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要約

シナプス前形成は、シナプスタンパク質の蓄積を含む動的なプロセスを適切な順序で行う。この方法では、シナプス前形成は「ニューロンボール」培養物の軸シート上にプレシナプスオーガナイザータンパク質と結合したビーズによって引き起こされ、シナプス形成前にシナプスタンパク質の蓄積が解析されやすくなる。

要約

神経発達の間、シナプス形成は神経回路を確立するための重要なステップである。シナプスを形成するには、シナプスタンパク質は、細胞体からの輸送および/または未熟なシナプスにおける局所翻訳によって適切な順序で供給されなければならない。しかし、シナプスタンパク質がシナプスに適切な順序で蓄積する方法を完全に理解していません。ここでは、ニューロンボール培養とビーズの組み合わせを用いてシナプス前形成を誘導する新しい方法を提示する。ニューロン細胞凝集体であるニューロンボールは、細胞体やデンドライトから遠く離れた軸シートを提供するため、細胞体の圧倒的なシグナルを避けることで、シナプス前の弱い蛍光シグナルを検出することができます。シナプス前形成を引き起こすビーズとして、刺激性前シナプスオーガナイザーであるロイシンリッチリピート膜神経神経2(LRRTM2)と共役のビーズを使用します。この方法を用いて、シナプス小胞タンパク質である小胞性グルタミン酸トランスポーター1(vGlut1)が、活性ゾーンタンパク質であるMunc18-1よりも早くプレシナプスに蓄積することを実証した。Munc18-1は、細胞体を除去した後も、プレシナプスに翻訳依存的に蓄積した。この知見は、細胞体からの輸送ではなく、軸ゾンにおける局所翻訳によるMunc18-1蓄積を示す。結論として、この方法は、シナプス前シナプスおよびシナプスタンパク質の供給源におけるシナプスタンパク質の蓄積を分析するのに適している。ニューロンボール培養は単純で、特別な装置を使用する必要がないため、この方法は他の実験プラットフォームにも適用可能です。

概要

シナプス形成は、神経回路1、2、3の発達中の重要なステップの1つである。シナプス前およびポストシナプスで構成される特殊なコンパートメントであるシナプスの形成は、軸線とデンドライトの適切な認識、活性ゾーンおよびポストシナプス密度の形成、および適切なアライメントを伴う複雑で多段階のプロセスである。イオンチャネルおよび神経伝達物質受容体1、2.各プロセスでは、多くの種類のシナプスタンパク質が、細胞体からシナプスタンパク質を輸送したり、コンパートメント内の局所翻訳によって適切なタイミングでこれらの特殊なコンパートメントに蓄積します。これらのシナプスタンパク質は、機能性シナプスを形成するために組織的に配置されていると考えられる。シナプス形成を伴ういくつかのシナプスタンパク質の機能不全は、神経疾患4,5をもたらす。しかし、シナプスタンパク質が適切なタイミングでどのように蓄積するかは不明です。

シナプスタンパク質がどのように組織的に蓄積するかを調べるには、シナプスタンパク質の蓄積を時系列順に調べる必要があります。いくつかの報告は、ニューロン6、7の解離培養におけるシナプス形成を観察するライブイメージングを実証した。しかし、顕微鏡検査の下でシナプス形成を開始するニューロンを見つけるのは時間がかかります。シナプスタンパク質の蓄積を効率的に観察するには、研究者が形成を誘導したい時にシナプス形成を開始する必要があります。第2の課題は、細胞体からの輸送またはシナプス中の局所翻訳によるシナプスタンパク質の蓄積を区別することです。そのためには、細胞体からのシナプスタンパク質の輸送を許可しない条件下で翻訳レベルを測定する必要があります。

ニューロンボール培養とビーズの組み合わせを用いて、シナプス前形成を誘導する新規のシナプス形成アッセイを開発した。ニューロン球培養は、細胞体9、10を取り巻く軸シートの形成に起因する軸次表現型を調べるために開発される。興奮前シナプスを誘導する前シナプスオーガナイザーであるロイシンリッチリピート膜神経神経2(LRRTM2)と共役した磁気ビーズ(図1A)11、12、13を用いた。LRRTM2ビーズを用いることで、ビーズが塗布された時点でシナプス形成が開始される。これは、シナプス前形成がニューロンボールの数千の軸で同時に始まることを意味し、したがって、シナプスタンパク質の蓄積の正確な時間経過を効率的に調べることができる。また、ニューロンボール培養は、細胞体を除去することにより、ソマからのシナプスタンパク質の輸送をブロックすることが容易である(図1B)8.我々はすでに、細胞体のない軸ソンが生き残ることができ、細胞体を除去した後、少なくとも4時間は健康であることを確認しました。したがって、このプロトコルは、シナプスタンパク質がどこから(細胞体または軸)由来し、シナプスタンパク質が組織的に蓄積するかを調するのに適しています。

