JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

本報告書は、ミクログリアまたは血液マクロファージからの細胞外小胞(EV)単離に関する時系列的要件を強調している。ミクログリア由来EVは神経突起の伸長因子として評価され、血液マクロファージ由来EVはインビトロアッセイにおけるC6グリオーマ細胞浸潤の制御で研究された。目標は、これらのEV機能を特定の微小環境における免疫メディエーターとして理解することです。

要約

中枢神経系(CNS)の神経炎症状態は、生理学的および病理学的状態において重要な役割を果たす。ミクログリアは、脳内に存在する免疫細胞、および時には浸潤した骨髄由来マクロファージ(Bmdm)を、CNSにおけるそれらの微小環境の炎症プロファイルを調節する。免疫細胞からの細胞外小胞(EV)集団が免疫メディエーターとして機能することが受け入れられています。したがって、その収集と分離は、その内容を特定するだけでなく、レシピエント細胞に対する生物学的影響を評価するために重要である。本データは、超遠心分離およびサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)ステップを含む、ミクログリア細胞または血液マクロファージからのEV分離に関する時系列的要件を強調している。非標的プロテオミクス解析により、EVマーカーとしてのタンパク質シグネチャの検証が可能になり、生物学的に活性なEVコンテンツが特徴付けされました。ミクログリア由来のEVは、神経突起の成長における免疫メディエーターとしての重要性を評価するために、ニューロンの一次培養にも機能的に使用された。その結果、ミクログリア由来のEVが、インビトロでの神経突起の成長を促進する作用を示した。並行して、血液マクロファージ由来のEVは、C6グリオーマ細胞のスフェロイド培養において免疫メディエーターとして機能的に使用され、これらのEVがインビトロでグリオーマ細胞の浸潤を制御することを示す結果である。このレポートでは、EV媒介免疫細胞機能を評価する可能性を強調する一方で、そのような通信の分子基盤を理解する。この解読は、CNS病理の微小環境における免疫特性を模倣するために、自然小胞および/または治療小胞のインビトロ調製を促進することができる。

概要

多くの神経病理学は、ますます考慮されている複雑なメカニズムである神経炎症状態に関連していますが、免疫プロセスは多様であり、細胞環境に依存しているため、まだ十分に理解されていません。実際、CNS障害は体系的に同じ活性化シグナルおよび免疫細胞集団を含まないため、炎症促進反応または抗炎症反応は病理学の原因または結果として評価することは困難である。「ミクログリア」と呼ばれる脳内マクロファージは、神経系と免疫系の間の界面にあるように見える。ミクログリアは骨髄由来を有し、脳を植民地化する原始造形中の黄身嚢に由来するが、末梢マクロファージは末梢マクロファージ2となる決定的な造形中の胎児肝臓に由来する。ミクログリア細胞は、アストロサイトやオリゴデンドロサイト3などのニューロンおよびニューロン由来のグリア細胞と通信する。最近のいくつかの研究では、ミクログリアがCNSの発達および成人組織恒常性の間に神経可塑性に関与していること、また神経変性疾患44,55に関連する炎症性状態で関与することが示されている。さもなければ、血液脳関門の完全性は、他のCNS病理において損なわれる可能性がある。免疫応答は、特に多形性神経膠芽腫において、血管形成過程およびリンパ管の存在を介して血液脳関門が再編成される6、77のミクログリア細胞のみでは支持されない。したがって、大骨髄由来マクロファージ(BMDM)浸潤は、腫瘍依存性血管新生機構全体にわたって脳腫瘍に起こる8。癌細胞は、免疫抑制性および腫瘍増殖につながる浸潤性BMに大きな影響を及ぼす9.このように免疫細胞とそれらの脳微小環境との間の通信は、細胞起源及び活性化シグナルが多様である10,11,11として理解し難い。このように、生理学的条件下で免疫細胞関連の分子シグネチャの機能を理解することは興味深い。この点に関して、細胞外小胞(EV)の放出を通して、免疫細胞と細胞微小環境との間の細胞間のコミュニケーションを研究することができる。

EVは、健康での免疫機能の調節、および病理学的状態12,13,13においてますます研究されている。エキソソームとミクロシクルの2つの集団を考慮することができる。それらは異なった生物発生およびサイズ範囲を提示する。エキソソームは、直径30~150nmの小胞で、内膜系から生成され、多面体(MVB)と血漿膜との融合時に分泌される。マイクロベシクルは直径約100〜1,000nmで、細胞形質膜14から外へ出芽することによって生成される。エキソソームとミクロベシクルの差別は、サイズや分子パターンに応じて実現することは困難であるため、本レポートではEVという用語のみを使用します。CNSにおけるEV関連通信は、線虫、昆虫またはアンネリド15、16を含む無脊椎動物種への関与を示した研究以来、16祖先のメカニズムを表す。さらに、EVが異種の細胞と通信できることを示す結果は、このメカニズムがキーロックシステムであることを示し、まず小胞とレシピエント細胞間の表面分子認識に基づいて、メディエーター16、17,17の取り込みを可能にする。実際、EVは、タンパク質(例えば、酵素、シグナル伝達、生物新生因子)、脂質(例えば、セラミド、コレステロール)または核酸(例えば、DNA、mRNAまたはmiRNA)がレシピエント細胞活動の直接的または間接的な調節因子として作用するタンパク質のような多くの分子を含んでいる。そのため、免疫細胞に対しても方法論的研究が行われ、EVを単離し、タンパク質シグネチャ18,19,19を完全に特徴付けた。

最も初期の研究では、Wnt3a-またはセロトニン依存活性化20,21,21に続く誘導機構として、一次培養ラットミクログリアからのエキソソームの放出を実証した。CNSにおいて機能的には、ミクログリア由来のEVは、神経興奮性22,23,23の制御に寄与するニューロンにおけるシナプス前末端によるシナプスベシクル放出を調節する。ミクログリア由来のEVは、大きな脳領域24,25,25においてサイトカイン媒介性炎症反応を伝播することもできる。重要なことに、トール様受容体ファミリーのための多様なリガンドは、ミクログリア26のEVの特定の生産を活性化するかもしれない。例えば、インビトロ研究は、LPS活性化ミクログリアBV2細胞株が炎症促進サイトカイン27を含む微分EV内容物を産生することを示している。したがって、CNSにおける免疫細胞亜集団の機能的多様性、ミクログリアおよび浸潤BMDMは、レシピエント細胞へのEVの影響およびEV内容物の同定を含む独自のEV集団を通じて評価され得る。

我々は、マイクログリアおよびBMDM由来EVの機能特性を、16,19,19の分離後に評価する方法を説明した。本報告では、ミクログリア由来EVが神経突起の伸長に及ぼす影響と、グリオーマ細胞凝集体の制御に及ぼすマクロファージ由来EVの効果を独自に評価することを提案する。また、EV単離手順を検証し、生物学的に活性なタンパク質シグネチャを同定するために、EV画分の広いプロテオミクス解析を提案する。EV内容物の有益な効果と分子解読は、脳障害における治療剤としての可能な操作および使用に役立つ可能性がある。

プロトコル

1. ミクログリア/マクロファージの主要文化

  1. ミクログリアの主要文化
    1. 培養市販ラット一次ミクログリア(2 x 106細胞)(材料表を参照)は、10%エキソソームフリー血清、100 U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、および9.0 g/Lグルコースを37°CおよびCO%で補ったダルベックの改変イーグル培地(DMEM)で表した。
    2. 48時間培養後にコンディションされた培地を収集し、EVの分離に進みます。
  2. マクロファージの主要文化
    1. 培養市販ラット一次マクロファージ(1 x 10 6細胞)を37°C及Table of Materialsび5%CO2で製造業者が提供する培地中の2(1 x106細胞)エキソソームフリー血清を用いた。
    2. 24時間培養後にコンディションされた培地を収集し、EVの分離に進みます。

2. EV の分離

  1. 条件付きメディアからのEVの事前分離
    1. ミクログリアまたはマクロファージ培養物(ステップ1.1.2または1.2.2)から円錐管にコンディション培養液を移す。
    2. 遠心分離機を室温(RT)で10分間1,200xgで細胞をペレット化する。 g
    3. 上清を新しい円錐形の管に移す。遠心分離機は、アポトーシス体を排除するためにRTで20分間1,200 x gで。
    4. 上清を10.4 mLのポリカーボネートチューブに移し、チューブを70.1 Tiローターに移します。4°Cで90分間100,000xgの超遠心分離機をEVにペレット化する。 g
    5. 上清を捨て、0.20 μmの濾過リン酸緩衝液生理食塩(PBS)の200 μLでEVを含むペレットを再中断します。
  2. EV の分離
    1. 自家製サイズ除外クロマトグラフィーカラム(SEC)の作成
      1. ガラスクロマトグラフィーカラム(長さ:26cm;直径:0.6cm)を空にし(材料表を参照)、洗浄して滅菌します。
      2. 60 μm のフィルターをカラムの下部に配置します。
      3. 架橋されたアガロースゲルろ過ベースマトリックスを使用してカラムを積み重ね、直径0.6cm、高さ20cmの静止相を作成します。
      4. 0.20 μmのろ過PBSの50 mLでフェーズをすすい。必要に応じて後で使用するために4°Cで保管してください。
    2. 再懸濁したEVペレットをSECカラムの静止段階の上に置きます。
    3. 250 μLの連続分を20個収集しながら、固定フェーズの上部に0.20 μmのフィルターを加え、カラムの乾燥を防ぎます。必要に応じて-20°Cで分数を保存してください。
      注:1週間より長い貯蔵は、分子分析のためのEV完全性を維持するために-80°Cで行うことができる。
  3. SEC画分のマトリックスアシストレーザー脱離イオン化(MALDI)質量分析
    1. セクション 2.2 で説明されているように EV 分離に進みます。
    2. 200 μL のペプチド校正ミックス溶液で EV ペレットを再懸濁します(材料表を参照)。
    3. セクション 2.2.1 から 2.2.3 に説明されているように EV コレクションに進みます。
    4. 真空濃縮器で分画を完全に乾燥させます。
    5. 0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)の10 μLで分画を再構成してください。
    6. MALDI研磨鋼ターゲットプレート上に1μLのα-シアノ-4-ヒドロキシシンナミン酸(HCCA)マトリックスと再構成された分率を混合します。
    7. MALDI質量分析計を使用して、すべての分画を分析します。
    8. 生成されたスペクトルを専用ソフトウェアで分析します(資料一覧を参照)。

