高分解能共焦点顕微鏡による3D腫瘍スフェロイド侵入に対する移動性阻害剤の効果の特徴

要約

ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤を用いた三次元(3D)侵入アッセイにおけるグリオーマ癌細胞移動に対する移行抑制剤の効果は、高分解能共焦点顕微鏡によって特徴付けられる。

要約

がん研究における創薬と開発は、3D形式の薬剤スクリーンに基づいてますます進んでいます。がん細胞の移動性および侵襲性を標的とする新規阻害剤、ひるま症などの高侵襲性癌における補完的な治療法として発見され、考えられている。したがって、薬剤の添加後の3D環境における細胞の詳細な分析を可能にするデータの生成が必要となる。ここで説明する方法論は、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)による高解像度画像キャプチャーとデータ解析とスフェロイド侵入アッセイを組み合わせることで、潜在的な抗渡走阻害剤の効果の詳細な特徴付けを可能にした。グリオーマ細胞上のMI-192.スフェロイドは、低付着性96ウェルプレートの侵入アッセイ用の細胞株から生成され、CLSM分析のために調製された。記載されたワークフローは、容易さと再現性の両方に起因する他の一般的に使用されるスフェロイド生成技術よりも好まれていました。これは、従来の広視野アプローチと比較して共焦点顕微鏡によって達成される高められた画像分解能と組み合わせることで、次の3D環境における移動細胞における明確な形態変化の同定と分析を可能にした。移動性薬物MI-192による治療。

概要

前臨床創薬と潜在的な癌薬の開発のための3次元スフェロイド技術は、従来の薬剤スクリーンよりもますます支持されています。したがって、移動性、すなわち移動と侵入防止—薬物の開発が増えている。がん治療におけるこれらの発展の背後にある根拠は明らかである:3Dスフェロイドアッセイは、細胞単層培養よりも忠実に3D腫瘍アーキテクチャを模倣する潜在的な抗癌剤をスクリーニングするためのより現実的なアプローチを表し、薬物と腫瘍の相互作用(動態)をより正確に要約し、腫瘍関連の設定における薬物活性の特徴付けを可能にする。さらに、がん細胞が遠方の腫瘍部位に移行する能力によって増強された転移による多くの癌タイプにおける化学毒性薬に対する耐性の上昇と癌患者の死亡率の高さは、化学療法剤の包含を支持する。将来の臨床癌試験におけるアジュバント治療としての癌細胞の渡り目の可能性を標的^{とする 1.}これは特に、高品位神経膠芽腫(GBM)のような高侵襲性癌の場合に当てはまる。GBM管理には、手術、放射線療法、化学療法が含まれます。しかし、併用治療を行っても、ほとんどの患者は11〜15ヶ^月2、3の中央値生存期間を有する初期診断の1年以内に再発する。3D技術の分野における大きな進歩は、ここ数年で行われてきました:腐敗システム、微細加工構造、3D足場、およびその他の個々のアッセイは、大規模^な4で定期的なテストを可能にするために継続的に改善されています。 ^5,6,7.しかし、これらのアッセイから得られた結果は、2D画像解析システムを用いて3D生成データを解析する試みによってデータ解釈が妨げられることが多いため、有意義な方法で分析する必要があります。

画像取得速度と光毒性の低減の面で好ましいにもかかわらず、ほとんどの広視野システムは^解像度8によって制限されたままです。したがって、薬物有効性に関するデータ読み出しとは別に、広視野システムを用いて画像化すれば、移動細胞の3D細胞構造に対する薬物作用の詳細な影響は必然的に失われる。逆に、共焦点レーザースキャニング顕微鏡(CLSM)は、コンピュータソフトウェアを使用して3D取得後に再構築およびレンダリングすることができる高品質の光学的に切り分けた画像をキャプチャします。したがって、CLSMは複雑な3D細胞構造のイメージングに容易に適用可能であり、それによって3D構造に対する抗移動性阻害剤の影響の調査および細胞移動機構の詳細な分析を可能にする。これは間違いなく将来の移住薬開発を導くでしょう。ここで、スフェロイド生成、薬物処理、染色プロトコル、および高解像度共焦点顕微鏡による特性評価の組み合わせワークフローについて説明する。

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プロトコル

1. 細胞スフェロイドの生成

1日目

1. 調査中の細胞株で必要に応じて標準培養培地を調用意する。
2. 無菌処理技術を用いて組織培養フード内のすべての組織培養関連ステップを行う。
3. がん細胞をトリプシン化し、カウントします。プレートあたり20mLのセルサスペンションを使用します。細胞懸濁液は、明確にラベル付きの滅菌ユニバーサルチューブに保管してください。
4. 各ウェルに所定の数のセルを追加します。必要な細胞の初期数と最終的なスフェロイドサイズの両方が、調査対象の細胞株の増殖速度に依存する。
   注:U251およびKNS42^9、10、5x 10³細胞/mLのような確立された神経膠腫細胞株のために、インキュベーションの4日後に顕微鏡的に見える球体(200または800 μm)を作り出す。
5. 細胞の束を避けるために穏やかな反転によって普遍的な管の細胞を再中断する。細胞懸濁液のピペット200μLを96ウェルプレートの各ウェルに入れた。すべての井戸が必要ない場合は、蒸発を避けるために、各空の井戸に1x PBSの200 μLを追加することをお勧めします。
6. 細胞を通常どおり37°Cでインキュベーターでインキュベートします。
   注:グリオーマ癌細胞株などの細胞株は、24時間以内にスフェロイドを形成し、72時間のスフェロイドをインキュベートすることによって3D細胞構造を形成することを可能にする。

2日目

7. 24時間後の明視野顕微鏡で細胞をチェックする 細胞株によっては、細胞が井戸の底部に検出可能なスフェロイドを形成している可能性がある。
   注:確立されたグリオーマ癌細胞株は24時間以内にスフェロイドを容易に形成し、患者由来のグリオーマ癌細胞株は最大1〜2週間かかることがある。

2. コラーゲン侵入アッセイ

3日目

1. コラーゲン、5倍培養培地、1M NaOH、および氷の上に20mLチューブを1本置きます。
2. 冷たい培養管に冷たいコラーゲンの10.4 mLを慎重かつゆっくりと追加します。気泡を避けてください。このコラーゲンの量は、1つの96ウェルプレートのために十分です。アップスケーリングは可能ですが、プレートごとに20mLチューブを1本ずつ用意することをお勧めします。
3. 冷菌5x培養培地の1.52mLをゆっくりと加えます。気泡を避けてください。
4. 使用直前に、冷間無菌1M NaOHの72μLを静かに加えます。氷の上に溶液を保管してください。
5. ピペッティングで優しく混ぜます。気泡を避けてください。効率的な混合は、媒体の色の変化(赤からオレンジレッド(pH 7.4))につながります。使用するまで氷の上に混合物を残します。
6. 重要なステップ:1日目に調製された96ウェルプレートから190μLの上清を取り除きます。井戸の底に形成されたスフェロイドを邪魔しないように非常に注意してください。ピペットは、井戸の中心ではなく、側面に向かって角度で使用します。
7. 各ウェルにコラーゲンミックスの100 μLをゆっくりと加えます。任意のスフェロイドの乱れを防ぐために、井戸の側面にミックスをピペット。気泡を避けてください。重合を評価するために室温で20 mLチューブに残っているコラーゲンミックスを保ちます。
8. インキュベーター内のプレートを少なくとも10分間インキュベートし、コラーゲンが重合することを可能にする。ガイドラインとして、残りのコラーゲンが設定されている場合、半固体およびスポンジ状になり、スフェロイドは阻害剤で処理する準備ができている。
9. 培養剤に2倍濃度で薬剤または阻害剤を添加する。各ウェルに適当にミディアムを加えます(ウェルあたり100μL)。繰り返しますが、スフェロイドの乱れを避けるために、ウェルの側面に媒体をピペットします。
10. T = 0 h、24 h、48 h、および 72 h の時間に明視野顕微鏡検査によって各スフェロイドを観察し、画像化し、薬物活性を評価します。その後、プレートをインキュベーターに戻します。
    注:細胞株の侵襲的挙動に応じて、元の球状コアからの離れた移動が24時間以降に観察されてもよい。

3. 共焦点顕微鏡のためのコラーゲン埋め込みスフェロイドと渡り細胞の調製

1. プレートを組織培養フードに入れ、上清(200μL)を静かに取り除きます。繰り返しますが、これはコラーゲンプラグを妨げる可能性があるため、スフェロイドを邪魔しないように注意し、コラーゲンに触れないようにしてください。
2. 上清を1x PBSの100 μLに置き換えます。この洗浄工程を3回繰り返します。
3. 最終洗浄を取り除き、1x PBS(ウェルあたり100μL)で4%ホルムアルデヒドに置き換えます。
   注意:ホルムアルデヒドは発がんの可能性があります。健康と安全に関するガイドラインに従って、注意して取り扱ってください。
4. 96ウェルプレートをラボベンチに置き、ホイルで覆い、室温で24時間放置します。
5. 慎重にホルムアルデヒドを取り除き、1x PBSに置き換えます。この1x PBS洗浄3xを繰り返します。
6. 1x PBSで0.1%トリトンX-100を準備します。1x PBS洗浄を取り外し、トリトンX-100溶液の100 μLに置き換えます。室温で30分間インキュベートします。その間、1x PBSと0.05%の脱脂粉乳でブロッキング溶液を準備し、完全に混ぜます。
7. トリトンX-100を取り外し、1x PBSで3倍を洗います。各ウェルに100μLのブロッキング溶液を加え、15分間インキュベートします。
8. 所定の濃度でブロッキングバッファーに必要な一次抗体を希釈する。ここで、抗マウスIgGアセチル化チューブリン抗体(1:100)を用いる。
9. 15,682 x gで5分間の一次抗体遮断バッファーミックスを遠心分離する。ブロッキング溶液を慎重に取り外し、各ウェルに上清(25−50 μL)を加えます。室温で1時間暗くインキュベートする。
10. 抗体溶液を取り出し、1x PBS(ウェル当たり100μL)で3xを洗浄します。
11. 任意の追加の蛍光汚れに加えて、推奨または所定の濃度でブロッキングバッファー内の二次抗体を希釈する。ここでは、1:500抗マウスフルオロフォア-488共役抗体、ファロイジン-594(1:500)をアクチン染色、およびDNA染色(DAPI)に用いる。
12. 繰り返しになりますが、13,000rpmで5分間二次抗体溶液を遠心分離します。
13. 各ウェルからブロッキング溶液を取り出し、二次抗体/ファロイジン/DAPIミックスの25~50μLを添加します。室温で1.5時間暗闇の中でインキュベートします。
14. 二次抗体染料溶液を取り出し、1x PBS(ウェル当たり100μL)で3倍を洗浄します。
15. プラスチックピペット(200μL)を使用して、高品質のプレーンガラススライドの中心に吸引して個々のコラーゲンプラグを慎重に持ち上げます。
16. コラーゲンプラグに適切なマウントを1滴加え、プラグが完全に覆われていることを確認します。気泡を避けてください。
17. イメージングに使用され、一晩設定できるようにする顕微鏡目的のための最適な厚さのカバースリップを適用します。暗い所温でスライドを保管してください。

4. 蛍光顕微鏡

1. 適切な共焦点顕微鏡を使用して蛍光画像をキャプチャします。

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結果

3次元スフェロイド技術は、がん特異的な環境をより代表的に表しているため、薬物腫瘍相互作用の理解を進めています。スフェロイドの生成は、いくつかの方法で達成することができます。このプロトコルでは、低付着96ウェルプレートが使用されました。異なるメーカーからいくつかの製品をテストした後、彼らは一貫して成功したスフェロイドの生産と均一性の?...

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ディスカッション

高解像度共焦点顕微鏡を用いて移動性薬物活性を同定するための癌細胞スフェロイドを作成する新しい方法が記載されている。ぶら下げ^滴15などの他の技術に対する低付着板の使用は、コラーゲン移行および侵入アッセイで使用するための再現性と均一なスフェロイドを生成する手段を容易にした。このプロトコルの重要なポイントは、コラーゲンマトリックスに埋め込ま?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagen I, rat tail, 100 mg	Corning	354236	for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 (e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4 °C, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen.
Coverslips	various	various	for microscopy imaging
DMEM powder	Sigma	D5648	needed at 5x concentration for collagen solution for glioma invasion assay;  this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5x solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 μm) before use.
Foetal calf serum	Sigma	F7524-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines
Glass slides	various	various	for microscopy imaging
High glucose DMEM	Gibco	41965062	needed for cell culture of glioma cell lines
Inhibitor	Tocris	various	various - according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results.
Mountant	various	various	for microscopic imaging
NaOH (1 M)	various	various	NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation.
Paraformaldehyde	various	various	for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay
Pastettes (graduated pipette, 3 mL)	various	various	for invasion assay, solution removal
PBS, sterile for tissue culture	Sigma	D1408-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining
Pen/strep (antibiotics)	Sigma	P4333	needed for cell culture of glioma cell lines
Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin	various	various	there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500.
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration
Sodium pyruvate	Sigma	P5280	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration
Trypsin	Sigma	T4049	for trypsinisation
Ultra low attachment plates	Sigma/Nunc	CLS7007-24EA	for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids
Stripettes (serological pipettes, sterile, 5 mL and 10 mL)	various e.g. Costar	CLS4488-50; CLS4487-50	for tissue culture and collagen preparation
Various multichannel (50 - 250 μL) and single channel pipettes (10 μL, 50 μL, 200 μL 1 mL)	various	various	for cell and spheroid handling
Widefield microscopy	various	various	for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific)
Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective	Zeiss	quote from manufacturer	Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop.