クロマチンドメインのノボ形成を研究する方法

要約

この方法は、細胞株におけるPRC2媒介クロマチンドメインの形成に従うように設計されており、この方法は他の多くのシステムに適応することができる。

要約

クロマチンドメインの組織および構造は、個々の細胞系統に固有である。彼らの誤った規制は、細胞同一性および/または病気の損失につながる可能性があります。多大な努力にもかかわらず、クロマチンドメインの形成と伝播に関する我々の理解は依然として限られている。クロマチンドメインは、確立中の最初の事象に従うことを助長しない定常状態条件下で研究されている。ここでは、クロマチンドメインを誘導的に再構築し、時間の関数として再形成する方法を提示する。しかし、最初にPRC2媒介性抑圧クロマチンドメイン形成の場合に適用されるが、それは容易に他のクロマチンドメインに適応することができる。この方法をゲノミクスおよびイメージング技術と組み合わせることで、クロマチンドメインの確立を詳細に研究する貴重なツールが提供されます。この方法は、クロマチンドメインがどのように形成され、相互作用するかについての我々の理解に革命をもたらすと信じています。

概要

真核生物ゲノムは高度に組織化されており、クロマチンアクセシビリティの変化は遺伝子転写1を直接制御する。ゲノムには、転写活性および複製タイミング2、3と相関する異なるタイプのクロマチンドメインが含まれている。これらのクロマチンドメインのサイズは数キロベース(kb)から100kb以上の範囲であり、異なるヒストン^修飾4の濃縮によって特徴付けられます。中心的な問題は、これらのドメインがどのように形成され、どのように伝播されるかということです。

最もよく特徴付けられたクロマチンドメインの1つは、ポリコム抑圧複合体2(PRC2)の活性を通じて促進される。PRC2は、タンパク質5、6のポリコムグループ(PcG)のサブセットで構成されるマルチサブユニット複合体であり、ヒストンH3(H3K27me1/me2/me3)7、8、リジン27のモノ、ディ、トリメチル化を触媒する。 ^9,10.H3K27me2/me3は抑圧的なクロマチン状態に関連しているが、H3K27me1の機能は^不明6,11である。PRC2のコアコンポーネントの1つである胚性エクトダーム開発(EED)は、その芳香族ケージを介してPRC2触媒、H3K27me3の最終産物に結合し、この特徴はPRC2^12、13のアロステリック刺激をもたらす。PRC2酵素活性は、特定の系統に対して禁忌である特定の発達遺伝子の不適切な発現が有害であるとして、発達中に細胞同一性を維持するために重要である5,6.したがって、中国が哺乳類における抑圧的なクロマチンドメインの形成を促進するメカニズムを解明することは、細胞同一性を理解する上で根本的に重要である。

PRC2媒介クロマチンドメインを含むクロマチンドメイン形成を調査するように設計された過去の実験システムのすべては、クロマチンドメイン形成の展開イベントを追跡することができない定常状態条件下で行われた。細胞。ここでは、クロマチンドメインの初期募集と伝播を監視する誘導性細胞系を生成するための詳細なプロトコルを提示する。具体的には、H3K27me2/3を含むPRC2媒介性抑圧クロマチンドメインの形成を追跡することに焦点を当てる。クロマチンドメイン形成の機械的詳細を捕捉できるこのシステムは、H2AK119ubまたはH3K9meのいずれかを含む広く研究されたドメインのような他のクロマチンドメインを組み込むことに適合させることができる。ゲノミクスやイメージング技術と組み合わせることで、クロマチン生物学における様々な重要な問題にうまく対処する可能性があります。

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プロトコル

誘導性EEDレスキューMESCの生成

1. 細胞培養

1. 4-ヒドロキシタモキシフェン(4-OHT)13の投与時に核に転移することができる安定に統合されたCreERT2トランスジーンを有するフィーダーフリーC57BL/6マウス胚性幹細胞(MESC)を使用する。
2. 従来のESC培地14,15でMESCを成長させ、1000 U/mL LIF、1μM ERK阻害剤PD0325901および3μM GSK3阻害剤CHIR99021を補充した。従来のESC培地では、15%の胎児ウシ血清(FBS)、2mM L-グルタミン、1Xペニシリン/ストレプトマイシンおよび0.1mM 2-メルカプトエタノールを含むノックアウトDMEMを使用する。
3. mESCを培養するための0.1%ゼラチン溶液でコーティングされたプレートを使用してください。

2. クローンEEDノックアウト(KO)MESCの生成

1. 設計ガイドRNA(gRNA)は、ベンチリング16のCRISPR設計ツールを使用して、MESCでEEDの内因性コピーのエクソン10とエキソン11を削除します。EED-KO-gRNA-1は、エキソン10の直下流のイントロンを標的とし、EED-KO-gRNA-2はエキソン11の直下流のイントロンを標的とする。これらのgRNAの同時適用は、非相同エンド結合(NHEJ)によってExon 10とExon 11の両方を削除する。
2. ran et al., 2013¹⁷.
3. 6ウェルプレート形式では、トランスフェクション試薬を使用して、各EED-KO-gRNA-1およびEED-KO-gRNA-2(材料の表を参照)の1mgを持つトランスフェクト2 x 10⁵ MESCを、メーカーの指示に従ってトランスフェクション試薬を使用します。トランスフェクション後にメディアを24時間変更します。
4. トランスフェクションの2日後、蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いてGFP陽性細胞を単離する。トランスフェクションの効率は10~30%程度変化すると予想されます。5 x 10⁵セルの周りを並べ替えて、めっきに十分な GFP 陽性細胞をキャプチャします。
5. 単離されたGFP陽性MESCを15cmプレートにプレートし、コロニーピッキング用に0.1%ゼラチン(1皿あたり10~20 x 10³細胞)をあらかじめコーティングします。
6. 単一のコロニーが見えるまで約1週間ESC培地で細胞を成長させる。2 日ごとにメディアを変更します。
7. 20 μL マイクロピペットチップを使用して、48個以上のコロニーを選びます。マイクロピペット先端に吸気しながらコロニーの上にこすりつけます。コロニーを単一の細胞に分割しないでください。コロニーをアキュターゼ含有(20mL)96ウェルプレートに移す。
8. すべての細胞が解離されるまで、37°Cで10分間コロニーをインキュベートします。
9. マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルにESCメディアの200 mLを追加します。
10. よく混合し、マルチチャンネルピペットを使用して2つの別々の96ウェルプレートに細胞をプレート。
11. ジェノタイピングに 96 のウェルプレートのいずれかを使用し、ジェノタイピングが終了するまでもう 1 つを成長させ続けます。DNA抽出溶液を使用して、製造元の指示に従って96ウェルプレートからDNAを抽出します。
12. ジェノタイピングプライマーGnt_EED-KO-upとGnt_EED-KO_downを使用して、削除されたサイトにまたがるし、メーカーの指示に従ってTaq DNAポリメラーゼでジェノタイピングPCRを実行します。
    注:他のタイプのDNAポリメラーゼもジェノタイピングに使用できますが、着色反応バッファーを使用するとPCR反応をゲルに直接ロードできるため、Taq DNAポリメラーゼは利便性を提供します。
    1. 野生型(WT)の場合に対してホモ接合性欠失を有する細胞における低分子量のDNA産物を観察する。
       注:PRC2ヌル細胞を生成するには、コアPRC2 13の必須サブユニットであるEEDを不安定化および分解するために、エキソン10および11のホモ接性欠失が必要である。CRISPRのターゲティング効率は約10%です。
13. EEDエキソン10および11の欠失と、サンガーシーケンシングおよびウェスタンブロッティングによるEEDタンパク質の喪失をそれぞれ検証する。
14. H3K27me2/me3およびEEDに対する抗体を用いたChIP-seqによるEED KO細胞中のクロマチンからのEEDおよびH3K27me2/me3の枯渇を確認する。2017^年15月のOksuz et al.で与えられたプロトコルを使用して、ChIP-seq実験を行います。

