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要約

本稿では、ゲノムにおける高分解能融解分析(HRM)ベースの標的誘導局所病変(TILLING)として説明されているプロトコルを紹介する。この方法は、DNA二重の融解時の蛍光変化を利用し、挿入/欠失(Indel)および単塩基下属(SBS)の両方のハイスループットスクリーニングに適しています。

要約

ゲノムにおける標的誘発局所病変(TILLING)は、誘導変異のハイスループットスクリーニングのための逆遺伝学の戦略である。しかし、TILLINGシステムは挿入/欠失(Indel)検出の適用性が低く、従来のTILLINGはCEL Iヌクレアーゼ消化やゲル電気泳動のようなより複雑なステップを必要とします。スループットと選択効率を向上させ、インデルとシングルベース置換(SB)の両方のスクリーニングを可能にするために、新しい高解像度融解(HRM)ベースのTILLINGシステムが開発されました。ここでは、詳細なHRM-TILLINGプロトコルを提示し、変異スクリーニングにおけるその応用を示す。この方法は、高温での二本鎖DNAの変異を測定することにより、PCRアンプリコンの変異を解析することができる。HRM 分析は、追加の処理を行わずに PCR 後に直接実行されます。さらに、シンプルで安全で高速な(SSF)DNA抽出方法をHRM-TILLINGと統合し、インデルとSBの両方を識別します。そのシンプルさ、堅牢性と高いスループットは、米や他の作物の変異スキャンに潜在的に有用です。

概要

変異体は、植物機能ゲノミクスの研究と新品種の繁殖のための重要な遺伝資源です。フォワード遺伝学のアプローチ(すなわち、変異型の選択から遺伝子クローニングまたは多様性の発達まで)は、約20年前に誘発された突然変異を使用するための主かつ唯一の方法でした。McCallumら1による新しい逆遺伝学法の開発は、マッカラムら1による新しいパラダイムを開き、それ以来、多数の動植物種2に適用されている。TILLINGは、技術的に決定が困難または高価な形質(例えば、耐病性、ミネラル含有量)の繁殖に特に有用である。

TILLINGは当初、化学変異原(EMS1、3)によって誘導されるスクリーニング点変異のために開発された。これには、次の手順が含まれます: TILLING 人口の確立(s)。個々の植物のDNA調製とプール;標的DNA断片のPCR増幅;PCRアンプリコンの脱化およびアニーリングによるヘテロドプレックス形成およびCEL Iヌクレアーゼによる切断;変異体およびその特異的分子病変3,4の同定。ただし、この方法は比較的複雑で、時間がかかり、スループットが低い場合があります。より効率的で高いスループットを実現するために、削除ティリング(De-TILLING)(表1)1、3、5、6など、多くの変更されたTILLING方法が開発されています。 7,8,9,10,11,12.

DNA二重の融解中の蛍光変化に基づくHRM曲線分析は、変異スクリーニングおよびジェノタイピング13のためのシンプルで費用対効果の高い、ハイスループット法である。HRMは、EMS変異14によって誘導されるSBS変異をスクリーニングするためのHRMベースのティリング(HRM-TILLING)を含む植物研究に既に広く使用されている。ここでは、米中のγ(γ)線によって誘導される変異(インデルとSBSの両方)をスクリーニングするための詳細なHRM-TILLINGプロトコルを提示した。

プロトコル

1. 準備

  1. γ線変異集団の開発
    1. 乾燥米種子約20,000種(水分含有量14%)γ照射施設(例えば、ガンマ細胞)で100 Gy(1 Gy/min)で137Csガンマ線を持つジャポニカ米ライン(例えば、DS552)の。
      注:治療に使用される種子は、高い生存率を有する必要があります(例えば、発芽率>85%)。インディカ米の照射量は150 Gyに増加することができる。
    2. 苗木に発芽した後に照射された種子を播種し、苗を個別に水田に移植し、M1集団に成長させる。
      注:M1プラントの直接播種は、人件費の削減にも応用できる。物理的または生物学的分離手段を使用して、他の米品種とのM1植物の交差を防ぎます。
    3. M1植物からM2種子をバルク収穫し、各M1パニックから1〜2種子を含み、M2集団を形成する。
      注:実際には、簡略化のために、M1植物のすべての種子を収穫し、完全に混合した後、部分はM2母集団を形成するためにサンプリングされます。
    4. 室温で24(インディカライス)-36(ジャポニカライス)hのために水に約5,000 M2種子を浸します。その後、ペトリ皿の湿ったフィルターペーパー上で2日間37°Cで発芽する種子をしましょう。
      注:より多くのM2種子を分析のために発芽させることができるので、変異体を同定する確率を高めることができる。
    5. 発芽した種子を小さな穴の付いた種子パネルに置き、吉田ら15から改変した培養液で3~4週間水耕栽培し、12時間光周期[昼間(30±2)°Cと夜間(24±2)°C]を用いたガラスハウスで栽培する。
  2. 葉組織のサンプリング:穴パンチャーを使用して、各播種の完全に伸びた葉から1枚のディスク(Φ〜2 mm)を同じ位置に切ります。
  3. DNA抽出ソリューションの調製
    1. バッファA:5M NaOHの2mLと20%Tween 20の10 mLを追加し、50 mLの最終容積を作ります。DNA抽出前に緩衝Aを新たに調出す。
    2. バッファ B: 1 M トリス HCl (pH 8.0) の 20 mL と 0.5 M EDTA の 80 μL を追加し、最終的な体積を 100 mL にします。
  4. PCR プライマー
    1. HRM分析のためのプライマー:ソフトウェア(プライマープレミア5など)を使用してターゲットシーケンスを増幅するためのプライマーを設計し、商業企業によって合成します。
      注:HRM は長いフラグメントの分析にあまり適用できないため、アンプリコンは 400 bp. フラグメントが高すぎる (>75%)または低すぎる (<25%)GC の内容は HRM 分析にも適していません。
    2. 品質管理のためのプライマー:Peng et al.16から12の米染色体に分布する24のSSRマーカーを使用してください。

2. DNA抽出

  1. 96ウェルPCRプレートの各ウェルに4枚のリーフディスクを入れ、バッファA溶液(50 mL/ウェル)を追加します。プレートを-80°Cの冷凍庫で10分間凍らせます。
  2. プレートを室温で凍結し、95°Cで10分間インキュベートします。
  3. 各ウェルに50μLのバッファBを加え、渦でよく混ぜます。
  4. 1,500 x gでプレートを1分間遠心分離します。上清はPCRの準備ができています。

3. PCR増幅

  1. PCR の最適化
    1. 各PCRウェルに以下の試薬を加える:DNAの1 μL(ステップ2.4の上清)、2xマスターミックスの5 μL(2x PCRバッファー、4mmol/L MgCl 2、0.4 mmol/L 2'-デオキシリボヌクレオシド三リン酸(dNTP)、および50 U/mL Taq DNAALの各0μLμmol/Lプライマーは、ヌクレアーゼフリー水を使用して、最大10μLの最終容積を作ります。
    2. 勾配対応の熱ブロックを使用して、次の PCR プログラムを使用して各ターゲット フラグメントの最適なアニーリング温度を決定します: 94 °C で 5 分、94 °C で 30 s の 40 サイクル、52- 62 °C で 30 s (勾配温度)、および 72 °C で 30 s、8分間72°Cで最終的な延長および16 °Cでホールドと。
    3. 最適なアニール温度を決定するために、1%アガロースゲルのアンプリコンを調べます。
      注:最適なアニーリング温度は、非特異的増幅およびプライマーダイマ化なしで、ターゲットフラグメントの特定の増幅を可能にする必要があります。
  2. HRM 分析用 PCR
    注:ステップ2.4に記載されているように抽出されたM2苗のHRM互換プレートおよびDNAがPCRに用いられる。
    1. 1μLのDNA(上清)、2倍マスターミックスの5μL、10μmol/Lプライマーの0.2 μL、10倍の蛍光色素の1μLの最終体積でPcRを実行します。各プレートには、1つの野生型(WT)親子サンプルと1つの陰性(DNAなし)制御が含まれる。
    2. 蒸発を防ぐために、各井戸にミネラルオイルの滴を追加します。
    3. 粘着フィルムと遠心分離機でプレートを1分間1,000 x gで密封します。
    4. 最適化されたアニーリング温度を使用してPCRを実行します。
      注:いくつかのケースでは、蛍光色素はPCR増幅に影響を与える可能性があり、したがって、色素は、PCRの完了後に添加されます。このような場合、色素は、ポストPCR変性およびアニールによってDNA鎖に組み込まれる。

4. HRMスキャンと突然変異確認

  1. 粘着フィルムをプレートから取り出し、プレートをHRMマシンに挿入します。
  2. ファイルメニューから[新規実行]を選択するか、画面上部の[実行]ボタンを押します。
  3. 55 °C から 95 °C までの溶融物の開始温度と終了温度を指定します。
    注:最初の実行後、溶融温度の範囲は、特定のフラグメントについて決定することができます。したがって、溶融温度は、時間を節約するために、同じフラグメントの後続の分析のために調整することができます。
  4. 高解像度溶融解析用のサンプルを選択し、負のコントロールに似たサンプルを除外します。
  5. 溶融曲線を正規化して、蛍光の始まりと終わりが同じになります。[最小低]と[最大度下]温度カーソルがカーブの領域内にあることを視覚的に確認します。
  6. デフォルト設定の 0.05 に設定して、F (蛍光の差) レベルを維持します。
  7. 標準選択リストから[共通対バリアント]を選択し、[標準感度]を選択します。
  8. コントロールとして WT を使用します。WTからの≥0.05の≥F値を持つサンプルは、変異植物を含むものと見なされます。
  9. 変異植物の同定と確認
    1. 各変異プールが作られた4つの植物を識別します。
    2. アレンら17に係るCTAB法を用いて、これらの植物のそれぞれからDNAを抽出し、いくつかの改変を行う。
      注:Dna品質はさらなるPCR増幅に十分であるため、アレンら17で説明したCTAB法を用いてDNAを抽出する場合、DNaseフリーRNaseおよびNaAcは使用されない。分光光度計を用いて定量した後、DNAを~25ng/μLの最終濃度に調整します。
    3. PCRプライマーを使用してターゲットフラグメントを増幅し、HRM分析と同じプログラムを使用します。
    4. アンプリコンのサンガーシーケンシングにより、特定の分子病変を同定する。
      注:PCR増幅が完了したら、サンガーシーケンシングのためにアンプリコンを会社に送ってください。分子病変は、M2植物とWTとの配列を比較することによって同定することができる。

5. 分子マーカーによる選択した変異体の品質管理

  1. 24個のSSRマーカーに対して、25ngのゲノムDNA(CTABプロトコルを使用して抽出)、2倍マスターミックスの5μL、10 μM SSRプライマーのそれぞれ0.2 μLの最終容積でPCRを実行します。
  2. 次のプログラムを使用して PCR を実行します: 94 °C で 5 分、94 °C で 30 s の 30 サイクル、55 °C で 30 s、72 °C で 30 s、 72 °C で最終的な拡張 72 °C で 72 °C.
  3. 8%ポリアクリルアミドゲル上のアンプリコンを分離し、銀染色18によって増幅された断片の多型を明らかにする。
  4. 選択したバリアントの SSR ハプロタイプと WT を比較します。
    注:誘発変異体は、多くの場合、そのWTと同一のSSRハプロタイプを有し、複数のSSRマーカーが変異体とWTの間で異なる場合、バリアントは誘発されるのではなく、遺伝的汚染物質(例えば、混合物または交差した植物)である可能性が高い。変異体18.

結果

HRM スキャンと分析

合計で、4,560M2苗から1,140個のプールされたDNAサンプルを製造し、PCR増幅を行った。OsLCT1とSPDTに対して 195 bp および 259 bp のサイズを持つ 2 つのフラグメントがそれぞれ増幅されました (表2)。ほとんどのサンプルは、WT(ΔF < 0.05)と有意に異なる溶融曲線を持っていました。WT (ΔF > 0.05) と有意に異なる HRM 曲?...

ディスカッション

TILLINGは、遺伝子機能解析および作物の繁殖のために誘導された変異を同定するための強力な逆遺伝的ツールであることが証明されています。容易に観察または決定されないいくつかの形質のために、高スループットPCRベースの変異検出を用いたTILLINGは、異なる遺伝子の変異体を得るのに有用な方法であり得る。HRM-TILLING法は、変異スクリーニングのためにトマト12、小麦11?...

開示事項

著者らは、利益相反がないと宣言している。

謝辞

この研究は、中国国家主要研究開発プログラム(No.2016YFD0102103)と中国国家自然科学財団(No.31701394)によって支援されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
2× Taq plus PCR Master MixTiangen, ChinaKT201PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification
96-well plateBio-rad, AmericaMSP-9651Specific plate for PCR in HRM analysis
Mastercycler nexusEppendorf, German6333000073PCR amplification
LightScannerIdaho Technology, USALCSN-ASY-0011For fluorescence sampling and processing
CALL-IT 2.0Idaho Technology, USAFor analysis of the fluorescence change
EvaGreenBiotium, USA31000-TFluorescence dye of HRM
Nanodrop 2000Thermo Scientific, USAND2000For DNA quantification

参考文献

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151 HRM TILLING SBS

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