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プロトコル

本原稿に記載された実験は、横浜市立大学動物管理利用委員会に概説されたガイドラインに従って行われました。

1. ぶら下がりドロップ培養としてのニューロンボールの調製(インビトロ(DIV)0-3)

注:ニューロンボール培養の調製のためにここに説明する手順は、以前に佐々木群によって報告された方法に基づいており、いくつかの変更9,10.また、解離培養14のバンカー法からいくつかの手順を採用した。

  1. 解剖を開始する前に以下を確認する
    1. 必要なすべてのソリューションを準備し、オートクレーブ/ろ過によって事前に殺菌します。
    2. この皮質ニューロン培養の各ステップで使用されるすべての器具と材料を準備してください。
    3. スプレーし、70%エタノールで層の空気の流れキャビネット、解剖テーブル、立体顕微鏡のステージプレート、はさみ、および鉗子を拭きます。
  2. CO2の塗布時にマウスを安楽死させ、腹部を解剖してE16胚を得る。
  3. 鉗子の微細な先端の助けを借りて慎重に胚から脳を取り除き、HEPESバッファー塩溶液(HBSS)の4 mLを含む60mm細胞培養皿に移します。
    注:解剖媒体HBSSは10 mM HEPES(pH 7.4)、140 mM NaCl、5.4 mM KCl、1.09 mM Na2HPO 4、1.1 mM KH2PO4、5.6mM D-グルコース、および5.64 μMフェノール赤を含む。
  4. 頭皮を取り外し、嗅球を切り、立体顕微鏡下の鉗子の細かい先端を使用して各大脳半球から皮質を分離し、新鮮なHBSSを含む別の60ミリメートルの皿に移す。各別々のニューロンボール培養に少なくとも3〜5個の胚を使用します。
  5. 皮質を薄皮の流れ細胞培養フードで微細解剖ばばしで小片に切ります。
  6. 15 mLチューブにひきものコルチスを移し、37°Cの水浴で4.5分間HBSSで0.125%トリプシンの4mLでミンチコルチをトリプシン化します。
    注:このトリプシン化時間は、時間の増加(> 4.5分)がはるかに多くの死んだニューロンにつながるので、効率的なニューロン培養のために重要です。
  7. 細胞凝集体を無菌転写ピペットで10mLのHBSSを含む新しい15 mLチューブに移し、37°Cで5分間インキュベートする。
  8. 細胞凝集体を、グルタマックス、B27サプリメント(NGB培地)、0.01%DNase Iおよび10%馬血清を含む神経基球媒の2mLを含む新しい15 mLチューブに移す。
  9. 火磨き細かいガラスのパスツールピペットを使用して、上下(3〜5回)繰り返しピペッティングして、トリプシン化された皮質をトリビュートします。
    注:火磨かれた細かいガラスパスツールピペットの直径は、バンカー法紙14に記載されているように非常に重要です。ピペットが狭すぎてコルチスを渡せない場合は、2~3種類のサイズを持つピペットを準備し、より大きなピペットから試してみてください。
  10. ニューロンボールを調製するために、上記の細胞懸濁液を取り、NGB培地を使用して1 x 106細胞/mLに細胞密度を調整します。
  11. 10cm培養皿の上蓋内に10,000個/滴(1滴は10μL)を含む垂れ下がり滴として皮質ニューロンを培養する。
  12. 培養皿の底部に7mLのリン酸緩衝生理食塩分(PBS)を加え、加湿状態で5%CO2を含む37°Cで3日間インキュベーターに保管し、ニューロンボール形成を可能にする。

2. PLLコーティングガラスカバーリップと培養メンテナンス(DIV 3-11)にニューロンボールを配置する

注:ガラスカバーのコーティングを行う前にポリLリジン(PLL)でスリップする前に、洗剤を使用してカバースリップを洗浄することが重要です。ガラスカバースリップは、神経培養とPLLによる均一なコーティングのために、時にはそれほどきれいではありません。不均一なPLLコーティングは、ニューロンボールの不均一な軸線延長をもたらす可能性があります。

