ショウジョウバエメラメラノガスターにおける学習誘発シナプス可塑性の生体内光学カルシウムイメージング

要約

ここでは、ショウジョウバエの学習と記憶の文脈で、前および/または後のカルシウムを視覚化できるプロトコルを提示する。シナプス的に局在するカルシウムセンサを用いた生体内カルシウムイメージングでは、この種の連想学習の根底にあるシナプス可塑性が決定され得るように、古典的な嗅覚調節パラダイムと組み合わされる。

要約

多くのモデル生物の研究の数十年は、学習と記憶形成の基礎となるシナプス可塑性の現在の概念につながっています。シナプス伝達の学習誘発変化は、多くのニューロンと脳内の処理のレベルに分散されることが多い.そのため、ニューロン間で学習依存性シナプス可塑性を可視化する方法が必要である。フルーツフライショウジョウバエメラノガスターは、学習の基礎となる神経回路を研究するために特に有利なモデル生物を表す。ここで提示されるプロトコルは、連想嗅覚記憶の形成の基礎となるプロセス、すなわちシナプス活性とその変化を生体内で監視する方法を示す。ショウジョウバエで利用可能な幅広い遺伝的ツールを使用して、決定された細胞集団および単一細胞において遺伝的にコードされたカルシウム指標を特異的に発現することが可能である。ハエを所定の位置に固定し、ヘッドカプセルを開くことで、嗅覚刺激を送りながらこれらの細胞のカルシウムダイナミクスを可視化することが可能です。また、ハエを同時に身体に感電させるセットアップを実演します。これは、ハエが古典的な嗅覚調節を受けることができるシステムを提供します - それによって、以前にナイーブな臭いが電気ショック罰に関連付けられていることを学ぶ - この臭いの表現と同時に(および他の訓練されていない臭い)は、2光子顕微鏡を介して脳内で観察される。私たちの研究室は以前に、蛍光カルシウム信号を前または後のコンパートメントに閉じ込めるシナプス的に局在するカルシウムセンサーの生成を報告しました。2光子顕微鏡は、微細な構造を空間的に解決する方法を提供します。我々は、昆虫脳の高次中心であるキノコ体からの情報を統合するニューロンに焦点を当てることによって、これを例示する。全体として、このプロトコルは、嗅覚学習の結果として活動が調節されるニューロン間のシナプス接続を調べる方法を提供する。

概要

学習を通じて脳内で情報を取得し、その後メモリとして保存する場所と方法を解読することは、神経^科学1の中で最も困難なタスクの1つです。神経科学的研究は、学習と記憶^形成2、3の根底にあるニューロン基板としてのシナプス伝達の変化の概念につながっています。学習中に、刺激の知覚中に活動するニューロンアンサンブル間のシナプス接続が、記憶リコール中にそれらの結合された活動パターンを取り出すことができるよう変更され、それによって指示されるのが仮説である。将来の行動行動⁴.これらの「エングラム細胞」とそのシナプスは、多くの場合、脳領域と処理のレベルに分散され、タスクまたは刺激の学習にシナプス伝達の観察された変化を割り当てることが困難になります。特定の学習タスクに因果的にリンクされているシナプスの変更をローカライズして視覚化するには、それらのシナプスを正確に限定できる適切なモデル システムが必要です。

このような試みのために、ショウジョウバエメラノガスターは、相対的な脳の単純さ、行動の豊かさ、および実験的なアクセシビリティを兼ね備えているため、特に適しています。確立されたモデル生物の中で、ショウジョウバエは、線虫C.エレガンスと神経の複雑さの面でマウスのような遺伝的に扱いやすい哺乳類の間に位置しています。C.エレガンスでは、ニューロンの立体数(〜300)と限られた行動レパートリーが観察される。一方、哺乳類は何百万ものニューロンを持ち、驚異的な行動の複雑さを持っています。フルーツフライの脳は、その〜100,000で、ほとんどの脊椎動物の脳よりも有意に小さいニューロンであり、ニューロンの多くは個別に^{識別可能5}である。しかし、ショウジョウバエは、40年以上前に最初に説明された、堅牢な連想嗅覚学習および記憶形成を示す能力を含む、複雑な行動の広いスペクトルを示^す6。この古典的な調節手順の過程で、ハエの群れは、条件付き^刺激(CS+)として臭いを受け、無条件刺激(米国)として罰せられる感電を受ける。第二の臭い(CS^-)は、任意の罰なしで提示されます。それによって、動物は、2つの臭い、CS+およびCS^{- の}間の後続の選択状況でテストすることができる罰に関連する臭気を避けることを学ぶ。ショウジョウバエにおけるこの行動の根底にある神経基板の解剖に関する研究は、キノコ体(MB)を「エングラム」7、8、9、10の主要部位として同定した。したがって、この脳領域の回路は、メモリエングラムが取得および保存されるロジックを明らかにするために、激しい研究の対象であった(^{最近11、12}で検討)。

