動的光散乱粒子径解析における電圧の応用

要約

ここでは、動的光散乱粒子径測定時に、ポリマー凝集に対する電圧及び温度変化の影響を探ることを目的として、溶液に電圧を印加するプロトコルを提示する。

要約

動的光散乱(DLS)は、ポリマー、タンパク質、その他のナノ粒子および微粒子のサイズ分布を特徴付けるための一般的な方法です。現代の計測では、時間や温度の関数として粒径の測定が可能ですが、現在は印加電圧の存在下でDLS粒子径分布測定を行う簡単な方法はありません。このような測定を行う能力は、センシング、ソフトロボット、エネルギー貯蔵などのアプリケーションに対する電気活性、刺激応答性ポリマーの開発に役立ちます。ここでは、DLSと結合した印加電圧と温度ランプを用いて、電気活性モノマーの有無にかかわらず熱応答性ポリマーにおける凝集および粒子サイズの変化を観察する手法が提示される。これらの実験で観察された凝集動作の変化は、電圧と温度制御の組み合わせによる応用によってのみ可能であった。これらの結果を得るために、ポテンショスタットを溶液に電圧を印加するために修正されたキュベットに接続した。ポリマー粒子径の変化は、定電圧の存在下でDLSを用いてモニタリングした。同時に、現在のデータを生成し、粒子サイズデータと比較して、現在と粒子の挙動の関係を理解した。ポリマーポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)(pNIPAM)は、温度に対するpNIPAMの応答が十分に研究されているように、この技術の試験ポリマーとして役立った。pNIPAMおよびポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)の低臨界溶液温度(LCST)凝集挙挙の変化は、電気化学的に活性なブロックコポリマーであるブロック-ポリ(フェロセニルメチルメタクリレート)、適用電圧の存在下で観察される。このような変化の背後にあるメカニズムを理解することは、印加電圧の存在下で可逆性ポリマー構造を達成しようとする際に重要です。

概要

動的光散乱(DLS)は、溶液¹を通じて散乱する光の強度のランダムな変化を用い、粒子サイズを決定する技術である。DLSは、粒子サイズを決定することによってポリマーの凝集を測定することができる。この実験では、DLSを制御温度変化と組み合わせることで、低臨界溶液温度(LCST)2,3を超えることを示すポリマー凝集体を観察した。LCSTの下には、均質な液相が1つ存在する。LCSTの上に、ポリマーは溶けにくくなり、凝集し、溶液から凝縮する。散乱場全体に印加電圧(電位や電界)を導入し、電界が散乱挙動やLCSTに及ぼす影響を観察しました。粒子サイジング測定における電圧の適用は、センサー、エネルギー貯蔵、薬物送達システム、ソフトロボティクスなどの分野における粒子挙動とその後の応用に関する新たな洞察を可能にします。

このプロトコルでは、2つの例のポリマーが使用された。ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)、またはpNIPAMは、高分子鎖^4、5上に親水性アミド基と疎水性イソプロピル基の両方を含む熱感受性ポリマーである。pNIPAMのような熱応答性ポリマー材料は、近年^3、4において、制御薬物放出、生化学的分離、および化学センサーに広く使用されている。pNIPAMのLCST文献値は30〜35°C4の程度である。pNIPAMは、典型的には電気化学的に活性ではない。そこで、第2の試料ポリマーとして、電気化学的に活性なブロックをポリマーに添加した。具体的には、フェロセニルメチルメタクリル酸エステルを用いて、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)-ブロック-ポリ(フェロセニルメチルメタクリレート)ブロックコポリマー、またはp(NIPAM-b-FMMA)6,7を作成した。いずれの例のポリマーも、制御された鎖長^8、9、10で連鎖移動重合を可逆的付加的に付加して合成した。非電気化学的活性ポリマーを、pNIPAM、純粋なpNIPAM100マーとして合成した。電気化学的に活性なポリマーp(NIPAM-b-FMMA)も100のメル鎖長で、4%のフェロセニルメチルメタクリル酸エステル(FMMA)および96%NIPAMを含む。

本稿では、高分子凝集に対する印加電圧の影響を調べるためのプロトコルと方法論を示す。この方法は、タンパク質の折り畳み/展開、タンパク質とタンパク質の相互作用、静電荷電粒子の凝集の分析など、DLSの他の用途にも拡張することができます。試料を20°Cから40°Cまで加熱し、1Vの適用フィールドの存在がないLCSTを同定した。次いで、試料を40°Cから20°Cまで冷却し、適用フィールドを破壊することなく、任意のヒステリティックまたは平衡効果を研究した。

プロトコル

1. ポリマー製剤の例

1. pNIPAMポリマー合成
   注:この準備は1g/L溶液の10 mLを生成し、3-4の実験のために十分です。
   1. シュレンク線装置を準備します。冷たいトラップデュワーフラスコがドライアイスとアセトンのスラリーで満たされていることを確認するか、機械式冷凍トラップを使用する場合は、トラップが適切な温度に達していることを確認してください。
   2. 50 mLの丸底フラスコで、 0.566 g N-イソプロピルアクリルアミド(NIPAM)モノマー、0.016gの可逆付加断片化連鎖移動重合(RAFT)剤(フタルミドメチルブチルトリチオカーボネート)、0.0008g2,2-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)(AIBN)、10mL(AIBN)を加える。フラスコにかき棒を入れます。フラスコをゴム中隔で密封し、ビニールテープで包み、モノマーを1,4-ジオキサンに溶解させます。
   3. フリーズポンプ解脱ガスを次のように行う:ドライアイスとメタノールのスラリーを含むデュワーフラスコに丸底フラスコを浸して溶液を凍結する。すべての材料が凍結されたら、シュレンクラインの真空マニホールドを使用してフラスコを100kPa以下の内圧に避難させます。フラスコを分離し、温水を使用して静電気の下で解凍します。シュレンクラインの窒素マニホールドを使用してフラスコを大気圧に戻します。
   4. ステップ1.1.3を3回繰り返して、内部酸素濃度を最小限に抑えます。
   5. 窒素で溶液をスパージし、大気への圧力のバランスをとります。オイルバスを使用して混合物を85°Cに加熱し、36時間200rpmで攪拌する。
   6. 50 mL ビーカーに、40 mL のヘキサンを加えます。次に、ポリマー混合物をヘキサン滴下に加える。pNIPAMは白い凝集剤として沈殿する必要があります。
      注:NIPAMモノマーはヘキサンに可溶性であるが、pNIPAMはヘキサンの溶解性が悪い。
   7. 白いpNIPAM粉末を収集するために、ブヒナー漏斗に曇った混合物を注ぎます。粉末を20mLバイアルに移し、一晩真空オーブンに入れて残った溶媒を取り除きます。必要になるまで室温で密閉容器に保管してください。
2. pNIPAM-ブロック-ポリ(メタクリル酸フェロセニルメチル)ブロックコポリマー(p(NIPAM-b-FMMA))合成
   注:この準備は1g/L溶液の10 mLを生成し、3-4の実験のために十分です。
   1. シュレンク線装置を準備します。冷たいトラップデュワーフラスコがドライアイスとアセトンのスラリーで満たされていることを確認するか、機械式冷凍トラップを使用する場合は、トラップが適切な温度に達していることを確認してください。
   2. 50 mLの丸底フラスコに、フェロセニルメチルメタクリレート(FMMA)モノマー0.057g、RAFT剤0.016g、AIBN0.0008g、1,4-ジオキサン10mLを加えた。フラスコにかき棒を入れます。フラスコをゴム中隔で密封し、ビニールテープで包み、モノマーを1,4-ジオキサンに溶解させます。
   3. フリーズポンプ解脱ガスを次のように行う:ドライアイスとメタノールのスラリーを含むデュワーフラスコに丸底フラスコを浸して溶液を凍結する。すべての材料が凍結されたら、シュレンクラインの真空マニホールドを使用してフラスコを100kPa以下の内圧に避難させます。フラスコを分離し、温水を使用して静電気の下で解凍します。シュレンクラインの窒素マニホールドを使用してフラスコを大気圧に戻します。
   4. ステップ1.2.3を3回繰り返して、内部酸素濃度を最小限に抑えます。
   5. 窒素で溶液をスパージし、大気への圧力のバランスをとります。オイルバスを使用して混合物を85°Cに加熱し、10時間かき混ぜます。
   6. NIPAM0.543g、AIBN0.0002gを1,4-ジオキサンの3mLに溶解します。溶液を窒素の下に加え、30分間スパージします。オイルバスを使用して混合物を85°Cに加熱し、さらに36時間200rpmでかき混ぜます。
   7. 50 mL ビーカーに 40 mL のヘキサンを加えます。次に、ポリマー混合物をヘキサン滴下に加える。FMMAモノマーは濃い黄色なので、p(NIPAM-b-FMMA)は褐色粉末として析出する必要があります。
      注:ニパムとFMMAモノマーはヘキサンに可溶性がありますが、p(NIPAM-b-FMMA)はヘキサンの溶解性が低いです。
   8. 黄色の曇った混合物をブヒナー漏斗に注ぎ、茶色のp(NIPAM-b -FMMA)粉末を集めます。粉末を20mLバイアルに移し、一晩真空オーブンに入れて残った溶剤を取り除きます。必要になるまで室温で密閉容器に保管してください。

2. DLS サンプルおよびキュベット調製

メモ:このセクションでは、適用電圧用のキュベットとDLS測定用サンプルを用意します。

1. 10 mgのポリマー粉末を測定し、濾過した脱イオン(DI)水の10 mLに溶解します。その混合物を冷蔵庫に一晩入れます。実験を開始する準備ができたら、サンプルを氷の上に置いてください。
   注:これらの実験で使用されたポリマー濃度は1g/Lでしたが、各サンプルの濃度の最適範囲は一意になります。また、テストの準備ができるまで、LCST の下にポリマーを保持することをお勧めします。
2. 6.3 mm x 7 cm の片面銅テープを 2 枚カットします (図 1)。ピンセットを使用して、各部分をDLSサンプルキュベットの内側の反対側に貼り付け、ライトパスに垂直にします。テープの底部は、キュベットの底近くに達する必要があります。銅テープの端をキュベットの上に折ります。サンプルキュベットの上部に銅テープが近く、または巻かれていることを確認し、良好な電気接触を確認します。また、銅テープがゼータ電位測定に使用されるDLS装置に関連付けられている金属接点と接続していないことを確認してください。
3. DI水でキュベットを3回洗い、余分な水をキムワイプで取り除きます。

3. DLS インストゥルメントコントロールとセットアップ

注: 各 DLS 実験を実行する前に、(1) 空水ソリューションの 3 つのコントロールを完了することをお勧めします。(2) サイズ標準;(3)温度ランプまたは印加電圧の開始前のポリマーの測定。サンプルの準備、設定の選択、サンプルとデータの品質の評価については、操作前に機器のマニュアルを参照してください。

1. 1.5 mLの濾過した溶媒をキュベットに移します。DI水を使用してください。
2. キュベットホルダーにキュベットを挿入し、キュベット上部の小さな矢印がキュベットホルダーと揃っていることを確認します。蓋を閉じます。
3. Zetasizer ソフトウェアで、ツールバーの[計測]を選択します。手動測定は、コントロールに設定されました。温度を実験の開始点に設定します。この実験では、20 °Cを選択します。
4. ウィンドウの下部にあるテキストに「セルを挿入して、準備ができたら開始」を押すと、画面の上部にある緑色の三角形の開始ボタンが表示されます。これは実験を開始し、キュベットホルダーはこの後開くべきではありません。
5. リアルタイムの結果を確認するには、マルチビュータブをクリックします。カウント率と相関関数を観察することにより、サンプルとデータ品質を継続的に監視します。このサンプルは単なる溶媒であるため、粒子の存在に対応する明確なシグナルは観察されるべきではありません。
6. キュベットに標準溶液を2滴加えるか、水制御を使用して、ステップ3.2-3.6を繰り返します。この実験では、20 nm NIST トレース可能なポリスチレンサイズ標準を使用します。
   注: 水または標準の解析コントロールの実行で、予想される結果と矛盾するデータが表示される場合は、エラーのトラブルシューティングを行い、コントロールが期待どおりに読み取られるまで繰り返します。
7. キュベットをすすいで、フィルター処理されたポリマー/テスト溶液を加えます。手順 3.2~ 3.5 を繰り返します。初期試験溶液の明確な測定を観察する必要があります。ベースライン測定では、温度ランプまたは電圧を適用する前にこれを行うことをお勧めします。

4. DLS SOP のセットアップ

注:このセクションは、特に、マルバーン・ゼータサイザーのNanoZS DLS機器の温度ランプ動作を指します。実験を開始する前に、セルの選択、サンプルの準備、測定設定の選択、サンプルとデータの品質の評価に関するガイダンスについては、装置マニュアルを広範囲に参照することをお勧めします。

1. Zetasizerソフトウェア(バージョン7.11)で[ファイル]を選択し、[新規]をクリックして新しいSOPを設定します(図2)。
2. [計測タイプ] をクリックして、[トレンド] > [温度] > [サイズ] を選択します。
3. [材料] で、適切な材料と屈折率を選択します。この実験では、タンパク質と1.450の屈折率(RI)を選択します。体積分布のより正確な計算のために屈折率の正確な値が望ましい場合、実験者は、それらのサンプルの屈折率を実験的に決定する必要があります。
4. 分散剤で、適切な溶媒を選択します。この実験では、溶媒として水を選択します。
5. [セル] で、使用するキュベットを選択します。この実験では、使い捨て可能なキュベット (DTS0012) を使用します。
6. [シーケンス] で、[開始温度] と[終了温度] を設定します。加熱実験の場合は、開始温度を20°Cに設定し、終了温度を40°Cに設定します。冷却実験では、反対を選択します。[開始温度に戻る] チェックボックスをオフにします。
7. 温度の変化ごとに間隔を選択します。これらの実験では、1.5 °Cを選択します。
8. [サイズの測定] で、[均衡時間] を設定します。これらの実験では、測定回数を 120 s に設定します。測定時間としては、3つの測定と自動を選択します。
9. SOP を保存し、ファイルを閉じます。
10. 印加電圧を使用する場合は、ポテンショスタ(第5項)を設定してから続行してください。
11. ポテンショスタットを設定したら、または電圧を適用していない場合は、Zetasizerソフトウェアに戻り、ツールバーの[測定]をクリックしてから、[SOPの開始]をクリックします。
12. SOPウィンドウの下部にあるテキストに「セルを挿入して、準備ができたら開始」を押すと、画面の上部にある緑色の三角形の開始ボタンを押します。これは実験を開始し、キュベットホルダーはこの後開くべきではありません。
13. リアルタイムの結果を確認するには、マルチビュータブをクリックします。カウント率と相関関数を観察することにより、サンプルとデータ品質を継続的に監視します。代表的な実験結果については、図3-5を参照してください。

5. ポテンショスタットのセットアップ

注:同じコンピュータを使用して、粒子サイズと電圧操作を行い、データをタイムシンクし、後で評価しやすくすることをお勧めします。配線の設定、ソフトウェアの相談、適切なパラメータの選択に関するご案内については、電圧計器のマニュアルをご参照ください。これらの実験ではガムリーポテンショスタットを使用した。

1. DLSキュベットホルダー領域の右上端にある小さな隙間に収まるほど細い2本のワイヤを準備します(図6)。準備されたワイヤーの一方の端で、ポテンショスタットへの接続を可能にするために絶縁体を取り除く。反対側の端には、ワイヤに短いワニのクランプをはんだ付けし、キュベットに接続します。DLSサンプルの蓋が閉まっていることを確認します。
2. 白い参照ポテンショスタットリードと赤いカウンターポテンショスタットリードを準備されたワイヤの1つにクランプします。緑の働くポテンショスタットの鉛をクランプし、青い働く感覚ポテンショスタットは他の準備されたワイヤーに導く。この実験では、オレンジ色のカウンターセンスと黒地ポテンショスタットリードを使用せず、浮いたままにしておきます。回路が短くないことを保証するために、これらのワイヤは他の鉛や導電性の表面に触れるべきではありません。
   注:各リードがどちらの側に接続されているかは関係ありません。
3. ソフトウェア ツールバーで、[実験] をクリックし、[オプションE 物理電気化学] をクリックして、[クロノアンペロメトリー] を選択します。このプロトコルの目的のために、単一の電圧を加えて、時間の経過とともに電流応答を測定(すなわち、クロノアンペロメトリー)を使用します。特定の電気化学的方法論に関係なく、時間をかけてシステム応答を監視することが推奨されます。
   1. 事前ステップ、ステップ1、およびステップ 2 の電圧とリファレンスを設定します。これは、フィールド/キュベット全体に適用される電圧になります。3 つのステップすべてについて、電圧を 1 V 対 リファレンスに設定します。
   2. [事前ステップ遅延時間] を設定します。これらの実験では、信号を記録する前に、システムが所望の電圧で安定していることを確認するために0.5sに設定します。
   3. ステップ 1時間とステップ 2時間の両方の時間を設定します。電圧の適用時間を制御します。DLS実験を通して印加電圧が継続することを確認するために、両方を14,400 sに設定します。
   4. サンプル期間を設定するこれは、グラフが電流値と電圧値を読み取り、記録する頻度です。この実験では 10.0 s を使用します。
      注: 他の設定は、ここで示すデータに対して重要ではありません。システムのデフォルト値が使用されました。
4. [OK] をクリックします。上部ツールバーには、電圧が適用されていることを示すアクティブ記号が表示されます。電流は中程度の応答(μA)を与え、ポテンショスタットを過負荷にしてはならない。信号または過剰な信号が観測されない場合、システムが正しく接続されていない可能性があるため、エラーのトラブルシューティングを行い、予想される電流が観測されるまで繰り返します。
5. ステップ 4.10 に戻って、DLS SOP を開始します。

6. データ分析

注: このセクションでは、取得したデータを理解するための予備的な分析について詳しい説明します。

1. データを好みのデータ分析およびグラフ作成ソフトウェアにインポートします。
2. 特定の温度での一連の測定内で実行される各回について、最大体積パーセントでピークの粒子体積サイズを決定します。
3. 指定した温度で記録された 3 つの測定値に対する体積サイズの平均と標準偏差を計算します。
4. 各実験について、平均サイズ ±標準偏差をy軸(対数目盛)とx軸の温度(線形スケール)でプロットします。
5. 分析用の Gamry の現在のデータをインポートします。現在のデータを時間を x 軸に、電流を y 軸に(マイクロアンプで)プロットします。
6. 現在のデータを粒子サイズデータに関連付けるには、ZetasizerデータのタイムスタンプをGamryの現在のタイムスタンプと比較します。これは、2 種類のデータが同じコンピュータから収集された場合に可能です。それ以外の場合は、記録された時間を可能な限り一致させます。

結果

図 3に示すように、温度ランプ内の各実行のリアルタイム ファイル出力は、表として示されます。各レコードは、ボリュームサイズ (図 4)と相関係数 (図5)を表示するために個別に選択できます。体積粒度分布(PSD)は、分布全体とLCSTを解釈する最も正確なデータですが、データの品質は相関グラフ(

ディスカッション

pNIPAMまたはp(NIPAM-b-FMMA)溶液に電圧を印加すると、温度に応じてポリマー凝集挙が変化しました。両方の材料で、印加電圧が存在する場合、溶液がLCST以下で冷却されてもポリマーの体積サイズは高いままでした。これは、電圧のない試験でポリマーが元のサイズに戻ることを示したため、予想外の結果でした。これらの実験により、温度範囲に対して、加えられる電圧では、pNIPAMに追加...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
N-Isopropylacrylamide	Tokyo Chemical Industry CO., LTD	I0401-500G
1,4-Dioxane	Alfa Aesar	39118
2,2"-Azobis(2-methylpropionitrile)	SIGMA-ALDRICH	441090-100G
Cuvette	Malvern	DTS0012
Dynamic Light Scattering	Malvern	Zetasizer NanoZS
Ferrocenylmethyl methacrylate	ASTATECH	FD13136-1G
Phthalimidomethyl butyl trithiocarbonate	SIGMA-ALDRICH	777072-1G
Potentiostat	Gamry	Reference 600