原発性ニューロンにおける神経質の増殖を研究するための強化された緑色蛍光タンパク質ベースのアッセイ

要約

本報告では、EGFPと目的のタンパク質との共トランスフェクトにより、胚ラット皮質ニューロンにおける神経伝達の増殖を研究するための簡単なプロトコルについて述べる。

要約

神経伝達の成長は、神経系の発達中の神経回路の形成における基本的な出来事である。重度の神経剤損傷およびシナプス機能障害は、様々な神経変性疾患および加齢に伴う変性に起こる。神経伝達物質の成長を調節するメカニズムの研究は、脳の発達過程だけでなく、そのような神経疾患にも貴重な光を当てるだろう。トランスフェクション効率が低いため、一次哺乳類ニューロンの神経伝達体外増殖に対する特定のタンパク質の影響を研究することは現在困難です。ここでは、EGFPと目的タンパク質(POI)を用いて一次ラット皮質ニューロンの共トランスフェクションによる神経質の成長を調べる簡単な方法について述べる。この方法は、EGFP信号を介してPOIトランスフェクトニューロンの同定を可能にし、したがって、神経突起成長に対するPOIの効果を正確に決定することができる。このEGFPベースのアッセイは、ニューライトの成長を調節する経路の調査に便利なアプローチを提供します。

概要

軸とデンドライトの両方を含むニューライトは、ニューラルネットワークの確立に関与するニューロンからの投影である。神経伝達物の動的な成長は神経発達に不可欠である。しかし、その下にある規制メカニズムは不明のままである。特に、神経質損傷は、様々な神経変性疾患および脳損傷^後1でしばしば観察される。したがって、様々なニューライト成長調節経路における置き起分子の役割の調査は、プロセスの理解を向上させるだろう。さらに、様々な神経障害に対する新しい治療標的を明らかにしてもよい。神経細胞株は、神経伝達を含む神経細胞プロセスを研究するための貴重なモデルであり、操作とトランスフェクト^{が容易である2、3.}しかし、遺伝的ドリフトは、いくつかの一般的に使用される細胞株で起こることが報告されており、これは彼らの生理的応答のばらつきにつながる可能性^{があります4.}さらに、分タンパク質発現は、ニューロン細胞株と一次ニューロンとの間で示されている。例えば、PC12は、神経伝達体の^成長2、3の研究に広く用いられているラット副腎に由来する神経細胞株であり、NMDA^受容体5を発現しない。さらに、一次ニューロンと比較して神経芽細胞腫ライン神経-2aの反応性の低下は、特定の膜受容体およびイオンチャネル6の発現の欠如によるものであることが提案^{されている。}したがって、一次ニューロンは、神経伝達体の成長の調査のためのより望ましい代表的なモデルである。しかし、一次ニューロンの使用は、その低いトランスフェクション^効率7によって妨げられる。

ここでは、目的タンパク質(POI)とEGFPを一次ラット皮質ニューロンに対する共トランスフェクションを伴う方法について説明する。EGFPは正常にトランスフェクトされたニューロンの同定のための形態学的マーカーとして作用し、神経突起の測定を可能にする。この方法は、ニューライトの成長を調節すると報告されている化合物/分子を用いて検証した。また、FE65は、ニューライトの成長を刺激することが示されているニューロンアダプタータンパク質であり、この^{アプローチ8,9}を例示するために用いられた。このプロトコルは、(1)胚18日目(E18)ラット胚からの一次皮質ニューロンの単離、(2)EGFPとPOI(本研究におけるFE65)とのニューロンの共トランスフェクション、(3)画像処理を用いてニューロンのイメージングと解析を含む。ニューロンJ^{プラグイン10、11}を持つソフトウェアImageJ。

プロトコル

すべての手順は、香港中華大学の動物実験倫理委員会の倫理基準に従っていました.

1. カバースリップの準備

1. 無菌の18mm円形カバーを12ウェル組織培養板の各ウェルに入れます。
2. カバースリップを加湿した37°Cインキュベーターで5 μg/mLポリD-リジン溶液で少なくとも1時間コートします。
3. 組織培養プレートからポリD-リジン溶液を吸引し、被覆されたカバーリップを滅菌水で一度すすいでください。

2. ラット胚性ニューロン解剖

1. 子宮頸部脱臼_またはCO2窒息のいずれかによって18日(E18)の妊娠年齢で時限妊娠スプラーグ・ドーリーラットを犠牲にする。
   注:妊娠中のネズミの犠牲については、現地の規制をご確認ください。
2. ハサミを解剖して妊娠中のラットの腹腔を開き、子宮を10cmペトリ皿に移します。
3. 小さな解剖はさみで子宮と天理嚢を慎重に開き、小さな解剖はさみを使用してラット胚から胎盤を取り除きます。胚全体を10cmペトリ皿に移し、小さな鉗子のペアを使用して、グルコース(PBS-グルコース、10mMリン酸ナトリウム、塩化カリウム、140mM塩化ナトリウムおよび3g/L)を補い、あらかじめ冷やされたリン酸塩バッファー生理食塩水を使用します。
4. 頭蓋骨の矢状縫合糸に沿ってカットし、小さな解剖はさみで慎重にそれを開きます。小さな平らなへらで胚性脳を氷冷PBSブドウ糖で10cmペトリ皿に移します。
5. 解剖顕微鏡下で2つの#5ピンセットを使用して、小脳と脳幹から2つの大脳半球を分離します。
   注:ラット脳の構造については、参考^文献12を参照してください。
6. #5ピンセットを使用して髄膜を取り除く。
7. 2つのまっすぐなピンセットで大脳半球から皮質を分離#5。
8. 15 mL遠心管で単離された皮質を氷冷PBS-グルコースに移します。

3. 原発性皮質ニューロン培養

注:ステップ3および4のすべての手順は、クラスIIバイオセーフティキャビネット内で実行されます。

1. 4°Cで4°Cで単離された皮質を5分間沈着させ、PBS-グルコースを吸引する。
2. 0.05%トリプシン-EDTAの1 mLを単離された皮質に加え、37°Cの水浴で組織をタップして10分間インキュベートして穏やかに混ぜて、酵素消化を可能にします。チューブを軽くタップし、2分ごとに混合します。
3. 組織/トリプシン混合物に4mLの維持培地(例えば、神経基底培地)を添加する。
   注:このプロトコルで使用されるすべての維持培地は、ペニシリン連鎖マイシンおよびB-27^{サプリメント13}を補う。
4. 1 mLピペットを用いてトリチュレーションにより組織を穏やかに解離する。
5. 断離細胞を200xgで5分間離離膜に分離したペレットを吸引する。
6. 手順 3.5 ~ 3.7 を 2 回繰り返します。
7. 細胞ペレットを1mLのメンテナンス培地で再ステースする。
8. 0.4%トリパンブルー溶液の10 μLを10μLの細胞懸濁液に加え、生殖細胞計で生細胞を数え出す。
9. ニューロンを65,000/cm²⁽生存細胞)の密度で12ウェルプレートにウェル当たり1mLの維持培地でプレートする。

4. 細胞トランスフェクションと固定

1. インビトロ(DIV2)で2日間、1μLのトランスフェクション試薬(例えば、リポフェクタミン2000)を用いてPOIの0.5μgの有無にかかわらず一緒にEGFP構築物(pEGFP-C1)をニューロンにトランスフェクトする。製造元の指示に従って使用します。
   注:哺乳動物発現物組子は、エンドトキシンフリープラスミド調製キットを用いて調製した。化学物質/分子による処理(この原稿ではサイトチャラシンD(Cyto D)および神経成長因子(NGF)を用いた)は、トランスフェクション後6時間で行うことができる。
2. 培養培地を24時間トランスフェクション後に吸引し、37°C PBS(10mMリン酸ナトリウム、塩化カリウム2.68mM、塩化ナトリウム140mM)でトランスフェクト細胞を1回洗浄する。
3. 室温で暗闇の中で10分間PBSに4%パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。
4. 固定細胞をPBSで3回洗います。
5. 顕微鏡ガラススライドに最小限の蛍光取り付け媒体を追加します。カバースリップを12ウェルプレートから取り付け媒体に慎重に移し、サンプルをガラススライドに向けます。
   注:水性取り付け媒体を使用する場合は、カバースリップの端をマニキュアでシールします。

5. ニューライトの生殖量の測定

1. エピ蛍光顕微鏡を使用して画像をキャプチャする目的を 40 倍にします。
2. トランスフェクションあたりのEGFP信号を持つ少なくとも40の無傷ニューロンからの画像をキャプチャします。
3. NeuronJ^{プラグイン11}を用いてImageJソフトウェアで撮影した画像を開き、細胞体から成長コーンの先端までの最長の神経突起の長さを測定し、各画像化されたニューロンの長さを測定する。
4. ソフトウェアで得られたデータを分析し、ニューライトの成長における標的タンパク質の効果を決定します。

結果

この方法論をテストするために、我々は、^{それぞれ14、15、16}の神経伝達体の成長を阻害し、刺激することが示されているCyto D^および神経成長因子NGFを使用した。EGFPでトランスフェクトされたニューロンの神経突起長は、Cyto DまたはNGFによる治療後に測定した。EGFPのニューロンへのトランスフェク?...

ディスカッション

前述したように、PC12およびそのサブクローンは、優れたトランスフェクション^効率2、3を持っているので、神経伝達拡張を研究するために広く使用されています。対照的に、一次ニューロンはトランスフェクション速度が低く、トランスフェ^{クション7}による神経伝達成長調節因子の研究の大きな障害となっている。ここでは、一?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 tweezers	Regine	5-COB
18 mm Circle Cover Slips	Thermo Scientific	CB00180RA	Sterilize before use
B27 Supplement	Gibco	17504044
Cytochalasin D	Invitrogen	PHZ1063	Dissolved in DMSO
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Dissecting Scissors, 10 cm	World Precision Instruments	14393
Dissecting Scissors, 12.5 cm	World Precision Instruments	15922
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12362
Fluorescence Mounting Medium	Dako	S302380
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen	11668019
Neurobasal Medium	Gibco	21103049
NGF 2.5S Native Mouse Protein	Gibco	13257019
Nugent Utility Forceps, 10 mm, Straight Tip	World Precision Instruments	504489
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
pEGFP-C1	Clontech	#6084-1
pCI FE65			Please see references 8 and 15
PBS Tablets	Gibco	18912014
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P7280
Spatula	Sigma-Aldrich	S4147
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300062
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061