ショウジョウバエMBは、半球当たり約2,000個の固有ニューロン(ケニヨン細胞)からなる、並列軸法突^起13で編成される。嗅覚投影ニューロンの軸索は、横プロトセレブラとMBカリセス、MBの主な樹状入力部位に拡張され、アンテナローブからの嗅覚入力を受け取る。ケニヨン細胞の長い平行軸線束は、ペダンクルとローブを構成します。ほとんどのケニヨン細胞は、脳の中線に向かって1つの担保を拡張することにより、水平β/β'-ローブを形成し、後部前方向に2番目の担保を伸ばすことによって垂直α/α'-ローブを二股に形成する。ケニヨン細胞の他のグループは、学習プロセスおよびその後の短期記憶形成^が10に局在することができるMBの水平γ-^葉13を形成する。MBローブは、アフェレント入力を受け取り、エフェレント出力を提供し、どちらも通常、ケニヨンセル軸に沿った別個の区画サブ領域に制限されています^14,15^,16.特に、アフェレント・ドーパミン作動性MB入力ニューロンは、価値ベースを仲介することが示されており、例えば、懲罰的、連想嗅覚学習における効果を強化^{する15、17。}キノコの体葉からのステレオタイピックおよび個別に識別可能なEFFerent MB出力ニューロンは、多数のケニヨン細胞間で情報を統合し、多様な脳領域を標的とし、行動に有益な食欲または嫌悪情報¹⁵.このニューロンアーキテクチャは、連想エングラムの組織の概念につながっています。臭気は、ケニヨン細胞のまばらに活性化されたアンサンブルによって比較的正確にコードされる。これらのケニヨン細胞アンサンブルの偶然の活動とドーパミンの放出 - 刺激を罰することによって誘発される - 動物は、その後、動物が後でこの特定の匂いを避けるようにMB出力ニューロンにケニヨン細胞プレシナプスからの伝達を調節します^{10 、12}.このエングラムをパラダイマティックなケースとして使用し、シナプス活性におけるこれらの学習依存的変化をどのように決定および監視するかを示します。

モデルシステムとしてのショウジョウバエの価値は、複雑な回路内の単一ニューロンを同定、監視、および制御するためのトランス遺伝子を発現することを可能にする比類のない遺伝的ツールボックスに強く依存しています^18.ここで説明するカルシウムイメージングなどの神経活動モニタリングのための技術の出現は、特定の刺激に応答してニューロン活性パターンの決定を可能にした。遺伝的にコードされたカルシウム指標(GEC)の特定のGal4駆動発現と嗅覚刺激を組み合わせることにより、19^の目的のニューロンの臭気誘発カルシウムダイナミクスを可視化することができる。このプロトコルでは、この技術を古典的なコンディショニングパラダイムとさらに結合することにより、学習の文脈でこれらの嗅覚応答を調べことが可能であることを示す。学習誘発可塑性は、単一の特定のニューロンに局在するだけでなく、ニューロンの特定のサブコンパートメントにも局在するGECを使用してさらに解剖することができます。Pech et al.²⁰は、まさにこれを可能にするツールの選択を確立しました。GCaMP3²¹を前または後のナプスに標的化することにより、脊椎動物シナプトフィシンまたはdホーマーへの連結を介して、^{それぞれ20-}これらの部位の差動変調を区別することができる。このローカリゼーションは、この文脈において、サイトソル全体にユビキタスに存在するほとんどのGEC(例えば、GCaMP 22、GCaMP3^21、またはGCaMP6²³⁾に対する優位性を与える。ニューロン活性化の結果として生じる全体的な統合カルシウム流入と区別されます。これは、学習と記憶の形成を引き起こす結果として発生する可塑性の場所と種類に関する手がかりを提供することができます。一例として、ここで提供されるプロトコルは、カルシウムセンサの発現をポストシナプスのみに標的化することにより、嗅覚連想学習中のMB出力ニューロンの変調を解読する際のこのツールの価値を示す。モニタリングすることにより、個々のハエの中で、嗅覚調節の前後に臭気誘発活性を、ナイーブな臭気応答と学習された臭気応答との間で直接比較することができる。同じイメージングチャンバーに固定されている間、ハエは臭いの選択にさらされています。次に、これらの臭気の1つが電気^{ショック(CS+}になる)と対になり、補強なしで別の臭いが提示される(CS-^になる)逆連想調節プロトコルを受け取ります。最後に、ハエは再び最初のステップと同じ臭いにさらされます。カルシウムダイナミクスは、2光子顕微鏡を用いて観察される。

プロトコル

1. トランスジェニックフルーツハエ、ショウジョウバエメラノガスター

1. 所望のGal4とUASをそれぞれ25を運ぶクロスメスの処女と雄のハエ(12時間の光/暗いサイクルで60%の相対湿度^で25°Cで上昇)は、それぞれ、目的の特定のニューロンが遺伝的にコードを発現するハエを生成するカルシウムインジケータ。
2. 彼らは3-6日のポストエクロションの範囲になるまで、上記の十字架の女性の子孫を年齢。メスのハエは、そのわずかに大きなサイズのために好ましいです。

2. 生体内カルシウムイメージング用フルーツフライの調製

1. 単一の女性のハエを選択し、5分以上氷の上に麻酔します。
2. 微細な鉗子を使用して、画像室内にハエを置きます(図1cに示します)。胸郭と脚がチャンバの底部の電線と接触し、頭部が平らに置かれることを確認します。透明な粘着テープを使用してハエの位置を修正します。
   注:このプロトコルは、ハエが固定され、ヘッドカプセルが開口部にアクセス可能で、ハエがアンテナへの臭気刺激と胸部と脚への感電の両方を受け取ることができるカスタム構築されたチャンバーを必要とします(図1)。
3. メスのハンドルに固定された外科メスブレード(材料の表を参照)を使用して、ハエの頭部の周りのテープの窓をカットし、アンテナを覆い、胸郭の最も前の部分だけを露出させたままにします。
4. 青光硬化接着剤で頭の側面と背面を囲み、凹凸の顎が保持する昆虫ピンを使用して慎重に操作します。青色発光LEDランプを使用して接着剤を設定します。
5. 接着剤が完全にセットされているのを確認し、フライヘッドの背面から残留されていない接着剤をクリアします。
6. リンガーの^溶液24(材料の表を参照)の滴を適用して、頭部の露出したキューティクルを覆う。
7. 非常に細かい刃の刺しナイフを使用して、キューティクルを切り取ります。キューティクルの最も効率的な除去のために、最初に出発点としてオチェリを使用して頭の後部を横切ってカットします。次いで、両側を切り取り、目に中間に、鉗子を用いて容易に引き裂くことができるキューティクルのフラップを形成する。
8. 目的の脳領域をブロックする可能性のある余分なキューティクルを削除します。.
9. 細かい鉗子を使用して気管の後部を慎重にクリアし、脳組織自体の破壊を回避します。組織の破片の領域をクリアするために必要に応じて、リンガーの^溶液24(材料の表を参照)を取り外してリフレッシュします。
10. 皮下臭分針をハエの頭部から約1cmの位置に置きます。アンテナへの臭気の配信を妨げるものがないことを確認します。
11. 顕微鏡で、画像化チャンバを皮下臭送達針を介して臭気送システムに接続する。
12. ハエが麻酔や手術から完全に回復し、空気の流れに適応できるようにするために、この段階で10分の休息期間を実施する。

3. インビボカルシウムイメージング

1. 赤外線レーザーと水浸しの目的(材料の表を参照)を備えたマルチフォトン顕微鏡を使用して、振動絶縁テーブルに設置します。GFPベースのカルシウム指標を可視化するには、レーザーを920nmの励起波長に調整し、GFPバンドパスフィルタを取り付します。
2. 粗いZ調整ノブを使用して、脳のZ軸をスキャンし、目的の脳領域を見つけます。トリミング機能を使用して、スキャン時間を最小限に抑え、ヘッドの前部が下向きに向かうようなスキャン ビューを回転させるために、この領域のみにスキャンを集中させます。
3. フレーム サイズを 512 x 512 px に調整し、スキャン速度を > 4 Hz に調整し、領域をスキャン(Y 寸法)して、対象のニューロンがカバーするようにします。

4. 嗅覚調節を通じた臭気誘発カルシウム過渡の可視化

1. 一時的に正確な方法でいくつかの臭気刺激を送ることができる臭気送達^{システム19、26}を使用する。
   1. 追加のコンピュータを使用してデバイスを制御し、イメージング顕微鏡ソフトウェアと通信して、実験中の画像キャプチャと臭気刺激を調整します。
   2. 画像取得ソフトウェアと臭気配信プログラム(顕微鏡制御ソフトウェアにインストールされたVBAマクロパッケージなど、外部入力に応答する「材料の表」を参照)をリンクできる事前プログラム済みのマクロパッケージを開始します。別のプログラムで臭気配信プロトコルの開始によって提供されるトリガ)。
2. 「事前訓練」/ナイーブ臭気誘発カルシウムトランジェントを512 x 512 pxの解像度で監視し、4 Hzのフレームレートで測定を開始します。₀ベースライン値)と、臭気オフセット後の 12.5 s。これを2番目の臭気で繰り返し、次に第3の臭気で繰り返します。
3. 古典的なコンディショニング(「トレーニング」)フライでこの測定の後3分続けます。
   1. 「事前トレーニング」フェーズで提示された臭いのいずれかを選択してCS⁺臭いになり、もう1つはCS^-臭気になります。12の90 V電気ショックと一緒に60秒のためのコンピュータ制御の臭気配達システムを使用してCS⁺臭気を提示します。
   2. 60sブレークの後、CS^- 60 s.臭気4-メチルシクロヘキサノールおよび3-オクタノールとして使用するCSを単独で提示する。このトレーニング中に第3の臭気(例えば、1オクテン-3-ol)を提示しないでください。
4. 「トレーニング後」の臭気誘発カルシウム過渡を「事前トレーニング」臭気刺激プロトコル(ステップ4.2.)を3分繰り返して、トレーニングフェーズを終了した後(ステップ4.3)。
   注:このステップのタイミングは、メモリ形成後の関心時間を反映する必要があります(例えば、短期記憶を調べるコンディショニングステップの後にこのステップを3〜4分後に実行する)。通常、ハエはこの準備で数時間生き残ることができます。
5. 後で画像解析を行うために、イメージング ファイルを適切な形式 (Tiff など) に保存します。

5. 画像解析

1. 画像を分析するには、フィジー²⁷などの画像解析ソフトウェアで Tiff (または類似の) ファイルを開きます。
2. 移動補正アルゴリズムを使用してスタックを位置合わせし、X 方向と Y 方向の動きを最小限に抑えます。Z 軸で強い動きを示す録音を破棄します。
3. 検査対象地域 (ROI) をマークするために使用するソフトウェアのツールを選択します。これは、背景蛍光の影響を制限するために、可能な限り正確でなければなりません。
4. ソフトウェアのそれぞれのツールを使用して、選択したROIからデータファイルとして時間蛍光強度データを抽出し、記録の各フレームに対して値が生成されます。
5. データ分析プログラムを使用してデータを開き、各臭気トレースの ΔF/F₀値を計算します。F₀₌臭気発症前の2sにおける平均蛍光。ΔF = 所定のフレーム内の生蛍光とF₀の差。これらの値から、匂気刺激期間全体の相対蛍光を反映するために時間に対してプロットできる各フレームのΔF/F₀値を計算します。

結果

上記のプロトコルで取得した画像の例を図 2に示します。dホーマー-GCaMP3は、デンドライトがMB γ-ローブのコンパートメント1を内向するMB出力ニューロンで発現され(ニューロンはMVP2^28,29と呼ばれている)、スプリットGal4ラインMB112C¹⁶を使用して遺伝的に標的化される。また、細?...

ディスカッション

学習と記憶の基礎となる神経回路の解剖は、神経科学の分野で顕著な目標です。ショウジョウバエの遺伝的アクセシビリティと行動検査の幅と容易さは、このような現象を調査するための理想的なツールです。ここで、個々のハエの中で、嗅覚調節の結果として細胞内レベルで起こる変調を可視化することができる方法が提示される。当社^{グループ17}が最初に設立し?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Octen-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	O5284	Chemical used as odorant
3-Octanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	218405	Chemical used as odorant
4-Methylcyclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	153095	Chemical used as odorant
Bandpass filter for EGFP (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany
Clear adhesive tape	Tesa SE, Norderstedt, Germany		Standard claer adhesive tape
Concave-convex jaws	Fine Science Tools, North Vancouver, Canada	10053-09	Blade Holders with concave-convex jaws
Fine forceps	Fine Science Tools, North Vancouver, Canada	11412-11	Forceps with tip 0.1 x 0.06mm
Hypodermic needle	Sterican - B. Braun, Melsungenk, Germany	4665120	1.20x40mm
Insect Minutien pins	Fine Science Tools, North Vancouver, Canada	26002-10	Diameter 0.1mm, tip 0.0125mm
Kentoflow	Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK	953683	Blue light-curing glue
Microscope slide	Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany	0656.1	Standard objective slide 76 x 26 mm
Mineral oil	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M8410	Used as diluent for odorants
Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA		Tunable infrared femtosecond laser
Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany		Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany	421452-9900-000	Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Ringer's solution	n.a.	n.a.	5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sucrose, pH = 7.4
Stab knife	Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA	72-1551	5.0mm Straight restricted blade depth
Surgical scalpel blade	Swann-Morton, Sheffield, UK	0303	Product No. 11
Surgical scalpel handle	Swann-Morton, Sheffield, UK	0907	Product No. 7S/S
Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope.	Custom-written and available upon request	n.a.	n.a.