3. EEDノックアウトMESCをエンジニアリングし、Cre-ERT2ベースの誘導性EED式を保有する

1. ベンチ^リング16のCRISPR設計ツールを用いてEEDのエキソン9に続くイントロン内のカットを導入するgRNA(EED-gRNA誘導性)を設計する(材料の表を参照)。
2. ran et al., 2013¹⁷.
3. エキソン9の後にEED cDNA配列を含むドナーテンプレートDNAを設計し、T2A-GFP配列の上流にC末端フラグ-HAタグを、内因性遺伝子配列に対してすべて逆方向に設計する。
   1. カセットをスプライスアクセプターと、不一葉のloxPサイト(lox66およびlox71)18の間にネストされたポリアデニル化配列で側面にする。
   2. 両端から少なくとも500 bpの相同兵器を含める。ドナーテンプレートをgBlocks遺伝子断片の2つのセグメントに分割します(gBlock-1、gBlock-2-WT「https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI」およびgBlock-2-ケージ変異体「https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM」を参照)製造元の指示に従ってギブソンのクローンを使用する PCR ブラント ベクトル。
      注:gblock-2は、H3K27me3¹²との相互作用に重要なEEDのケージ内に芳香族残基(Y365)を含んでいます。gBlock-2-Wtには野生型残渣が含まれていますが、gblock-2-ケージ変異体にはEED(Y365A)のケージ変異体が含まれており、H3K27me3に結合することができません。誘導性WT EED救助はi-WT-rとして示され、誘導可能なケージ変異体EED救助は便宜上i-MT-rとして示される。
4. 6ウェルプレート形式では、トランスフェクション試薬を用いてgRNA(EED-gRNA誘導性)およびドナーテンプレートの1mg(i-WT-rまたはi-MT-r)を1mgのトランスフェクト2 x 10⁵ MESCをトランスフェクトし、FACSを用いてGFP陽性細胞を単離する。
5. 手順 2.3-2.11 に従って、ターゲティングを成功させるためにジェノタイピングの準備ができている個々のコロニーを分離します。
6. 挿入されたカセットにまたがるジェノタイピングプライマー誘導可能_遺伝子型FW-1および誘導可能なジェノタイプ-REV-1を使用し、Taq DNAポリメラーゼを使用してジェノタイピングPCRを実行します。
   注: CRISPR のターゲティング効率は約 10% です。
   1. 相同アームの外側にある誘導可能な_遺伝子型-FW-2および誘導可能な_ジェノタイプ-REV-2プライマーを使用して、PCR によるカセットの正しい統合を確認します。
      注:カセットのホモ接性統合は、EEDの効率的な救助を達成するために必要です。ホモ接合体を有する細胞は、WT EEDと比較して単一の大きなDNA産物を産生し、短い製品を生成することに注意してください。
7. サンガーシーケンシングによるカセットの統合を確認します。
8. カセットの反転とEEDおよびその他のPRC2コアコンポーネント(例えば、EZH2およびSUZ12)の発現を、ウェスタンブロッティングによる4-OHT投与時に確認する。
9. T2A-GFPの発現とフローサイトメトリーによるフリップの割合を確認する。なお、GFPの発現はカセットの反転とEEDの発現を示す。

