成体ゼブラフィッシュテレンスファロンにおけるプラスミドDNAの生体内送達に関するエレクトロポレーション法

要約

ここで提示されるプラスミドDNA送達およびアジェンジモグリア細胞標識のエレクトロポレーション方法は、成人ゼブラフィッシュテレンセファロンにおける。このプロトコルは、個々のエペンディモグリア細胞を視覚化し、トレースするための迅速かつ効率的な方法であり、遺伝子操作の広い範囲にエレクトロポレーションを適用するための新しい可能性を開きます。

要約

エレクトロポレーションは、細胞膜内に一時的な細孔を作り、透過性を高めるために電界を細胞に適用するトランスフェクション法であり、それによって異なる分子を細胞に導入することができます。本論文では、エレクトロポレーションを用いて、成体ゼブラフィッシュテレンセファロンの心室ゾーンに並ぶエペンディモグリア細胞にプラスミドを導入する。これらの細胞の一部は幹細胞特性を示し、ゼブラフィッシュ脳に新しいニューロンを生成します。したがって、神経新生および再生における彼らの役割を決定するためには、彼らの行動を研究することが不可欠です。エレクトロポレーションを介したプラスミドの導入は、単一のエペンディモグリア細胞の長期表示および追跡を可能にする。さらに、Cre recombinaseやCas9などのプラスミドを単一のエペンディモグリア細胞に送達することができ、遺伝子組み換えや遺伝子編集を可能にし、制御された自然な細胞の自律遺伝子機能を評価するユニークな機会を提供します。環境。最後に、この詳細な、ステップバイステップのエレクトロポレーションプロトコルは、多数の単一のエペンディモグリア細胞へのプラスミドの正常な導入を得るために使用される。

概要

ゼブラフィッシュは、刺し傷の損傷後の脳再生を調べる優れた動物モデルです。哺乳類と比較して、進化のはしごでは、ゼブラフィッシュのようなあまり進化した種は、一般的に構成的神経新生の高い率と成体神経幹細胞滞留のより広い領域を示し、全体で新しいニューロンの一定の生成につながります成人生活のほとんどの脳領域。この特徴は、ゼブラフィッシュが研究されたほとんどの脳損傷モデルで新しいニューロンを効率的に生成する顕著な可能性を有するように、哺^乳類1と比較してゼブラフィッシュの著しく高い再生能力と相関しているように見^{える2、 3,4,5,6,7,8}.ここでは、成人期に顕著な神経新生を有する脳領域であるため、ゼブラフィッシュテレンスファロンが研究される。成人神経新生のこれらのゾーンは、成人哺乳動物^{脳9、10、11}における神経原ゾーンに相同である。

ゼブラフィッシュテレスファロン中の豊富な神経原領域は、細胞またはエペンディモリア細胞のような放射状グリアの存在に起因する。エペンディモグリア細胞は、常駐成人神経幹細胞として機能し、無傷および再生^脳3、5の両方で新しいニューロンの生成を担当しています。系統トレース実験は、心室のエペンディモリアが傷害に反応し、増殖し、病変部^位5に移行する新しい神経芽細胞を生成することを示している。ゼブラフィッシュテレスファロンの絶え間ない性質のために、エペンディモグリア細胞は心室表面に並び、心室壁を構築する。後部心室壁は、後頭形前形細胞層によって形成される(図1A)。重要なことに、ゼブラフィッシュエペンディモリアは、哺乳類の放射状グリアおよびエペンディマル細胞の両方の特性を具体化する。長い放射状プロセスは、放射状グリア細胞の典型的な特徴であるのに対し、細胞拡張およびタイトジャンクション(ならびにその心室位置)は、エペンディマル細胞12、13、14の典型的な特徴である。したがって、これらの細胞は、エペンディモグリア細胞と呼ばれる。

再生中の単一のエペンディモグリア細胞の生体内挙動に従うには、確実に標識する必要があります。蛍光顕微鏡検査用の生体内細胞標識における種々の方法は、内因性レポーターまたは親油性染^料15など、以前に記載されている。これらの方法は、エレクトロポレーションとは対照的に、より長い期間の時間を必要とし、多くの場合、単一細胞標識または永久的な長期トレースの可能性を提供しない。しかし、エレクトロポレーションは(単一細胞標識の他に)、宿主細胞に新しいDNAを導入する可能性を提供する。また、細胞へのDNA移植の他の方法と比較して、エレクトロポレーションは、最も効率的な方法の一つであることが実証されている16、17、18、19。

ここで提示されるエレクトロポレーションプロトコルは、成体ゼブラフィッシュテレンセファロン中の単一のエペンディモグリア細胞を標識する目的で精製された。このプロトコルは、長期^期間20にわたってそれらに従うか、または細胞自律的な方法で特定の経路を操作するために、単一のエペンディモグリア細胞の標識を可能に^{する21,22。}

プロトコル

このプロトコルで使用されるすべての動物は、標準的な畜産条件の下で保持され、実験は、EUおよびアッパーバイエルン州政府(AZ 55.2-1-54-2532-0916)の取り扱いガイドラインおよび規制に従って行われました。

1. エレクトロポレーション用プラスミド混合物の調製

1. 無菌水に関心のあるプラスミドを希釈し、速い緑色の汚れストック溶液[1mg/mL]を追加します。プラスミドの最終的な濃度が1 μg/μLであることを確認してください、 3%以下の濃度で染色を追加します。
2. 準備したら、上下に数回ピペッティングするか、指タップでプラスミド溶液を混ぜます。使用するまで室温(RT)で保管してください。
   注:2つのプラスミドを同じ細胞に同時にエレクトロポレーションする場合は、混合物に使用される個々のプラスミドの濃度が少なくとも0.8 ng/μLであり、モル比が1:1であることを確認し、80%~90%の共エレクトロポレーション効率を得ます。

2. 注入・エレクトロポレーション手順の準備

1. 針引き装置での注射に必要なガラス毛細血管(外径1mm、内径0.58mm)を調製する。
2. プラスミドの正しい量を注入するために(上記を参照)、2つの軽いと2つの重い重量で68.5 °Cの温度で毛細血管を引っ張る(引き手の仕様のための材料の表を参照)。
   注:別の引き手を使用する場合は、キャピラリーをキャリブレーションして、適切な体積のエレクトロポレーションミックスを提供します。
3. 手動で注入装置を200 hPaの注入圧力(ピノブを回すことによって)および0 hPaの一定圧力に設定する。手動で手動モードに注入時間を設定し、フットペダルで圧力を制御します。
4. 54~57V(それぞれ1秒間隔で25ミリ秒)で5パルスの「LVモード」に設定します。電極をデバイスに接続します。
5. きれいな魚の水で1つの魚のタンクを準備, 魚は、電気ポレーション手順の後に麻酔から目覚めされます.魚が完全に目覚めるまで、全体の回復期間の間、空気ポンプに取り付けられた空気石を維持することにより、水を通気します。
6. 通常のキッチンスポンジを取り、注射とエレクトロポレーション手順中に魚を保持するためにスポンジに縦方向のカットを行います(前の^出版物3を参照)。
   注:潜在的な有毒化学物質を除去するために、キッチンスポンジを定期的に洗浄または交換する必要があります。
7. 注射およびエレクトロポレーションのセットアップの隣に、導電性の高い多目的超音波ゲルを少量置きます。
   注:これにより、十分な電気伝導性が確保され、その結果、テレスファロン全体に電気ポレートされた細胞が分布します。

3. ゼブラフィッシュ麻酔

1. 麻酔の前に、蒸留水中で0.2%MS222で麻酔のストック溶液を調製し、Tris-HClバッファーでpHを7に調整します。このストックを1:10(すなわち、0.02%MS222に)魚水を使用して希釈します。
2. 体とエラの動きが治まるまで、この作業溶液中に魚を麻酔します(通常、数分間)。

