ショウジョウバエの幼虫フォトタキスの分析のための光スポットベースアッセイ

要約

このプロトコルは、ショウジョウバエ幼虫の光戦術挙動を調査するための光スポットアッセイを導入する。このアッセイでは、光刺激として光スポットが生成され、幼虫光回避のプロセスが赤外線光ベースのイメージングシステムによって記録される。

要約

ショウジョウバエメラノガスターの幼虫は、飼育段階で明らかな光回避行動を示す。ショウジョウバエ幼虫フォトタキシスは、動物の回避行動を研究するためのモデルとして使用することができる。このプロトコルは、幼虫の光戦術挙動を調査するための光スポットアッセイを導入する。実験のセットアップには、光スポットを生成する視覚刺激システムと、幼虫光回避のプロセスを記録する赤外線画像システムの2つの主要な部分が含まれています。このアッセイは、入る前、遭遇中、および光スポットを離れた後の幼虫の行動を追跡することを可能にする。減速、一時停止、ヘッドキャスティング、旋回などの幼虫の動きの詳細は、この方法を使用してキャプチャし、分析することができます。

概要

ショウジョウバエメラノガスターの幼虫は、飼育段階で明らかな光回避行動を示す。ショウジョウバエ幼虫フォトタキシスは、特に過去50年間に調査中です^1,2, 3^,4,5,^{6,7 、8}.近年では、1)幼虫光回避を媒知る多くのニューロンが同定されているにもかかわらず、4、5、9、10、11、12そして2)シナプスの分解能における幼虫視覚系の完全な接続が確立^{されている13、}幼虫光タキスの根底にある神経機構は大部分不明のままである。

幼虫フォトタキシスの研究に多くの行動アッセイが使用されています。これらは、空間光グラデーションを含むクラスと、時間的な光グラデーションを含むクラスの 2 つのクラスに大きく分けることができます。空間光グラデーションアッセイの場合、アリーナは光と暗のセクションの数に等しく分割されます。アリーナは、光と暗い^半分2、4または光と暗い象^限14、15に分割することができ、あるいはチェッカー^ボード7のような代替光と暗い正方形に分離することができます。通常、寒天プレートは空間光勾配アッセイに使用されますが、代替光と暗いセクションに分割されたチューブ^{は、10、14}も使用できます。

アッセイの古いバージョンでは、光の照明は一般的に幼虫の下から起因する。しかし、新しいバージョンのイルミネーションは、幼虫の目(例えば、低または中光^強度16に敏感なボルウィッグの器官)が向かって開口部を持つ不透明なセファロファリンゲール骨格に含まれているので、主に上から起因する。上の前部。これにより、幼虫は後ろの方向7よりも上の正面方向からの光に敏感^{になります。}時間的な光のグラデーションアッセイでは、光の強度はアリーナで空間的に均一ですが、強度は時間の経過とともに変化します。時間的な正方形波の光(すなわち、点滅するオン/オフまたは強い/弱い^光3、7)に加えて、強度の線形ランプに適合する時間的に変化する光は、幼虫の感度を^{測定するために8}も使用される一時的に変化する光刺激。

フォトタキシスアッセイの3番目のタイプは、45°7の角度で上から照明を伴う指向性光スケープナビゲーションです。Kane et al.⁷の研究の前に、明暗領域における幼虫の数、回転頻度、および軌跡の長さなどの粗いパラメータのみが幼虫フォトタキシスアッセイで計算された。この同じグループの仕事以来、幼虫フォトタキシスのための高時間分解能ビデオ記録の分析と、フォトタキシス中の幼虫運動の詳細なダイナミクス(すなわち、幼虫体の異なる部分のインスタント速度、方向方向、旋回角度)と対応する角速度)^が7を分析されている。これにより、幼虫フォトタキス行動の詳細が発見された。これらのアッセイでは、幼虫はグループ効果が排除されないようにグループで試験されます。

このプロトコルは、個々の光刺激に対する幼虫行動応答の調査のための光スポットアッセイを導入する。主な実験セットアップは、視覚刺激システムと赤外線光ベースのイメージングシステムで構成されています。視覚刺激システムでは、LED光源は寒天プレート上に円形の2cm直径の光スポットを生成し、そこで幼虫をテストします。光の強度は、LEDドライバを使用して調整することができます。イメージングシステムには、カメラの照明を提供する3つの850 nm赤外線LEDに加えて、幼虫の挙動をキャプチャする赤外線カメラが含まれています。カメラのレンズは850nmのバンドパスフィルタで覆われ、視覚刺激システムからの光がカメラに入るのを防ぎ、赤外線がカメラに入ることを許可します。これにより、撮像に対する視覚刺激の干渉が防止される。このアッセイでは、光の前、中、および入った後を含む期間内の個々の幼虫の速い応答の行動の詳細が記録され、分析される。

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プロトコル

1.ショウジョウバエ幼虫の調製

1. ゆでたトウモロコシミール(73g)、寒天(5.6g)、大豆ミール(10g)、酵母(17.3g)、シロップ(76 mL)、水(1000mL)からなる標準的な培地を調製します。
2. 12時間/12時間の光/暗いサイクルを持つ部屋の標準的な媒体上の25 °Cですべてのハエを上げます。

2. 寒天プレートの調製

1. 1.0%寒天溶液を準備します。バランスのとれた500 mLビーカーで寒天の3gを重量を量り、その後、蒸留水の300 mLを追加します。ホイルペーパーをブレーカの上に置き、水が蒸発するのを防ぎます。ビーカーを電子レンジで熱して沸騰させます。
2. ビーカーを取り出し、ガラス棒でよくかき混ぜ、電子レンジで熱して沸騰させます。液体が完全に透明で流体になるまで繰り返します。
   注:最終的な熱寒天溶液は気泡を含まない必要があります。それ以外の場合は、寒天をプレートに注ぐと、寒天プレートの凹部とへこんだ表面が生じ、その後の幼虫の行動テストに影響を与えます。寒天溶液の濃度は、高すぎたり低すぎたりしてはならない。濃度が高すぎると、寒天板上の光拡散反射が強くなり、光/暗い境界が塗りつぶされます。濃度が低すぎると、幼虫はプレートに痕跡を残します。これらのエラーの両方は、後でプロトコールでビデオ処理を妨げるでしょう。
3. 熱い寒天溶液をペトリ皿(直径15cm)にゆっくりと注ぎ、底部が寒天の層(厚さ約4mm)で均等に覆われ、寒天溶液が固まるまで室温(RT)で冷却します。
4. 寒天プレートは、作りたての時に使用する必要があります。そうでない場合は、表面に水の層を注ぎ、後で使用するために4 °Cで冷蔵庫に保存します。

3. 視覚刺激システムの設定

1. LED光源を選択します:470 nmまたは暖かい白色光でLED青色光を照合します。
   注:光源は、他の波長のLEDライトに置き換えることができます。この実験では、青色光LEDを例に用いる。
2. アルミホイルまたは黒い段ボールの厚い部分をロール(不透明度を確保)は、直径3cmの青色光LEDと同様の直径で長さ12cmのオープンシリンダーを形成します。シリンダーの上端が青色光LEDのフロントエンドをカバーします。中央に小さな丸い穴(直径0.5cm)の黒い段ボールで下端を覆います。これは、光源システムのセットアップを構成する。
3. 準備された光源をクリップで鉄製フレームに固定し、LEDライトがデスクトップに向かって下に投影されていることを確認します。シリンダーを少し傾けて円柱面と垂直面の間の角度は約 10° です (図 1参照)。470 nm の青色 LED ライトを高出力 LED ドライバの「LED1」プラグに接続します。ドライバをオンにし、ドライバの右上隅にあるノブを回してチャンネル470 nmを選択し、[LED]をクリックします。次に、画面に「√」と表示されると、デスクトップに青色のライトスポットが表示されます。
   注:小さな丸い穴に加えて、シリンダーが光を漏らす場合は、漏れ出す部品に黒いテープを使用して、穴だけが光を通過できることを確認することをお勧めします。
4. [OK]をクリックし、ノブを回してライトの強度を調整します。ノブを50mAの高い光強度に回転させます。分光計で光のスペクトルを測定し、記録します。
5. 光源の位置を上下に動かして、ライトスポットの直径を2cmに調整します。コントラスト効果を上めるには、デスクトップが黒にする必要があります。
6. 実験的なニーズに応じて光強度を選択するためにノブを回転させます。標準的なフォトダイオードパワーセンサーを備えたコンパクトなパワーメーターコンソールを使用して、スポット内の最大および最小限の光電力を測定し、記録し、3回測定し、平均値を取ります。
   注: フォトダイオードパワーセンサーを使用して、特定の波長の光の光強度を測定し、熱力センサーを使用して白色光の光強度を測定することをお勧めします。
7. 測定された光の力をセンサーの面積で割ることによって、光スポットの光の強度を計算します。
   注:例えば、ステップ2.6の測定された光力が20 pWで、センサーの面積が0.81 mm²の場合、光強度は24.69 pW/mm²⁽²⁰ pWを0.81mm²で除算)です。

4. イメージングシステムのセットアップ

1. デスクトップ上のライトスポットの上に約10cmのアイアンクリップで高解像度のウェブカメラをクランプします(図1)。
2. カメラレンズのデスクトップ向きを調整します。USB インターフェイスを使用してカメラをコンピュータに接続します。
3. カメラのすぐ下のデスクトップに寒天プレートを置きます。
4. Windows 7を搭載したコンピュータで「Amcap9.22」ソフトウェアを開くと、AMcapのウィンドウにライトスポットが自動的に表示されます。カメラを少し左または右に動かして、ライト スポットが窓の中央付近にあることを確認します。カメラがライト パスをブロックしていないことを確認します。ライト スポットは完全で丸い必要があります。
   注:ソフトウェアはhttp://amcap.en.softonic.com/で見つけることができます。
5. 850 nm ± 3 nm バンドパス フィルタを、カメラのすぐ下の 5 ~ 7 mm のクリップで固定します。
   注:フィルターの直径は約2.5cmで、カメラレンズの直径は1cm未満なので、フィルターはカメラの視野をカバーすることができます。カメラの下のフィルタでは、AMcapのウィンドウにライトスポットが表示されるべきではありません。
6. 寒天プレートの周囲に3つの赤外線発光LED(中央波長= 850 nm)を均等に配置します。各LEDは寒天板の端から約5cm離れている必要があり、LEDのレンズ面は寒天板に向かって70°下向きの角度でなければなりません。AC-DCコンバータを介してLEDを電源に接続します。
   注:様々な実験試験でフィールドの明るさの一貫性を確保し、後でビデオ処理を容易にするために、赤外線LEDの位置と角度を修正することをお任せください。
7. コンピュータとデバイスの間に黒板を置きます。コンピュータの画面ライトが実験に影響を与えないように、コンピュータの画面の明るさを設定します。
   注:光の波長や強度を測定する場合は、環境を暗くしてください。

5. イメージングのパラメータの設定

1. AMcap ソフトウェアのメニューで、[オプション]を選択します|ビデオデバイス|キャプチャ形式を設定し、キャプチャしたビデオのピクセル サイズを 800 x 600 に設定し、フレーム レートを 60 fps に設定します。
2. カメラの下からフィルタを取り外し、カメラの下に定規を置き、カメラのフォーカスを調整して、スケールラインをビデオフィールドの幅に平行にします。
3. [キャプチャ]をクリックします |セットアップ|ビデオキャプチャは、保存パスを選択し、[録画を開始]をクリックし、600ピクセルに対応する実際の距離を記録し、実際の距離に対する各ピクセルの比率を計算します。

6. 光回避行動のビデオ録画

1. すべての実験を通して25.5 °Cの温度を維持する。必要に応じて、エアコンで室温を制御します。加湿器で湿度を常に60%に保ちます。
2. 「ライトエリア1」という名前のライトスポット位置の短いビデオを撮ります。次に、850 nm ± 3 nm フィルターを戻してカメラレンズを覆います。
   注:幼虫の動作を記録する場合、カメラレンズは850 nm ±3 nm フィルターで覆われ、ライト スポットがビデオに表示されません。ライトスポットは、後でMatlabで幼虫とビデオで再構築することができます。カメラの位置を変更せず、ステップ 4.3 で測定した実際の距離に対する各ピクセルの比率を変更しないでください。
3. 実験装置から遠く離れた場所にあるライト(ルームライト)をオンにします。幼虫が目ではっきりと見える限り、できるだけ低く光を下げてください。幼虫をスプーンで培養剤から取り出し、第三の幼虫をそっと摘み取り、蒸留水できれいに洗います。空腹からの干渉を避けるために、幼虫を一度に1つずつ洗うように注意してください。1回の実験で少なくとも20頭の幼虫が必要です。
4. 手順 3.3 の間にカメラの下に置かれた寒天プレートの中心に幼虫を移します。ブラシで幼虫から余分な水をそっと取り除くか、ブロッティングペーパーを使用して幼虫から水を取り除き、レンズの下の光の反射を防ぎます。部屋の明かりを消し、幼虫が暗い環境で2分間順応できるようにします。
5. LEDライトをオンにして赤外線を発生させ、幼虫をプレートの中心にそっと磨きます。幼虫がまっすぐクロールし始めると、プレートを回転させて、幼虫がライトスポットに向かって頭を作ります。最初からまっすぐクロールするか、ライト スポットにアクセスできない可能性があることを確認します。
6. [キャプチャ]をクリックします |セットアップ|ビデオキャプチャで保存パスを選択し、[録画の開始]をクリックして録画します。幼虫がライト スポットに向かってクロールし、ライト スポットに入り、視野からほぼ外れるまでライト スポットを離れるようにします。[録画を停止]をクリックします。幼虫が近づく前にライトスポットから離れている場合は、[録画を停止]を直接クリックします。
7. フィルタをカメラから離します。「lightarea2」という名前のライトスポットの位置を短いビデオで撮影し、ライトスポット位置が変わらないように「lightarea1」と比較します。明らかな位置の変化が観察された場合は、データを破棄します。

7. データ分析

1. SOS^{17 を}使用して、前述の^17.
   注:headSpeed(幼虫頭部の速度)、テールスピード(幼虫尾翼の速度)、ミッドスピード(骨格線の幼虫中間点の速度)、cmSpeed(幼虫の重心速度)を含むパラメータを使用して、幼虫の移動速度を測定しました。headTheta(ヘッド中間点と中点尾の線間の角度)とヘッドオメガ(headThetaの変化速度)を含むパラメータを使用して、幼虫体の曲げと曲げの角度速度を測定しました。

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結果

プロトコルによると、光スポットアッセイは、12時間/12時間の光/暗いサイクルを持つ部屋の標準的な媒体上で25°Cで上昇した第3の星幼虫の光回避挙動を調査するために使用された。単一のw¹¹¹⁸幼虫を25.5°Cの光点アッセイを用いて試験した。460 nm LEDによって生成された光スポットの平均光強度は0.59 μW/cm²であった。光スポットに出入りする幼虫の全体のプロセスは、SOS?...

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ディスカッション

このプロトコルは、ショウジョウバエ幼虫が光から脱出する能力をテストする光スポットアッセイを提示する。このアッセイは、入る前、遭遇中、および光スポットを離れた後の幼虫の行動を追跡することを可能にする。幼虫の動きの詳細をキャプチャし、分析することができます。ライトスポットアッセイは非常にシンプルで、強力な実法性を有しています。デバイス全体のコスト?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
850 nm ± 3 nm infrared-light-generating LED	Thorlabs, USA	PM100A	Compatible Sensors: Photodiode and Thermal Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 μm Display Refresh Rate: 20 Hz Bandwidtha: DC-100 kHz Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V
AC to DC converter	Thorlabs, USA	S120VC	Aperture Size: Ø9.5 mm Wavelength Range: 200-1100 nm Power Range: 50 nW-50 mW Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) Linearity: ±0.5% Measurement Uncertaintyc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm)
band-pass filter	Thorlabs, USA	DC2100	LED Current Range: 0-2 A LED Current Resolution: 1 mA LED Current Accuracy: ±20 mA LED Forward Voltage: 24 V Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave Modulation: Arbitrary
Collimated LED blue light	ELP, China	USBFHD01M	Max. Resolution: 1920X1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710
Compact power meter console	Ocean Optics, USA	USB2000+(RAD)	Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Weight: 190 g Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) Wavelength range: 200-850 nm Integration time: 1 ms – 65 seconds (20 seconds typical) Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) Dark noise: 50 RMS counts Grating: 2 (250 – 800 nm) Slit: SLIT-50 Detector collection lens: L2 Order-sorting: OFLV-200-850 Optical resolution: ~2.0 nm FWHM Stray light: <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber
High-Power LED Driver	Minhongshi, China	MHS-48XY	Working voltage: DC12V Central wavelength: 850nm
high-resolution web camera	Thorlabs, USA	MWWHL4	Color: Warm White Correlated Color Temperature: 3000 K Test Current for Typical LED Power: 1000 mA Maximum Current (CW): 1000 mA Bandwidth (FWHM): N/A Electrical Power: 3000 mW Viewing Angle (Full Angle): 120? Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: >50 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupa: RG1 – Low Risk Group
LED Warm White	Mega-9, China	BP850/22K	Ø25.4(+0~-0.1) mm Bandwidth: 22±3nm Peak transmittance:80% Central wavelength: 850nm±3nm
Spectrometer	Noel Danjou	Amcap9.22	AMCap is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most Video-for-Windowsand DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.
Standard photodiode power sensor	Super Dragon, China	YGY-122000	Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Output: DC 12V 2A
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	M470L3-C1	Color: Blue Nominal Wavelengtha: 470 nm Bandwidth (FWHM): 25 nm Maximum Current (CW): 1000 mA Forward Voltage: 3.2 V Electrical Power (Max): 3200 mW Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: 100 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupb: RG2 – Moderate Risk Group
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	S401C	Wavelength range: 190 nm-20 μm Optical power range:10 μW-1 W(3 Wb) Input aperture size: Ø10 mm Active detector area: 10 mm x 10 mm Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) Linearity: ±0.5%