4. クロマチンに対する中国の核化と拡散に続く

1. i-WT-r および i-MT-r MESC がフローサイトメトリーによる GFP の漏れやすい発現を持たないことを確認します。GFPの漏れ発現の場合、実験を開始する前にFACSによりGFP陰性細胞を単離する。
2. i-WT-r および i-MT-r MESC を 5 つの 15 cm プレート (プレートあたり 5x 10⁶セル) に展開します。
3. 0.5mM 4-OHTを0h、12h、24h、36hおよび8日間(条件当たり15cmプレート)の投与によりWTまたはケージ変異EEDの発現を誘導する。12時間を超える治療のために12時間後に培方を変更し、GFPを用いてFACSによって正常に再結合された細胞を分離する。すべての条件が一度に収集されるような治療の時間を調整します。
4. H3K27me2,H3K27me3のChIP-seqを実行し、WTまたはケージ変異EEDの再発現に応答してクロマチンへの経時的沈着を調べる。Oksuz et al., 2017^15.
5. 各サンプルでスパイクインコントロールを使用して、異なるタイム^{ポイント19}間の定量的な比較を可能にします。
   1. スパイクインコントロールでは、ショウジョウバエメラノガスター(mESC由来クロマチンに対する1:50比)およびショウジョウバエ特異的H2Av抗体(ドロソフィラクロマチンの4μg当たりH2Av抗体の1μL)を使用します。各サンプルの製造元の指示)。
   2. Oksuz et al., 2017^15.
6. デフォルトパラメータ20を使用して、Bowtie 2を使用してChIP-seqの読み取りシーケンスをmm10ゲノムにマッピングします。
7. ChIP-seqが読み込みしたマウスを正規化して、ショウジョウバエの読み取り^{カウントを21}にする。次の式を使用してスパイクイン正規化係数を計算します: 1 x 10⁶/ユニークなショウジョウバエ読み取りカウント。1 x 10⁶ショウジョウバエ読み取りカウントと 20 x 10⁶マウス読み取り回数を実験ごとに取得することを期待します。
   1. 入力サンプルをシーケンシングする際には、ショウジョウバエクロマチンを含めません。
8. ベッドツールからゲノムコフツールを使用して、bamファイルをベッド^グラフ22に変換します。次に、USCS^23、24からbedGraphToBigWigツールを使用して、ベッドグラフを bigwig ファイルに変換します。次のスクリプトを参照してください。
   gen=「mm10ゲノムへの道」
   chr=「mm10染色体サイズへの道」
   inp_bam="入力バムファイルへのパス"
   乗算=「スパイクイン正規化係数を計算する」
   ベッドツールゲノムコフ -bg -スケール $multiply -ibam $inp_bam -g $gen > output.bedGraph
   並べ替え -k1,1 -k2,2n 出力.bedGraph > 出力ソート.bedGraph
   bedGraphToBigWig出力_ソート.bedGraph $chroutput.bw
9. USCSゲノム^{ブラウザ24}にビッグウィッグファイルをアップロードすることにより、ChIP-seq読み取り密度を視覚化します。

5. MESC核におけるH3K27me3病巣の出現と増殖のモニタリング

1. プレート1x 10⁴ mESCを8ウェルチャンバースライドに0.1%ゼラチンであらかじめコーティング。
2. 翌日、示された時点(0時間、12時間、24時間および36時間)に対してEEDを発現する細胞を集集めるために連続した4-OHT(0.5mM)誘導を行い始める。12時間より長い治療のために12時間後にメディアを変更します。
3. 室温(RT)でリン酸緩衝生理食べ物(PBS)に4%のパラホルムアルデヒドを4%のパラホルムアルデヒドで10分間固定します。
4. PBS/0.25% トリトンX-100で細胞を透過化し、RTで30分間使用します。
5. PBS/5%ロバ血清/0.1%トリトンX-100(ブロッキングバッファー)で30分間RTで細胞をブロックします。
6. ブロッキングバッファー中のH3K27me3一次抗体1:500を希釈し、細胞に添加する。
7. 一次抗体で細胞を一晩4°Cでインキュベートします。
8. 翌日、PBS/0.1%トリトンX-100で3つの洗い流しを行います。
9. 希釈二次抗体(Alexa fluor 595)1:1000をブロッキングバッファーに含め、細胞に添加する。
   1. Alexa Fluorと共役した二次抗体は光に敏感であるため、次のステップで暗闇の中ですべてのインキュベーションを実行します。
10. RTで2時間二次抗体をインキュベートする。
11. PBS/0.1%トリトンX-100で3つの洗い流しを行います。
12. 希釈 DAPI (1 mg/mL) 1:4000 PBS/0.1% トリトン X-100 と細胞に追加します。
13. RTで10分間DAPIで細胞をインキュベートします。
14. アクアマウントでセルをマウントします。
15. 63倍の倍率で共焦点顕微鏡で細胞を画像化します。
16. ImageJ、^{フィジー25}の分布を使用して画像を処理し、擬似色を付けます。

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結果

条件付き救助システムの一般的なスキーム
図1は、内因性EED遺伝子座から発現されるWTまたはケージ変異体(Y365A)EEDを用いたEED KO細胞を条件付きで救出するターゲティングスキームを示す。その安定性と酵素活性に不可欠なPRC2のコアサブユニットであるEEDをノックアウトした後、EEDのエキソン9に続くイントロン内のカセットが導入される(図...

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ディスカッション

特定のクロマチンドメインの形成中に機械的な詳細を理解するための強力なアプローチは、最初にドメインを破壊し、細胞内で進行中のその再構成を追跡することです。プロセスは、再構築中にいつでも一時停止して、進行中のイベントを詳細に分析できます。クロマチンドメインに関する以前の研究では、このような事象を解決することはできず、安定した状態下で行われました(例えば、...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
(Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg)	Sigma	H7904-5MG	For induction of EED expression
16% Paraformaldehyde aqueous solution (10x10 ml)	Electron Microscopy Sciences	15710	For immunofluorescence
2-mercaptoethanol	LifeTechnologies	21985-023	For mESCs culture
2% Gelatin Solution	Sigma	G1393-100ml	For mESCs culture
Accutase 500 ML	Innovative Cell Tech/FISHER	AT 104-500	For mESCs culture
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson immunoresaerch	711-585-152	For immunofluorescence
Aqua-Mount Mounting Medium	FISHER/VWR	41799-008	For immunofluorescence
CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK	Fisher Sci	177445PK	For immunofluorescence
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) - 10 mg	Life Tech	D1306	For immunofluorescence
ERK inhibitor, PD0325901	Stemgent	04-0006	For mESCs culture
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein	Millipore/Fisher	ESG1107	For mESCs culture
FBS Stem Cell Qualified	Atlanta	S10250	For mESCs culture
Gibson Assembly Master Mix	NEB	E2611L	For Donor template cloning
GSK3 inhibitor, CHIR99021	Stemgent	04-0004	For mESCs culture
H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB	Cell Signaling	9728S	Antibody for ChIP-seq
H3K27me3	Cell Signaling	9733S	Antibody for ChIP-seq
Histone H2Av antibody (pAb)	Active motif	39715	Spike-in control for ChIP-seq
Knockout DMEM	Invitrogen	10829-018	For mESCs culture
L-glutamine	Sigma	G7513	For mESCs culture
Lipofectamine 2000	LifeTech	11668019	For transfection
MangoTaq DNA Polymerase	Bioline	BIO-21079	For Genotyping PCR
Normal donkey serum (10 mL)	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	For immunofluorescence
Penicillin-Streptomycin	Sigma/Roche	P0781	For mESCs culture
pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)	Addgene	48138	For gRNA cloning
QuickExtract DNA Extraction Solution	Lucigen	QE0905T	For Genotyping PCR
Triton X-100	Sigma	T8787-250ML
Zero Blunt PCR Cloning Kit	Thermo Fisher	K270020	For Donor template cloning
Primers/gBlocks
EED-KO-gRNA-1			Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems.
EED-KO-gRNA-2			Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems.
EED-gRNA-inducible			Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
i-WT-r Donor			https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
EED-gRNA-inducible			Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
i-MT-r Donor			https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background.
Genotyping Primers
Gnt-EED-KO-FW-1			Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp.
Gnt-EED-KO-REV-1			Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp.
Inducible_Genotype-FW-1			Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp.
Inducible_Genotype-REV-1			Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp.
Inducible_Genotype-FW-2			Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp.
Inducible_Genotype-REV-2			Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp.