MicroRNAを分離およびシーケンシングし、オープンソースツールを使用してそれらを分析するための完全なパイプライン

要約

ここでは、小型RNAを分離し、マイクロRNAを強化し、ハイスループットシーケンス用のサンプルを準備するためのステップバイステップの戦略について説明します。次に、オープン ソース ツールを使用して、シーケンスの読み取りを処理し、マイクロRNA に整列する方法について説明します。

要約

すべての人間の転写物の半分は、マイクロRNAによって調節されると考えられている.したがって、マイクロRNA発現の定量化は、疾患状態の根本的なメカニズムを明らかにし、治療標的およびバイオマーカーを提供することができる。ここでは、マイクロRNAを正確に定量する方法について詳しく述べる。簡単に言えば、この方法では、マイクロRNAの分離、ハイスループットシーケンシングに適したアダプターへのライゲーション、最終製品の増幅、サンプルライブラリの作成について説明します。次に、得られたシーケンシング読み取りをマイクロRNAヘアピンに合わせる方法を説明し、その微分発現を定量化、正規化、および計算する方法を説明する。多目的で、強い、この結合された実験ワークフローおよびバイオインフォマティクスの分析はユーザーがティッシュの抽出から始まり、マイクロRNAの定量で終わることを可能にする。

概要

1993年1月に初めて発見され、現在では2000マイクロRNA近くがヒトゲノム2に存在すると推定されている。マイクロRNAは、典型的には21〜24ヌクレオチド長い小さな非コードRNAである。それらは遺伝子発現の転写後調節因子であり、多くの場合、タンパク質発現を抑え、mRNAを分解する標的遺伝子の3非翻訳領域(3-UTR)の相補部位に結合する。マイクロRNAの定量化は、遺伝子発現に関する貴重な洞察を与えることができ、いくつかのプロトコルは、この目的のために開発されています 3.

当社は、小型RNAシーケンシングおよびオープンソースバイオインフォマティクスツールを使用して正規化された読み取りを分析するための、定義された、再現性のある、長年にわたるプロトコルを開発しました。重要なことに、我々のプロトコルは、内因性マイクロRNAと外因的に送達されたマイクロRNAの両方を同時に同定し、リボソームRNAを含む他の小さなRNA種への読み取りを最小限に抑え、その読み取りを最小限に抑えることが可能です。rRNA)、RNA由来の小RNA(tsRNA)、反復由来の小RNA、およびmRNA分解産物を転写する。幸いなことに、マイクロRNAは5リン酸化および2-3ヒドロキシレート4であり、これらの他の小さなRNAおよびmRNA分解産物からそれらを分離するために利用することができる特徴である。マイクロRNAのクローニングとシーケンシングには、多くの場合、より迅速かつ簡単に多重化できるいくつかの商用オプションが存在します。しかし、キット試薬の独自の性質とその頻繁な変更は、サンプルランの比較を困難にします。当社の戦略は、アクリルアミドとアガロースゲル精製ステップを通じて、マイクロRNAの正しいサイズのみを収集するように最適化します。このプロトコルでは、オープンソースツールを使用してシーケンス読み取りをmicroRNAに合わせる手順についても説明します。この一連の命令は、私たちのライブラリの準備方法や商用方法を使用しているかどうかにかかわらず、初心者の情報学のユーザーに特に役立ちます。

このプロトコルは、いくつかの公開された研究で使用されています。例えば、ダイサー酵素がステムループ構造の内部ループから2つのヌクレオチドの距離で小さなヘアピンRNAを切断するメカニズムを同定するために使用された-いわゆる「ループカウントルール」5。我々はまた、これらの方法に従って、組換えアデノ随伴ウイルスベクター(rAV)から発現される送達された小さなヘアピンRNA(shRNA)の相対的な存在量を同定し、肝臓の前に許容できるshRNA発現の閾値を同定した。過剰なshRNA発現に関連する毒性⁶.このプロトコルを用いて、我々はまた、このマイクロRNA7の分解パターンを特徴付けながら、高度に発現した肝マイクロRNAであるマイクロRNA-122の不在に応答する肝臓のマイクロRNAを同定した。私たちは、多くの実験で一貫してプロトコルを使用してきたので、我々は縦方向にサンプル調製物を観察することができ、識別可能なバッチ効果がないことを確認しました。

このプロトコルを共有する上で、私たちの目標は、手頃な価格の機器や試薬、および無料のバイオインフォマティクスツールを使用して、事実上あらゆる組織または細胞株で高品質で再現可能なマイクロRNAの定量を生成できるようにすることです。

プロトコル

動物実験は、ワシントン大学の機関動物ケア・使用委員会によって承認されました。

小さなRNAライブラリの準備

1. RNA分離

1. 標準的なRNA単離試薬、またはマイクロRNA用に濃縮するキットを使用して、生物学的供給源からRNAを単離します。組織の場合は、液体窒素でスナップ冷凍サンプルから始め、あらかじめ冷やされたモルタルと害虫を使用して粉末に粉砕することをお勧めします。
2. RNA を定量し、RNA 整合性数 (RIN) を提供できる計測器で、各サンプルの RNA 整合性を測定します。LIN は >7 である必要があります。

2. 3' アダプターライゲーション

1. PCRストリップチューブでライゲーション反応を調製し、組み合わせることで、RNAの11 μL(1-3 μg、各サンプルに同じ量を使用)、10x T4 RNAリゲス反応バッファーの1.5 μL、ATPフリー、ポリエチレングリコール(PEG)の1μL、および3'リンカーの0.5μL(100μRnaユニバーサル)を調製します。カー)。
   注:ATPの不在は、miRNAの濃縮に役立ち、mRNA分解産物のクローニングを最小限に抑えます。PEGは分子集混化剤として作用し、ライゲーションの成功を高める。ユニバーサルmiRNAクローニングリンカーは、5'末端でRNAへの自己ライゲーション、循環、ライゲーションを防止する3'ブロッキング基(アミン)を有する。
2. 30-40 s. 氷上で30~40s.冷却して95°Cで試料を熱し、T4 RNA ligase 2の1 μLを加え、室温で2時間インキュベートし、サンプルがインキュベートされている間にゲル(ステップ2.3)を準備します。
   注:室温でのインキュベーションはリンカーリンカーライゲーションを防ぐのに役立ちます。また、T4 RNAリゲス1の使用にも成功しています。
3. 8M尿素(20x20cmゲルの場合)を含む15%ポリアクリルアミドゲルの30mLを調製する:尿素14.4g、10xトリスバッファーエチレンディアミンテトラセチン酸(TBE)の3mL、11.2 mLの40%19:1アクリルアミド、およびHLに_及ぶ。溶液は42°Cで溶解するのが最適です。鋳造の直前に、過硫酸アンモニウム(APS)の150μLと重合のためにテトラメチレチレンジアミアミン(TEMED)の30 μLを加えます。
4. プラスチック鋳造物に0.8mmの分離されたガラス板の間に注ぎ、櫛を挿入します。ゲルが固化したら(約20分)、タンクに0.5倍のTBEを加え、ピペッティングで残留尿素の井戸を洗います。
5. 尿素がゲルに入ることができるように、サンプルなしで25分間一定の375Vでゲルを事前に実行し、その後、再びウェルを洗浄します。
   注:使用する電源および電気泳動システムの種類によっては、電圧の量を減らす必要がある場合があります。
6. サンプルのライゲーションが完了したら、サンプルに15 μLのアクリルアミドローディング染料を追加し(1:1比の場合)、サーモサイクラーで95°Cで5分間変性します。
7. 37および44bpサイズのマーカーの25 ng/μLを調極し、1部アクリルアミド装填剤で希釈した。シーケンスは表 1に示されています。
8. ポリアクリルアミドゲルにサンプルをロードし、各サンプルの間に少なくとも1つのレーンを残します。ゲルの向きを追跡するために、非対称パターンで、マーカーの少なくとも2セットの20 μLをロードします。
9. 最初の 15 分間、一定の 375 V でゲルを実行し、残りの実行では一定の 425 V に増加します。ブロモフェノールブルーが底から約1〜4センチになるまで走り、約2時間かかります。
   注:必要に応じて、ブロモフェノールブルーが底部から約1〜4cmになるまで、ゲルは、より長い期間、より低い一定電圧で実行されてもよい。
10. プレートセパレータを使用してガラス板からゲルを取り出し、プラスチック製のページプロテクターにゲルを置きます。蒸留水の500μLで臭化エチジウムの5μLを希釈し、ピペットをトップライトブルーマーカーのすぐ上のマーカーレーンに入れます(図1A参照)。
    注意:臭化エチジウムに手袋を使用し、現地の規制に従って廃棄物を処分してください。5分間座りましょう。
11. 紫外線(UV)光の下で、きれいなかみそり刃を使用して各レーンの上から下のマーカーにゲルをカットします(図1Aを参照)。実験室のシールフィルムの4 x 4 cmの正方形に移し、次に約4切れ水平に3つの切り傷でゲルを切り、12の小さな正方形を作り出す(図1B参照)。
12. 0.3M NaClのピペット400μLをシールフィルムスクエア上に、1.5mLのシリファイドチューブに漏斗ゲル片を入れます(図1C参照)。一晩4°Cでナタレータでサンプルを攪拌します。
    注:他の低保持性1.5 mLチューブは、シリコンチューブに置き換えることができます。
13. 4°Cで少なくとも12時間の攪拌の後、サンプルを取り出し、100%エタノールの円錐管と一緒に氷の上に置きます。
14. 400 μLの上清を新しいチューブに移し、100%エタノールの1mLと15mg/mLグリコーゲン増沈剤の1μLを添加する。可能な限り多くの上清を収集し、4°Cで回転し、必要に応じてより多くのピペッティングを行うようにしてください。-80 °Cで1時間、2時間以上-20°Cに置きます。グリコーゲンコシピタントは、ペレットの可視性と回復を改善します。
15. エタノールの痕跡をすべて取り除き、ペレット空気を5分間乾燥させて、17,000 x gで4°Cでスピンします。