3. EVの特徴付け

  1. ナノ粒子追跡解析(NTA)
    メモ:NTA    解析は、ナノ粒子追跡解析装置(材料表を参照)と自動シリンジポンプで行います。
    1. 0.20 μm のフィルター処理された PBS で、ステップ 2.2.3 の各 SEC 分数の希釈 (1:50 ~ 1:500 の範囲) を作成します。
    2. EV凝集を排除する溶液をボルテックス。
    3. 希釈した溶液を1mLのシリンジに入れ、自動シリンジポンプに入れます。
    4. 画面ゲインレベル(3)とカメラレベル(13)にカメラ設定を調整します。
    5. [実行] をクリックし、次のスクリプトを起動します。
      1. 分析チャンバにサンプルをロードします(注入率:15sの場合は1,000)。
      2. ビデオ録画の速度流量を減少させ、安定させます(注入速度:15秒間25)。パーティクル フローの連続した 60 s ビデオを 3 つキャプチャします。
      3. ビデオ分析の前に、カメラレベル(13)と検出しきい値(3)を調整します。[設定] をクリックします。[OK]をクリックして解析を開始し、解析が完了したら[エクスポート]をクリックします。
    6. 各分画分析の間に、0.20 μmの濾過されたPBSの1 mLで洗浄する。
  2. 電子顕微鏡(EM)解析
    1. セクション 2 で説明されているように、EV を分離します。
      注:滅菌状態は必要ありません。
    2. セクション 3.1 を繰り返して、EV を定量化します。
      注:EM 分析には正の分数のみが使用されます。
    3. 50 kDa 遠心フィルター (材料表を参照) を使用して、EV 含有 SEC の分数を集中します。
    4. 濃縮EVを2%パラホルムアルデヒド(PFA)の30 μLに再懸濁します。
    5. サンプルの10 μLをカーボンコーティングされた銅グリッドに積み込みます。
    6. 湿潤環境で20分間インキュベートします。
    7. グリッド上のサンプルの吸収が良好な場合は、ステップ 3.2.5 と 3.2.6 を繰り返します。
    8. グリッドを、RTで5分間PBSで1%グルタルアルデヒドの低下に移します。
    9. 超純水でサンプルを数回洗います。
    10. 氷上で10分間サンプルを4%の酢酸ウラニルと2%メチルセルロース(1:9、v/v)の混合物と対照的にします。濾紙を使用して混合物の過剰を除去します。
    11. 試料を乾燥させて、200kVの透過型電子顕微鏡で観察します(材料表を参照)。
  3. ウェスタンブロット分析
    1. タンパク質抽出
      1. 手順 3.2.1 ~ 3.2.3 を繰り返して、EV を分離して集中します。
      2. 50 μLのリパバッファー(150 mM 塩化ナトリウム[NaCl]、50 mMトリス、5 mM エチレングリコールビス(2-アミノエチルルター)-N,N,N',N'テトラ酢酸[EGTA]、 2 mM エチレンアミン-テトラ酢酸 [EDTA], 100 mM フッ化ナトリウム [NaF] , 10 mM ピロリン酸ナトリウム, 1% ノニデクト P-40, 1 mM フェニルメタンスルホニルフッ化物 [PMSF], 1x プロテアーゼ阻害剤) EVサンプル (EV濃度から得られる 25 μL)
      3. 5 s(振幅:500 W;周波数:20kHz)、氷の上で3回の超音波処理。
      4. 20,000 x gで10分間、4°Cで遠心分離により、静脈の破片を除去します。
      5. 上清を収集し、ブラッドフォードタンパク質アッセイ法でタンパク質濃度を測定します。
    2. ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)およびウェスタンブロッティング
      1. タンパク質抽出物(30 μg)と5cレムリサンプルバッファー(v/v)を混合します。
      2. タンパク質ミックスを12%ポリアクリルアミドゲルにロードします。
      3. TGSバッファー(25 mM Tris pH 8.5、192 mMグリシン、および0.1%SDS)でゲル中のタンパク質を15分間70V、45分間120 Vで移行します。
      4. 230 Vで半乾燥系でニトロセルロース膜にタンパク質を30分間移動させます。
      5. ブロッキングバッファー(0.05%Tween 20 w/v、0.1 M PBSで/v、pH 7.4で5%粉ミルク)でRTで1時間膜を飽和させます。
      6. ブロック緩衝液に希釈したマウスモノクローナル抗ヒト熱ショックタンパク質90(HSP90)抗体(1:100)で4°Cで膜を一晩インキュベートする。
      7. 膜をPBS-Tween(PBS、0.05%トゥイーン20 w/v)で3回15分間洗浄します。
      8. ラットワサビペルオキシダーゼ共役抗マウス IgG 二次抗体をブロッキングバッファーに希釈して、RT で 1 時間膜をインキュベートします (1:10,000)。
        注:陰性対照は、二次抗体を単独で使用して行われる。
      9. 洗浄手順を繰り返します(ステップ3.3.2.7)。
      10. 強化された化学発光(ECL)ウェスタンブロッティング基板キットを有する膜を明らかにする(材料表を参照)。
  4. プロテオミクス解析
    1. タンパク質抽出とインゲル消化
      1. 手順 3.2.1 ~ 3.2.3 を繰り返して、EV を分離して集中します。EVタンパク質抽出のためにステップ3.3.1を繰り返します。
      2. 12%ポリアクリルアミドゲルの積層ゲルでタンパク質の移行を行います。
      3. RTで20分間クーマシーブルーでゲル中のタンパク質を固定します。
      4. 各着色されたゲル片を物品化し、1mm3の小片に切ります。
      5. 各溶液の300 μLでゲル片を連続して洗浄:15分間の超純水、 100%アセトニトリル(ACN)100%15分間、100mM重炭酸アンモニウム(NH4HCO3)15分間、ACN:100 mM NH4HCO 3(1:1、v/v)15分間、100%ACNを5分間連続撹拌する。3
      6. 真空濃縮器付きの完全にゲル部分を乾燥させます。
      7. 100 mM NH4HCO3 100 μL の 100 μL を 56°Cで 10 mM ジチオスレイトール 1 時間含有して、タンパク質還元を行います。
      8. RTで50mMのヨードアセトアミドを含む100mMNH4HCO3の100 μLでタンパク質アルキル化を45分間実施します。
      9. 各溶液の300 μLでゲル片を連続して洗浄します:15分間NH4HCO3の100mM、15分間のACN:20mM NH4HCO 3(1:1、v/v)、および100%ACNを連続攪拌しながら5分間洗浄します。3
      10. 真空濃縮器でゲル片を完全に乾燥させます。
      11. 20 mM NH4HCO3で 50 μL のトリプシン (12.5 μg/mL) を 37 °C で一晩でタンパク質消化を行います。
      12. 37°Cで30分間、30分間、そして連続撹拌しながらRTで15分間、100%ACNの50 μLのゲルから消化したタンパク質を抽出します。
      13. 20 mM NH 4 HCO 3溶液で20 mM NH4HCO3溶液で2回、連続撹拌しながら抽出手順を2回繰り返します。
      14. 100%ACNの100 μLを10分間加え、連続撹拌します。
      15. 真空濃縮器を用いて乾燥したタンパク質を、0.1%TFAの20 μLで再懸濁します。
      16. 10 μL ピペットチップを使用して、ペプチドの脱塩と濃縮用の C18 逆相培地 (材料表を参照) と ACN:0.1% ギ酸 (FA) (80:20, v/v) を含むペプチドを溶出させます。
      17. 真空濃縮器でサンプルを完全に乾燥し、液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC-MS/MS)のためにACN:0.1%FA(2:98、v/v)の20 μLで再懸濁します。
    2. LC-MS/MS 分析
      1. 消化されたペプチドをLC-MS/MS装置にロードし、他の42の詳細に記載されているパラメータに従ってサンプルおよびデータ分析を行う。
    3. 生データ分析
      1. 質量分析データを処理してタンパク質を同定し、標準パラメータを使用して各サンプルの同定されたタンパク質を定量プロテオミクスソフトウェアパッケージと比較します。
      2. 標準的なパラメータを使用して、EV陽性サンプルからの排他的および過剰に表現されたタンパク質のリストを、タンパク質ネットワークおよび生物学的プロセスを予測するソフトウェアでエクスポートします。
      3. 分画中の同定されたタンパク質のリストを、Exocartaオープンアクセスデータベースの上位100個のEVマーカーと比較します(材料表を参照)。

4. 機能性EV効果アッセイ

  1. PC-12細胞株の神経突起成長アッセイ
    1. 完全なDMEM培地(2mM L-グルタミン、10%胎児馬血清(FHS)、5%ウシ胎児血清(FBS)、100 UI/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシンの培養PC12細胞株。
      注:セラは、全体の手順でエキソソームフリーです。
    2. 24ウェルプレートにカバーガラス(すべてのウェル)を追加します。ポリD-リジン(0.1 mg/mL)でプレートをコーティングし、260,000個の細胞/ウェルをシードします。
    3. 5%CO2の下で37°Cで細胞を2インキュベートする。
    4. 24時間のインキュベーションの後、培地をDMEM分化培地(2 mM L-グルタミン、0.1%FHS、100 UI/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン)に1 x 106ミクログリアEV(ステップ1.1.2から)に変更します。
      注:制御条件は、微小グリアEVを分化培地に入れずに行う。
    5. 播種後4日目に、完全なDMEM培地を100 μLですべてのウェルをロードします。
    6. 播種後7日目に、RTで20分間4%PFAで細胞を固定し、PBSで3回(それぞれ10分)すすいでください。
    7. 4°Cで30分間ローダミン共役ファロイジンを細胞に染色し、PBSで3回(それぞれ10分)すすいだ。
    8. 細胞を希釈したHoechst 33342(1:10,000)をRTで30分間染色し、PBSで3回(それぞれ10分)すすいだ。
    9. カバーガラスを蛍光実装媒体付きスライドに取り付けます(材料表を参照)。
    10. 共焦点顕微鏡でスライドを分析し、各スライドの5つのランダムな画像を撮ります。
    11. 他の場所で詳細に説明されているように、自動定量ソフトウェア(全神経突起長)を使用して、ニューライトの伸びを測定する。
  2. ラットの一次ニューロンの神経突起成長
    1. ポリD-リジン(0.1 mg/mL)とラミニン(20 μg/mL)で8ウェルガラススライドをコーティングします。
    2. 適切な培養培地中の培養ラットの一次ニューロン(材料表を参照)は、1ウェルあたり50,000細胞をめっきし、37°Cで5%CO2下で細胞を48時間インキュベートした。2
      注:セラは、全体の手順でエキソソームフリーです。
    3. ニューロン培養培地に1 x 106ミクログリアEVを加え、さらに48時間5%CO22以下の37°Cでインキュベートします。
      注:制御条件は、ニューロン培養培地においてミクログリアEVなしで行われる。
    4. ステップ 4.1.6 ~ 4.1.9 に従って、セルを固定して染色します。
    5. スライドを分析するには、手順 4.1.10 および 4.1.11 に従います。
  3. 神経膠腫細胞の浸潤
    1. C6ラットグリオーマ細胞を完全なDMEM培地(10%FBS、2 mM L-グルタミン、1x抗生物質)で再懸濁し、20μLで8,000細胞の最終濃度で5%コラーゲンを含有する。
      注:セラは、全体の手順でエキソソームフリーです。
    2. 60mmティッシュ培養皿の底部に5mLのPBSを置きます。蓋を反転させ、20 μL(8,000細胞)の細胞懸濁液を蓋の底に沈めます。
    3. 蓋をPBS充填底室に反転させ、細胞回転楕円体が形成されるまで37°Cでプレートをインキュベートし、72時間CO2で5%のCO2をインキュベートします。
    4. 1 x 108マクロファージEV(ステップ1.2.2から)を2.2mg/mLコラーゲン混合物(2mLのウシコラーゲンタイプI溶液[3mg/mL]、250 μLの最小必須培地(MEM)、0.1M水酸化ナトリウム500 μL)に加えます。
      注:制御条件は、コラーゲン混合物中のマクロファージEVなしで行われる。
    5. 細胞のスフェロイドを埋め込むための24ウェルプレートにEVを含むコラーゲン混合物を配布します。
    6. 新たに形成された細胞スフェロイドを各ウェルの中心に埋め込む。
    7. 37°Cでプレートを30分間インキュベートし、5%CO2でゲルを固化させます。2
    8. その後、各ウェルのコラーゲンマトリックス上に400μLの完全なDMEM培地を重ね合わせた。
    9. 37 °Cおよび5%CO2で合計6日間、完全なシステムをインキュ2ベートします。
      注:回転楕円体の細胞浸潤は、4x/0.10 N.A.の目的を用いた反転光顕微鏡を用いたデジタル写真によって監視される。
    10. 毎日各井戸の画像を取得します。
    11. 画像を処理し、先に説明したとおりのソフトウェアを用いて細胞回転楕円体領域の浸潤を定量化する42.
      注:侵略領域およびスフェロイド領域は、0日目に測定された浸潤領域および回転楕円体領域に対して毎日正規化された。

結果

細胞外小胞(EV)に生物学的影響を与える主な課題の1つは、培養培地全体からEVを分離する能力です。本報告では、超遠心(UC)とサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を用いた方法を、EVマーカーを検証し、生理活性化合物を同定するためのタンパク質シグネチャの大規模分析に結合する方法を紹介する。マクロファージまたはミクログリア由来のEVを、それぞれ24時間または48時間培養した後に、条?...

ディスカッション

中枢神経系(CNS)は、細胞間通信がホメオスタシス30に必要な正常な神経機能を調節する複雑な組織である。EVは現在広く研究され、細胞間通信31のための重要な分子貨物として記述されている。彼らは特にレシピエント細胞にメディエーターのカクテルを提供し、それによって健康で病的な状態におけるそれらの機能に影響を与える32.最近?...

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

発表された作品は、ミニステール・ド・ラ・エデュケーション・ナショナル、ド・ランセニュエ・シュペリエール・エ・ド・ラ・レシェルシュ、インサームによって支えられました。私たちは、BICeL - キャンパスサイエンティフィックシティ施設が楽器や技術アドバイスにアクセスすることを感謝しています。ジャン=パスカル・ギメノ、スライマン・アブールアール、イザベル・フルニエの質量分析支援を心よりお見せします。私たちは、タニナ・アラブ、クリステル・ファン・キャンプ、フランソワーズ・ル・マレック・クロク、ヤコポ・ヴィツィオーリ、ピエール=エリック・ソティエールが科学技術開発に強く貢献してくれたことを感謝しています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein GelsBio-rad4561045EDU 
AcetonitrileFisher ChemicalsA955-1 
Amicon 50 kDa centrifugal filterMerckUFC505024 
Ammonium bicarbonateSigma-Aldrich9830 
HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659)Santa-cruzsc-13119 
B27 Plus supplementGibcoA3582801 
BenchMixer V2 Vortex MixerBenchmark ScientificBV1003 
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford)Bio-Rad5000006 
C18 ZipTipsMerck MilliporeZTC18S096 
C6 rat glioma cellATCCATCC CCL-107 
Canonical tubesSarstedt62.554.002 
CentrifugeEppendorf5804000010 
CO2 IncubatorThermoFisher  
Confocal microscope LSM880Carl ZeissLSM880 
Cover glassMarienfeld111580 
Culture Dish (60 mm)Sarstedt82.1473 
DithiothreitolSigma-Aldrich43819 
DMEMGibco41966029 
EASY-nLC 1000 Liquid ChromatographThermoFisher  
Electron microscope JEM-2100JEOL  
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acidSigma-Aldrich03777-10G 
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma-AldrichED-100G 
Exo-FBSOzymeEXO-FBS-50A-1Exosome depleted FBS
ExoCarta database (top 100 proteins of Evs)  http://www.exocarta.org/
Fetal Bovine SerumGibco16140071 
Fetal Horse SerumBiowestS0960-500 
Filtropur S 0.2Sarstedt83.1826.001 
Fisherbrand Q500 Sonicator with ProbeFisherbrand12893543 
FlexAnalysisBrucker  
Fluorescence mounting mediumAgilentS3023 
Formic AcidSigma-Aldrich695076 
Formvar-carbon coated copper gridsAgar scientific LtdAGS162-3 
GlucoseSigma-AldrichG8769 
GlutaraldehydeSigma-Aldrich340855 
Hoechst 33342Euromedex17535-AAT 
IdoacetamideSigma-AldrichI1149 
InstantBlue Coomassie Protein StainExpedeonISB1L 
Invert light microscope CKX53Olympus  
L-glutamineGibco25030-024 
LabTek II 8 wells Nunc154534 
Laemmli 2xBio-Rad1610737 
LamininCorning354232 
MaxQuant software (proteins identification software)  https://maxquant.net/maxquant/
MBT Polish stellBrucker8268711 
MEM 10xGibco21090-022 
MethylcelluloseSigma-AldrichM6385-100G 
MiliQ waterMerck Millipore  
MilkRegilaitREGILAIT300 
Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis CellBio-Rad1658000FC 
MonoP FPLC columnGE Healthcare no longer available
Nanosight NS300Malvern PanalyticalNS300 
NanoSight NTA software v3.2Malvern Panalytical  
NanoSight syringe pumpMalvern Panalytical  
NeurobasalGibco21103-049 
Nitrocellulose membraneGE Healthcare10600007 
Nonidet P-40Fluka56741 
Nunc multidish 24 wellsThermoFisher82.1473 
ParaformaldehydeElectro microscopy Science15713 
PC-12 cell lineATCCATCC CRL-1721 
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122 
Peptide calibration mixLaserBio LabsC101 
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch115-035-003 
Perseus software (Processing of identified proteins)  https://maxquant.net/perseus/
Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugateSanta-cruzsc-362065 
Phenylmethanesulfonyl fluorideSigma-Aldrich78830 
Phosphate Buffer SalineInvitrogen14190094no calcium, no magnesium
pluriStrainer M/ 60 µmpluriSelect43-50060 
Poly-D-lysineSigma-AldrichP6407 
Polycarbonate centrifuge tubesBeckman Coulter355651 
Protease InhibitorSigma-AldrichS8830-20TAB 
PureColCell Systems5005 
Q-Exactive mass spectrometerThermoFisher  
rapifleX mass spectrometerBrucker  
Rat cortical neuronsCell ApplicationsR882N-20Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains
Rat Macrophage & Microglia Culture MediumCell ApplicationsR620K-100Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow
Rat primary macrophagesCell ApplicationsR8818-10a 
Rat primary microgliaLonzaRG535 
Sepharose CL-2BGE Healthcare17014001 
Sequencing Grade Modified TrypsinPromegaV5111 
SlideDustsher100204 
Sodium ChlorideScharlauSO0227 
Sodium Dodecyl SulfateSigma-AldrichL3771 
Sodium FluorideSigma-AldrichS7920-100G 
Sodium hydroxideScharlabSO0420005P 
Sodium pyrophosphateSigma-AldrichS6422-100G 
SpeedVac Vacuum ConcentratorThermoFisher  
String software (functional protein association networks)  https://string-db.org/
SuperSignal West Dura extended Duration SubstrateThermoFisher34075 
Syringe 1.0 mLTerumo8SS01H1 
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cellBio-Rad1703940 
Trifluoroacetic acidSigma-AldrichT6508 
TrisInterchimUP031657 
Tris-GlycineEuromedexEU0550 
Tween 20Sigma-AldrichP2287 
UltracentrifugeBeckman CoulterA95765 
Ultracentrifuge Rotor 70.1 TiBeckman Coulter342184 
Uranyl acetateAgar Scientific LtdAGR1260A 
Whatman filter paperSigma-AldrichWHA10347510 
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acidSigma-AldrichC2020-25G 

参考文献

  1. Thion, M. S., Ginhoux, F., Garel, S. Microglia and early brain development: An intimate journey. Science. 362 (6411), 185-189 (2018).
  2. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  3. Sankowski, R., Mader, S., Valdes-Ferrer, S. I. Systemic Inflammation and the Brain: Novel Roles of Genetic, Molecular, and Environmental Cues as Drivers of Neurodegeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  4. Chakrabarty, S., Kabekkodu, S. P., Singh, R. P., Thangaraj, K., Singh, K. K., Satyamoorthy, K. Microglia in health and disease. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 43 (3), 25-29 (2015).
  5. Sankowski, R., Mader, S., Valdés-Ferrer, S. I. Systemic inflammation and the brain: novel roles of genetic, molecular, and environmental cues as drivers of neurodegeneration. Frontiers in cellular neuroscience. 9, 28 (2015).
  6. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  7. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  8. Domingues, P., et al. Tumor infiltrating immune cells in gliomas and meningiomas. Brain, Behavior, and Immunity. 53, 1-15 (2016).
  9. Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression. Nature Neuroscience. 19 (1), 20-27 (2016).
  10. Thion, M. S., et al. Microbiome Influences Prenatal and Adult Microglia in a Sex-Specific Manner. Cell. 172 (3), 500-516 (2018).
  11. Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
  12. Rajendran, L., et al. Emerging Roles of Extracellular Vesicles in the Nervous System. The Journal of Neuroscience. 34 (46), 15482-15489 (2014).
  13. Gupta, A., Pulliam, L. Exosomes as mediators of neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 11 (1), 68 (2014).
  14. van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  15. Budnik, V., Ruiz-cañada, C., Wendler, F. Extracellular vesicles round off communication in the nervous system. Nature Reviews Neurosciences. 17, 160-172 (2016).
  16. Raffo-Romero, A., et al. Medicinal Leech CNS as a Model for Exosome Studies in the Crosstalk between Microglia and Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 4124 (2018).
  17. Zhou, Y., et al. Exosomes Transfer Among Different Species Cells and Mediating miRNAs Delivery. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (12), 4267-4274 (2017).
  18. Arab, T., et al. Proteomic characterisation of leech microglia extracellular vesicles (EVs): comparison between differential ultracentrifugation and OptiprepTM density gradient isolation. Journal of extracellular vesicles. 8 (1), 1603048 (2019).
  19. Murgoci, A. -. N., et al. Brain-Cortex Microglia-Derived Exosomes: Nanoparticles for Glioma Therapy. ChemPhysChem. 19 (10), 1205-1214 (2018).
  20. Glebov, K., et al. Serotonin stimulates secretion of exosomes from microglia cells. Glia. 63 (4), 626-634 (2015).
  21. Hooper, C., et al. Wnt3a induces exosome secretion from primary cultured rat microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 144 (2012).
  22. Gabrielli, M., et al. Active endocannabinoids are secreted on extracellular membrane vesicles. EMBO reports. 16 (2), 213-220 (2015).
  23. Antonucci, F., et al. Microvesicles released from microglia stimulate synaptic activity via enhanced sphingolipid metabolism. The EMBO Journal. 31 (5), 1231-1240 (2012).
  24. Frühbeis, C., Fröhlich, D., Kuo, W. P., Krämer-Albers, E. -. M. Extracellular vesicles as mediators of neuron-glia communication. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 182 (2013).
  25. Prada, I., et al. Glia-to-neuron transfer of miRNAs via extracellular vesicles: a new mechanism underlying inflammation-induced synaptic alterations. Acta neuropathologica. 135 (4), 529-550 (2018).
  26. Takenouchi, T., et al. Extracellular ATP induces unconventional release of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from microglial cells. Immunology Letters. 167 (2), 116-124 (2015).
  27. Yang, Y., Boza-Serrano, A., Dunning, C. J. R., Clausen, B. H., Lambertsen, K. L., Deierborg, T. Inflammation leads to distinct populations of extracellular vesicles from microglia. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 168 (2018).
  28. Duhamel, M., et al. Paclitaxel Treatment and Proprotein Convertase 1/3 (PC1/3) Knockdown in Macrophages is a Promising Antiglioma Strategy as Revealed by Proteomics and Cytotoxicity Studies. Molecular & Cellular Proteomics. 17 (6), 1126-1143 (2018).
  29. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: A novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. Journal of Neuroscience Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
  30. Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B. Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
  31. Rashed, M. H., et al. Exosomes: From Garbage Bins to Promising Therapeutic Targets. Int. J. Mol. Sci. Int. J. Mol. Sci. 18 (18), (2017).
  32. Yuana, Y., Sturk, A., Nieuwland, R. Extracellular vesicles in physiological and pathological conditions. Blood Reviews. 27 (1), 31-39 (2013).
  33. Frohlich, D., et al. Multifaceted effects of oligodendroglial exosomes on neurons: impact on neuronal firing rate, signal transduction and gene regulation. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
  34. Krämer-Albers, E. -. M., et al. Oligodendrocytes secrete exosomes containing major myelin and stress-protective proteins: Trophic support for axons. Proteomics. Clinical applications. 1 (11), 1446-1461 (2007).
  35. Verderio, C., et al. Myeloid microvesicles are a marker and therapeutic target for neuroinflammation. Annals of Neurology. 72 (4), 610-624 (2012).
  36. Prada, I., Furlan, R., Matteoli, M., Verderio, C. Classical and Unconventional Pathways of Vesicular Release in Microglia. GLIA. 61, 1003-1017 (2013).
  37. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  38. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. , (2017).
  39. Kennedy, B. C., et al. Tumor-Associated Macrophages in Glioma: Friend or Foe. Journal of Oncology. 2013, 1-11 (2013).
  40. Potolicchio, I., Carven, G. J., Xu, X., Stipp, C., Riese, R. J., Stern, L. J., Santambroggio, L. Proteomic Analysis of Microglia-Derived Exosomes: Metabolic Role of the Aminopeptidase CD13 in Neuropeptide Catabolism1. The Journal of Immunology. 175, 2237-2243 (2005).
  41. Turola, E., Furlan, R., Bianco, F., Matteoli, M., Verderio, C. Microglial microvesicle secretion and intercellular signaling. Frontiers in Physiology. 3, (2012).
  42. Cocucci, E., Meldolesi, J. Ectosomes and exosomes : shedding the confusion between extracellular vesicles. Trends in Cell Biology. 25 (6), 364-372 (2015).
  43. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  44. de Vrij, J., et al. Glioblastoma-derived extracellular vesicles modify the phenotype of monocytic cells. International Journal of Cancer. 137 (7), 1630-1642 (2015).
  45. van der Vos, K. E., et al. Directly visualized glioblastoma-derived extracellular vesicles transfer RNA to microglia/macrophages in the brain. Neuro-Oncology. 18 (1), 58-69 (2016).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

160

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved