA9500	GE Healthcare		to read autoradiography
Typhoon Trio	Amersham Bioscience		to read autoradiography
Whatman paper	GE Healthcare	3030-672	for Western Blot