  1. 1/20希釈中性非リン非リン洗剤に1~3晩セラミックラックにカバーリップを浸します。
  2. カバースリップを超純水で8回洗い、200°Cのオーブンで12時間殺菌します。
    注:ここからのすべてのステップは、層状の空気流細胞培養フードで行う必要があります。
  3. 焼きカバーを100mmの皿に移します。蓋と底皿の間にパラフィルムで皿を密封した後、焼いたカバースリップは長期保存のために保つことができる。
  4. (オプション)カバースリップにパラフィンドットを適用します。ドットは、ニューロンボールをプラスチック皿に直接接触させ、免疫染色中にカバースリップから切り離されるニューロンボールを防ぐためのスペースを作ります。約90°Cでお湯浴中に適当なボトルにパラフィンを溶かします。パストゥールピペットをパラフィンに浸し、急速に触れてカバースリップの端近くに3つのスポットを作ります。
  5. PLL溶液(ホウ酸バッファー内15μg/mL)を使用して60mmの皿にパラフィンビーズガラスカバーにPLL(MW>300,000)を塗り、CO2インキュベーターで少なくとも1時間保持します。
  6. PBSで4回洗浄した後、PLL被覆カバーリップを各ウェルに350μLのNGB培地を含む4ウェルプレートに移し、シトシンβ-D-アラビノウラノシド塩酸塩(AraC,3 μM)を培地に移し、分裂細胞を死滅させる。
  7. PLLコーティングされたカバーを含むこの4ウェルプレートは、ニューロンボールを転写する前に、培地の温度が37°Cに達することを確認するために、少なくとも20分間CO2インキュベーターに入れ続けてください。
  8. DIV 3で「ニューロンボール」が非常によく形成された場合は、CO2インキュベーターに保持された4ウェルプレート(5ニューロンボール/ウェル)内のPLLコーティングされたカバーリップに転送します。
  9. 48時間後、ニューロンボール培養培地を新鮮なAraCフリーNGB培地に置き換えます。この手順の直前に温度が37°Cで準備されている層板の流れ細胞培養フードにホットプレートを使用してください。
    注:培養物がCO2インキュベーターの外側にある時間を短縮するために、ホットプレート上で可能な限り迅速に中変化を実行する必要があります。
  10. このニューロンボール培養をCO2インキュベーターに入れ、DIV 11まで保持してください。
    注:DIV 11-12では、1〜2ミリメートルまでニューライトを伸ばすニューロンボールが実験に使用されます。

3. 細胞体の有無にかかわらずニューロンボール培養にLRRTM2ビーズを塗布する(DIV 11-12)

注:ニューロンボール培養にLRRTM2ビーズを適用する前に、細胞体を除去することをお勧めします。したがって、最初にLRRTM2ビーズを調布し、次に細胞体を除去し、後でLRRTM2ビーズをできるだけ早く培養に適用する。ビオチニル化LRRTM2は、野木グループ(横浜市立大学)が条件付き媒体として提供しています。彼らは、E由来のビオチン受入配列およびビオチンリエーゼを含む発現ベクターを使用する。コリ(ビラ)15歳,16は、ビオチンをLRRTM2に付着させ、発現ベクターがExpi293式システムに含まれるExpi293F細胞にトランスフェクトされる。ベクトル情報は補足図 1で使用できます。バイオチリン化LRRTM2結合ストレプトアビジンビーズは、LRRTM2-Fc-共役タンパク質Aビーズと比較して免疫染色の背景を大幅に減少させ、プロトタイプLRRTM2系8に使用される。

  1. ビオチン化LRRTM2ビーズの調製
    1. ビオチン化LRRTM2を発現するExpi293F細胞の条件付き培地から過剰なビオチンを除去するには、PBSの0.8mL(合計2.5mL)を混合した条件付き培地の1.7mLをPD-10ゲル濾過カラムに適用する。PD-10カラムは、25mLの超純水と25mLのPBSで予め平衡化されています。
    2. PBSの3.5 mLで溶出し、LRRTM2ストックとしてフロースルーを収集します。
      注:このLRRTM2ストックは、アリコートに分配され、長期のために-80 °Cで保存することができます。ビオチン化LRRTM2の発現レベルは、ロットごとに異なる場合があります。したがって、ビーズに結合するLRRTM2ストックの適切な体積は、新しいLRRTM2ストックが初めて使用される場合に、ニューロンボールに十分なプレシナプスを形成するように決定されるべきである。
    3. ストレプトアビジンコーティング磁性粒子(直径:4-5 μm)の懸濁液からマイクロ遠心管まで20μLを取ります。ビーズをネオジム永久磁石に取り付けた手作りの装置に固定し、1.5 mLマイクロ遠心管で100μLのPBS-MCBCで3回洗浄します。
      注: PBS-MCBC には、5 mM MgCl 2、3mM CaCl 2、0.1% BSA、および 0.1% 完全 EDTA フリーを含む PBS が含まれています。
    4. ビーズから完全にPBS-MCBCを取り除き、所定の量のLRRTM2ストック(通常500~1,000 μL、注3.1.2)を洗浄ビーズに追加します。1-2時間4°Cで回転子を使用して混合物をインキュベートします。
    5. ビーズをPBS-MCBCの100 μLで2回洗い、後で100μLのNGB培地で洗います。
    6. ニューロンボール培養への適用のために、NGB培地の50μLでLRRTM2ビーズを再中断します。
    7. ビオチン化-LRRTM2タンパク質を添加する以外は、別のマイクロ遠心管に対照ビーズ(陰性対照)を調製するための同じ手順を使用します。
  2. DIV 11-12でニューロンボールから細胞体を除去し、LRRTM2ビーズを塗布
    1. 4ウェルプレートのウェルに「セル本体(+)」および「セル本体(-)」とラベルを付けます。
    2. 45°角で黄色の先端の終端を45°の角度で切り、以前に立体顕微鏡下で70%のエタノールを噴霧したかみそり刃で(図1B)。
    3. ニューロンボールの細胞体領域に黄色の先端端を置き、吸引によって細胞体を取り除きます(図1B)。
    4. 実験の各指定条件を識別するには、ウェルに「LRRTM2ビーズ」および「制御ビーズ」として再度ラベルを付けます。
    5. ニューロンボール培養にLRRTM2を塗布し、フェライト磁石を使用してプレートの底部に1分間沈み、シナプス前形成を開始します。この手順では、すべてのビーズを同時にタッチダウンできます。特に、LRRTM2ビーズを同期的にインキュベーションする短時間(例えば、30分と1時間)に有効であろう。
    6. 時間コース実験を行うには、それぞれ0分、30分、1時間、2時間、4時間、18時間とラベルを付け、指示された時間間隔でLRRTM2ビーズを適用します。
    7. LRRTM2ビーズを添加した後、指定された時間(0分~18時間)のビーズでニューロンボール培養物をインキュベートし、プレシナプスを形成する。

4. 免疫染色と顕微鏡検査

注:軸が4時間後に細胞体の不在で徐々に死ぬ傾向があるので、細胞体の有無にかかわらず実験条件でLRRTM2ビーズを使用してインキュベーションを介して4時間の細胞を固定します。LRRTM2 ビーズを使用した時間経過の場合は、指定した時間にセルを固定します。

  1. LRRTM2ビーズによるシナプス形成前形成後のニューロン球培養におけるニューロンの固定と染色
    1. NGB培地を取り出し、室温で20分間PBS(250 μL/ウェル)で4%のPFAでニューロンボールを固定し、500μLのPBSで500μLを5分毎に5分ずつ洗浄します。
    2. 固定細胞をTBS(トリスバッファー生理生理/50 mMトリス-HCl(pH 7.3)および150mM NaCl)で5分以上洗浄します。
    3. 0.3%トリトンX-100を5分間含むTBSでニューロンボール培養の細胞/軸を透過化します。
    4. ブロッキングバッファー(0.1%トリトンX-100および5%NGS(通常のヤギ血清)でブロッキングのための細胞を1時間保つ。
    5. 一次抗体で細胞をインキュベートします。抗ウサギ-vGlut1(小胞グルタミン酸トランスポーター1(1:4000))および抗マウス-Munc18-1(1:300)を抗体希釈剤で希釈し、4°Cで一晩希釈した。
    6. カバースリップを免疫蛍光(IF)バッファー(TBSで0.1%トリトンX-100および2%BSA)で4回洗浄し、蛍光色素(Alexa色素)で30分間インキュベートする第2抗体。アンチマウスIgG-Alexa 555(1:500)、アンチウサギIgG-Alexa 488(1:1000)。
    7. PBSで4',6-ジアミド-2-フェニリンドール(DAPI、1 μg/mL)で5分間ニューロンの細胞体の核を染色します。
    8. カバースリップをPBSで3回洗い、167mg/mLポリ(ビニール)アルコールと6mg/mL N-プロピルガレートを含む取り付け媒体を使用してガラススライドに取り付けます。
    9. 顕微鏡検査まで-20°Cの冷蔵庫にガラススライドを保管してください。ガラススライドの蛍光信号は、スライドが-20°Cで保存されている場合、少なくとも1年間検出可能です。
  2. 蛍光顕微鏡下での画像撮影
    1. 60Xオイル浸漬レンズを使用して冷却されたCCDカメラで反転蛍光顕微鏡下で差動干渉コントラストとIF画像をキャプチャします。画像集録ソフトウェアの場合は、ソフトウェアインストールされた顕微鏡システムを使用します。イメージ J をイメージ解析ソフトウェアとして使用します。
    2. 次の式を使用して、軸ゾンのシナプス前の IF 強度を測定します。ビーズ上の関心領域の強度 (ROI) – ビーズから 20 μm に沿ったオフビーズ領域強度/軸上強度 – 背景強度。この比強度はタンパク質蓄積指数を提供する(図4A)。Image J ソフトウェアを使用して、元の 16 ビット イメージの測定を実行します。
    3. LRRTM2ビーズで誘導されたシナプス前における特定のタンパク質の蓄積レベルを定量化するには、常に顕微鏡(60X)を用いて細胞体から離れた2分野以上の領域を選択する。
      注:画像化のためのニューロンボールの領域の選択は、密な軸が細胞体の近くにあり、ニューロンボールの周辺が単一軸を提供することができるので、重要です。
    4. 正確な測定を行うには、5種類の軸位フィールド(セルボディからの同様の距離)/カバースリップを選択します。
    5. 異なる日と実験の間に同一のイメージング条件を保つ

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結果

ここでは、ニューロンボール培養の軸シートのLRRTM2誘導プレシナプスにおけるシナプス前タンパク質の蓄積の代表的な結果を示す。シナプス前タンパク質として、興奮性シナプス小胞タンパク質vGlut1と活性ゾーンタンパク質Munc18-1を分析した。また、vGlut1およびMunc18-1の蓄積の時間経過を事前シナプスで調べ、細胞体を除去する軸ソンとタンパク質合成阻害剤を用いて、プレシナプス中のMunc18...

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ディスカッション

ニューロンボール培養を用いてLRRTM2ビーズで刺激されたシナプス前形成を調べる新しい方法を開発した。現在、シナプス前形成アッセイのほとんどは、ポリD-リジン(PDL)コーティングビーズおよび解離培養/マイクロ流体室20、21、22を含む。この方法の利点の1つはLRRTM2ビーズです。LRRTM2は、特異的に11、12、13、PDLビーズを形...

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開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

この研究の一部は、JSPS科学研究助成金(KAKENHI)(第2250036号、25430068、16K07061)(佐々木Y.生体化LRRTM2タンパク質を提供してくださった野木輝和先生と寝屋崎真紀子さん(横浜市立大学)に感謝申し上げます。また、上地穂波さんと石井理恵さんの技術支援にも感謝します。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibody diluentDAKOS2022
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch715-585-151
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch711-545-152
mouse anti-Munc18-1BD Biosciences610336
B-27 Supplement (50X), serum freeThermo Fisher Scientific17504044
Bovine Serum Alubumin (BSA)Nacalai Tesque01863-48
Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish)Nunc176740
Complete EDTA-freeRoche11873580001
cooled CCD cameraAndor TechnologyiXON3
CoverslipMatsunamiC015001Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm
Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC)Sigma-AldrichC1768
4',6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI)Nacalai Tesque11034-56
Deoxyribonuclease 1 (DNase I)Wako pure chemicals047-26771
Expi293 Expression SystemThermo Fisher ScientificA14635
Horse serumSigma-AldrichH1270
image acquisition softwareNikonNIS-element AR
Image analysis softwareNIHImage Jhttps://imagej.nih.gov/ij/
Inverted fluorecent microscopeNikonEclipse Ti-E
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061
Neurobasal mediaThermo Fisher Scientific#21103-049
Normal Goat Serum (NGS)Thermo Fisher Scientific#143-06561
N-propyl gallateNacalai Tesque29303-92
Paraformaldehyde (PFA)Nacalai Tesque26126-25

Paraplast Plus		Sigma-AldrichP3558
Poly-L-lysine Hydrobromide (MW > 300,000)Nacalai Tesque28359-54
poly (vinyl alcohol)SigmaP8136
Prepacked Disposable PD-10 ColumnsGE healthcare17085101
rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1Synaptic Systems135-302
SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent)Nacalai Tesque41506-04
Streptavidin-coated magnetic particlesSpherotech IncSVM-40-10diameter: 4-5 µm
TritonX-100Nacalai Tesque35501-15
TrypsinNacalai Tesque18172-94

参考文献

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