3. 5' リンカーライゲーション

1. 6.5 μLのヌクレルフリー水でピペッティングしてペレットを再び中断します。ペレットを最初に数分間水に座らせることは、再懸濁液に役立ちます。
2. ペレットを回転させ、水中で再サスペンドした後、100 μM 5'-リンカーの0.5 μLを追加します(バーコード付き;表1、T4 RNAリガーゼバッファーの1 μL、10mM ATPの1 μL、PEGの1 μL)。90°Cで30°Cで熱し、氷の上に置きます。T4 RNAリゲス1の1 μLを加え、室温で2時間インキュベートします。
3. 0.3 M NaClの400 μLを加え、続いて400μLの酸性フェノール/クロロホルムを加えます。渦30秒-1分(溶液は曇りに見える)、マイクロ遠心分離機(〜17,000 x g)で最高速度で10〜15分間4°Cで回転します。 最上層を引き出し、新しい1.5 mLチューブに入れます。
   注: 下のレイヤーのピペッティングは避けてください。
4. クロロホルムの350 μLを一時的に加え、最大速度(約17,000 x g)で10分間4°Cで回転させます。後で上部を引き出し、新しい1.5 mLチューブに入れます。グリコーゲン同沈剤1.5μL、エタノール100%の1mLを加えます。
   注: 繰り返しますが、最下層のピペッティングは避けてください。
5. 渦は短時間、少なくとも1時間、または-20 °C一晩-80°Cに置きます。

4. 逆転写(RT)

1. 42 °Cのヒートブロックをオンにします。20-30分間4°Cと〜17,000 x gでサンプルをスピンし、すべての上清を取り除き、ペレット空気を5分間乾燥させます。
2. 核リースフリー水の8.25 μLでペレットサンプルを再中断し、次に、cDNA合成キットから100 μM RTプライマー(表1)の0.5μL、および2x RT反応ミックスの5 μLを追加します。42 °Cで3分間インキュベートします。
3. 各サンプルに10x RT酵素の1.5 μLを加え、サーモサイクラーで30分間42°Cでインキュベートします。-20 °Cに置くか、加水分解および中和を続けます。
   注: いくつかの RT キットは、ステップ 4.2 および 4.3 に使用できます。
4. アルカリ加水分解および中和を行う:150 mM水酸化カリウム(KOH)溶液の1mLを作る(1M KOHの150 μL、1MトリスベースpH 7.5の20 μL、H2 Oの830 μL)および1mLの1mL150 mM塩塩酸(HL)の150mM塩酸(HL)および150mMの水塩酸(HL)および150μLを作るH₂O)。
5. サンプルに追加する前に、KOH溶液を中和するために必要なHClの量を決定します。一般に、HClの約20〜24 μLは、KOHの25μLを中和する。pH ストリップの組み合わせを確認して、正しい範囲(pH 7.0 ~ 9.5)にあることを確認します。
6. 150 mM KOH溶液の25 μLを加えてサンプルを加水分解し、95°Cで10分間インキュベートします。
7. ステップ4.4で決定した150mM HClの量を加えて試料を中和し、7.0〜9.5の間の最終試料pHを得た。

5. PCR増幅

1. 中和後、PCR反応を調圧する:29.5 μLの水、10x Taqバッファーの5 μL、dNTPの1 μL、25μMフォワードプライマーの2μL(表1)、25μMのリバースプライマー(表1)、Taqの0.5 μL、および逆転写の10μL.
2. 次のPCR反応を実行します:2分間94°C、45sの場合は94°Cの20サイクル、75sの場合は50°C、60sの場合は72°Cです。
3. ステップ5.2から5 μLの製品を使用して、約2~4サイクルの2回目のPCR反応を実行します。混合:水の34.8 μL、10x Taqバッファーの5 μL、dNTPの1 μL、25 μM前方プライマーの1 μL(表1)、25 μM逆プライマーの1 μL(表1)、およびTaqポリメラーゼの0.2 μL。手順 5.2 で概説されているのと同じサーモサイクラー パラメータに従ってください。
   注:2つのPCR反応を行う目的は、20サイクルの最初のサイクルと2〜4回以上の2つ目のPCDNA反応を行う目的で、増幅されたcDNAの量が動的範囲(すなわち飽和量ではない)にあることを確認することです。

6. アガロースゲル精製

1. 低溶融アガロースで4%アガロースゲルを準備します。40 μL 以上の PCR 製品をゲルにロードし、染料をロードします。100 bp および 25 bp サイズのマーカーを読み込みます。
   注:25 bpのはしごはリンカーリンカーのライゲーションプロダクトから増幅されたプロダクトを区別するのに役立つ。低融溶性アガロースゲルは、従来のアガロースゲルよりも細心の注意を払って鋳造する必要がありますので、メーカーの指示に密接に従ってください。
2. ゲル抽出の場合は、ゲルに表示されるが飽和していないサイクル番号(通常は22~24サイクル)を選択します。複数のサンプルを実行する場合は、同様の強度帯を選択します。
3. 125 bp バンドの上にあるバンドをカットします(25 bp はしごの暗いバンド、図 1Dを参照)。ゲル抽出キットを使用して、4%のゲルに基づいてバッファを追加するためのメーカーの指示に従って、その後、室温でバッファにアガロースを溶解するために振ります。
   注:55 °Cで溶解すると、リンカーリンカーライゲーションの可能性が高まります。
4. 製造元のゲル抽出指示に従い、溶出バッファーまたは水の 30 μL を溶出します。製品がゲルに弱く見えた場合は、溶出量を20μLに減らします。
5. 敏感な技術を使用してcDNA濃度を測定し、シーケンスのためのサンプルライブラリを準備します。準備は、使用するシーケンスのタイプによって異なります。
   注: シーケンス ライブラリの最小要件は、通常、10 μM 製品の 10 μL ボリュームです。濃度が低すぎる場合は、プールとエタノールがサンプルを沈殿させ、所望の濃度にライブラリを持ち込みます。
6. 使用可能な機器を使用してサンプルをシーケンスします。一般的な例としては、50 bp シングル読み取り用のキットを使用してサンプルを実行し、FASTQ 出力形式で約 15 ~ 2500 万の読み取りを取得します。

小型RNA配列アライメントとバイオインフォマティクス

7. データアップロード

1. 各シーケンス実行から生成された FASTQ ファイルをダウンロードします。^miRbase.org8,⁹,¹⁰からマイクロRNA ヘアピン シーケンス^のリストをダウンロードします。
2. www.usegalaxy.orgで Galaxy アカウントを生成し、このアカウントに読み取りシーケンスの FASTQ ファイルをアップロードします。
3. バーコードシーケンスのテキストファイルをGalaxyアカウントにアップロードします(バーコード.txtなど)。
4. miRBase.orgのようなデータベースから、マイクロRNAヘアピンのFASTAファイルをGalaxyアカウントにアップロードします。マウス(マウスヘアピンズ.fa)またはヒト(humanhairpins.fa)マイクロRNA前駆体の例は、補足表2および補足表3に記載されている。

8. アダプターの取り外し、バーコードの並べ替え、トリム

1. 左側のタブで、ゲノムファイル操作 > FASTA/FASTQ > クリップアダプタシーケンスに移動します。
2. FASTA または FASTQ 形式の入力ファイルで、ドロップダウン リストから FASTQ ファイルを入力します。シーケンスの最小長を 18 に変更します。[ソース]を変更してカスタム シーケンスを入力します。CTGTAGGCを入力します。他のすべての既定のパラメーターを保持します。[実行]をクリックします。
   注:18ヌクレオチドより短いシーケンス読み取りは、マイクロRNAに一意にマッピングすることは困難であり、多くの分解産物を含んでいます。
3. 左側のタブで、ゲノムファイル操作 > FASTA/FASTQ > バーコードスプリッタに移動します。
   注:Galaxyの機能とヘッダーは定期的に更新されるので、同等のツールやその場所を見つけるために検索機能が必要な場合があります。インデックス付きプライマーを使用する商用キットは、多くの場合、すでにバーコードでソートされています。したがって、市販のキットから始める場合、このステップとバーコードトリムステップは必要ありません。
4. バーコードを使用するには、barcodes.txt を指します。 ライブラリを分割するには、前の手順で作成したデータ ファイルのクリップを使用します。[許可された不一致の数数に1を入力してください。[実行]をクリックします。
5. 最初の 4 つのヌクレオチドをトリムする:テキスト操作 > 先頭または末尾の文字をトリムします。[入力データセット]で、データセット コレクションであるフォルダ アイコンをクリックします。データのラベルバーコードスプリッタを含むサンプルのバッチファイルを選択します。最初からこの位置までのトリムで、5 と入力します。では、入力データセットは FASTQ 形式で入力されますか? [実行]をクリックします。実行には数分かかる場合があります。

9. マイクロRNAへの読み取りの位置合わせ

1. ギャラクシーでは、ゲノミクス分析> RNA-Seq > セイルフィッシュトランスクリプト定量11にナビゲートします。
2. 質問の場合は、履歴から参照トランスクリプトームを選択するか、組み込みのインデックスを使用しますか? ドロップダウン リストからアップロードされたファイル mousehairpins.fa を入力します。FASTA/Q ファイルで、フォルダ アイコンをクリックしてデータセット コレクションを使用し、コレクションのトリムを含むファイルを選択します。[実行]をクリックします。実行には数分かかる場合があります。
3. 右側の履歴タブで、コレクションのセイルフィッシュをクリックします。個々のファイルをクリックし、ディスク アイコンをクリックしてローカル コンピュータに保存します。個別にダウンロードしたファイルは、まず圧縮解除する必要があります。また、スプレッドシートにインポートする目的で.txt 拡張機能を使用して再保存する必要がある場合もあります。
4. 各スプレッドシート ファイルを開き、[NumReads]列の名前を処理条件に変更します。列をマージして、最初の列に microRNA の行列を生成し、後続の列の条件ごとの読み取り数を生成します。
5. 各治療条件に対して分別に表現されたマイクロRNAを計算するには、DESeq2¹²などのプログラムの入力として生の microRNA 読み取りカウントを含むファイルを使用します。DESeq2 は、ゲノミクス分析 > RNA-seq > DESeq2タブに銀河に存在します。
6. 生の読み取りを正規化されたマイクロRNA読み取り数に変換します。カウントは、次の計算を通じてライブラリのライブラリーシーケンスの深さに正規化されます: [(未加工読み取り/総マイクロRNA読み取り) * (1,000,000 – マイクロRNAカウント数) + 1]。
   注: この計算は、データセットと生物学的条件間で比較できる 100 万(RPM)マップマイクロRNA あたりの正規化された読み取りを提供します。出力はタブ区切りファイルです。Sailfishはtpm出力カラムを提供しますが、この値はマイクロRNAヘアピンの長さによって正規化されますが、この文脈では必要ありません。
7. 必要な場合は、カスタム入力シーケンス (ベクターなど) との位置合わせを繰り返して、shRNA などの配信されたコンストラクトにマップされた読み取りを識別します。

結果

ライブラリの準備に関わるステップの概略図
小さな RNA 抽出、シーケンス、および位置合わせの全体的な概略を図2に概説します。
1匹のオスと1匹の雌マウスからの肝臓サンプルを採取し、液体窒素中で凍結した。全RNAを抽出し、品質と濃度について評価した。

小さなRNAシーケ...

ディスカッション

20年以上前^の13年以上前にマイクロRNAを同定したにもかかわらず、マイクロRNAシーケンシングのプロセスは依然として骨の折れるものであり、特殊な装置を必要とし、研究室が社内^{プロトコル14}を日常的に採用するのを妨げている。他の技術は、マイクロRNAマイクロアレイや多重発現パネルのようなマイクロRNAを同時に評価することができます。ただし、こ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 bp DNA ladder	NEB	N3231
19:1 bis-acrylamide	Millipore Sigma	A9926
25 bp DNA step ladder	Promega	G4511
Acid phenol/chloroform	ThermoFisher	AM9720
Acrylamide RNA loading dye	ThermoFisher	R0641
Ammonium persulfate (APS)	Biorad	161-0700
Bioanalyzer instrument	Agilent	G2991AA	For assessing RNA quality and concentration
Chloroform	Fisher Scientific	C298-500
Ethanol (100%)	Sigma	E7023
Gel Loading Buffer II	ThermoFisher	AM8547
GlycoBlue	ThermoFisher	AM9516	Blue color helps in visualizing pellet
HCl	Sigma	320331
KOH	Sigma	P5958
Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm	Genesee	45-109
miRVana microRNA isolation kit	ThermoFisher	AM1560
miSeq system	Illumina	SY-410-1003	For generating small RNA sequencing data
NaCl	Fisher Scientific	S271-500
Nusieve low-melting agarose	Lonza	50081
Parafilm (laboratory sealing film)	Millipore Sigma	P7793
Poly-ethylene glycol 8000	NEB	included with M0204
ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit	NEB	E6560S
QIAquick Gel Extraction kit	Qiagen	28704
Qubit Fluorometer	ThermoFisher	Q33226	For quantifying DNA concentration
Qubit RNA HS Assay kit	ThermoFisher	Q32855
Razor Blades	Fisher Scientific	12640
Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes	Fisher Scientific	02-681-331
T4 RNA ligase 1	NEB	M0204
T4 RNA Ligase 2, truncated K227Q	NEB	M0351S
TapeStation	Agilent	G2939BA	For assessing RNA quality and concentration
Taq DNA Polymerase	NEB	M0273X
TEMED	Biorad	161-0800
Tris Base pH 7.5	Sigma	10708976001
Tris-buffered EDTA	Sigma	T9285
Trizol	ThermoFisher	15596026
UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml)	Invitrogen	15585-011
Universal miRNA cloning linker	NEB	S1315S
Urea	Sigma	U5378