4. プラスミド溶液注入

1. マイクロローダーの先端を使用してプラスミド溶液の10 μLで準備されたガラスキャピラリーを充填します。毛細血管内の気泡の形成を避けてください。
2. インジェクションデバイスでメニュー/キャピラリーを押します。針ホルダーに針を挿入して固定します。
3. 3.2倍または4倍の倍率の立体顕微鏡の下で、細かい鉗子を使用して毛細血管の先端だけをカットする。注入装置を変更キャピラリーモードから注入モードに切り替え、フットペダルで圧力を加えて、プラスミド溶液が針から簡単に動き、障害がないようにします。
4. 産袋から麻酔液で容器(プラスチックボックス)に魚を移します。エラの動きが落ち着くまで数分待ちます。
5. 魚を濡らしたスポンジの中に入れ、後ろ側を上に向けて置きます。手順の正確さを確保するために、立体顕微鏡の下で以下のすべての注入ステップを実行します。
6. 40mmの刃先と厚さ0.5mmのステンレス鋼から解剖したマイクロナイフを使用して、視神経殻との境界のすぐ隣にあるテレンスファロン(図1B)の後側に魚の頭蓋骨に小さな穴を作ります。
   注:このステップは、脳の損傷を避けるために、穴が非常に小さく、表面的で、頭蓋骨だけを貫通する必要があるため、慎重に行われるべきです。
7. 必要に応じて魚を傾け、ガラス毛細血管の先端を正しい角度で頭蓋骨に向け、穴を通して毛細血管の先端の浸透を容易にします。
8. 頭蓋の穴を通して毛細血管の先端を慎重に挿入し、心脳心室に到達します(図1Bを参照)。これは、後部前形細胞層を介した浸透を必要とします。脳組織との接触を避けるために毛細血管を深く挿入しないように特に注意してください。毛細血管を半球の間に正確に保ち、後部位のエピディマル層を突き刺した直後に心室内に残る。
   注:これは非常にデリケートなステップです。この手順の精度は、真^鍮24などの色素変異線を使用して改善され、注射中のガラス毛細血管位置のより良い可視化を可能にする。
9. 心室の内側の毛細血管先端を用いて、約10sのフットペダルで圧力をかけてプラスミド溶液を注入し、約1μLのプラスミド溶液に相当する。
   注:針の引き手、毛細血管または注入器を変更する場合は、常にプラスミド溶液の1 μLを提供するために、システムを校正する必要があります。較正は、鉱物油(例えば、パラフィン油)に排出されるプラスミド液滴の直径を測定し、その後液滴の体積を計算することによって行うことができる。10sの注射の後、鉱物油に排出されるプラスミド液体の〜1 μLがあるべきである。
10. 心室全体に液体の広がりを観察することにより、前のステップの成功を確認してください。

5. エレクトロポレーション

1. スポンジに入れたまま、注射セットから魚を取り出します。
2. 電極の先端の内側を超音波ゲルに浸します。
3. 少量の超音波ゲルで魚のテレンサロンをカバーします。
4. 魚の頭部を電極の間に置き、魚の頭部の腹部側に正極を配置し、背側に負極を配置します(図1C)。これは、電気ポレートエペンディモリアに必要な電流の流れの方向を設定します。
5. 電極をテレスファロンに対して穏やかに正確に押します(図1C)。フットペダルで電流を管理します。5つのパルスがすべて終わるまで、電極を所定の位置に保持します。

6. 魚の回復

1. 魚は、それが目を覚ますまで、以前に準備された、継続的に通気タンクで回復してみましょう。リドカインゲルは、おそらく開発された痛みを和らげるために頭蓋骨に適用することができます。

結果

記載されたエレクトロポレーション法は、ゼブラフィッシュテレスファロンおよびちょうど後頭平形細胞層の下に表面的に位置するエピデンジモグリア細胞へのプラスミドDNAの送達を可能にする(図1A)。

エレクトロポレーションの結果が陽性の場合、標識された単一エペンディモグリア細胞(図2...

ディスカッション

このエレクトロポレーションプロトコルは、個々のエペンディモグリア細胞を標識する生体内で信頼性の高い方法である。プロトコルは、ニューロンやオリゴデンドロサイトなどの他の細胞型にラベルを付けるために、さらなる適応が必要な場合があります。ラベリングを成功させるために、異なるプロモーターを含むプラスミドを使用することができます。チキンβアクチンプロモーター?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258-25G	For coloring plasmid solution
MS222	Sigma-Aldrich	A5040-25G	MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light
Ultrasound gel	SignaGel, Parker laboratories INC.	15-60	Electrode Gel
Equipment
Air pump	TetraTec APS 50, 10l-60l		Can be bought in the pet shops
BTX Tweezertrodes Electrodes	Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus	45-0486	1 mm diameter
Electroporation device	BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus	45-0662
Injection device	FemtoJet 4i, Eppendorf	5252000013
Standard Wall Borosillicate Glass Capillary	Warner Instruments	64-0766	Model No: G100-4
Microloader tips	Eppendorf	5242956003
Micro-knife	Fine Science Tools	10056-12
Joystick micromanipulator	Narishige Japan	MN - 151
Needle holder	FemtoJet 4i, Eppendorf	5252000013	Needle holder comes together with the injection device
Needle pulling device	Narishige Japan	Model No: PC-10	The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100
Petri dishes	Greiner Bio-One International	633161