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要約

デトルソールフリー膀胱モデルは、サブグロテリウムへの直接アクセスを可能にし、尿の貯蔵および空洞化中にサブロテリウム/ラミナ・プロプリアにおける生物学的に活性なメディエーターの可用性を調節するための局所メカニズムを研究する。調製物は、無傷の膀胱の充填によく似ており、全身的な影響を受けずに圧力量の研究を行うことができます。

要約

これまでの研究では、Ussingチャンバーに貼られた平らな膀胱粘膜シートからの化学物質の放出を確立し、静水圧または機械的ストレッチの変化、静水圧変化、ストレッチ、細胞腫脹、またはドラッグ力、および充填終了時の膀胱内腔における培養尿道細胞の変化にさらされています。このような知見は、これらのメディエーターが膀胱充填中にスグロテリウム(SubU)/ラミナプロプリア(LP)にも放出され、膀胱壁の深部の細胞に影響を与え、最終的に膀胱の興奮性を調節するという仮定につながった。このような研究には少なくとも2つの明白な制限があります:1)これらのアプローチのいずれもSubU/LPにおけるメディエーターの存在に関する直接的な情報を提供せず、2)使用される刺激は生理学的ではなく、膀胱の本物の充填を再現しません。ここでは、膀胱充填の過程で膀胱粘膜の皮下表面に直接アクセスできるようにする手順について議論する。私たちが作成したマウスのデトルッサーフリー製剤は、無傷の膀胱の充填によく似ており、脊髄反射および脱離滑筋からの混乱シグナル伝達がない場合に膀胱に対して圧力量の研究を行うことができます。新しいデトルッサーフリー膀胱モデルを用いて、我々は最近、メディエーターの静脈内測定は、膀胱充填中にSubU/LPに放出または存在したものへのプロキシとして使用できないことを実証した。このモデルは、放出され、代謝によって生成され、膀胱充填の過程でSubU/LPに輸送され、膀胱のニューロンおよび平滑筋に情報を伝達し、減衰および興奮の間にその興奮性を調節する尿黒体由来シグナル伝達分子の検査を可能にする。

概要

このモデルの目的は、膀胱充填の異なる段階の間に膀胱粘膜の粘膜下側への直接アクセスを可能にすることです。

膀胱は充填時の早期収縮を控え、臨界体積と圧力に達すると空にしなければならない。尿の異常な大腸または空洞化は、膀胱充填の過程でデトルッサー平滑筋(DSM)の異常な興奮性にしばしば関連する。DSMの興奮性は、平滑筋細胞に固有の因子および膀胱壁内の異なる細胞型によって生成される影響によって決定される。尿膀胱の壁は、尿肉腫(粘膜)、スグロテリウム(SubU)/ラミナプロプリア(LP)、脱石平滑筋(DSM)およびセローザからなる(図1A)。尿黒周体は、傘細胞(すなわち、尿黒体の最も外側の層)、中間細胞、および基底細胞(すなわち、尿黒体の最も内側の層)からなる。間質細胞、線維芽細胞、椎間神経末端、小血管、免疫細胞など、様々な種類の細胞がSubU/LPに存在する。膀胱尿経皮は、SubU/LPおよびDSM1、2、3の細胞に影響を与える粘膜下にメディエーターを放出することによって反射反射のミチュレーションおよび大腸を開始する感覚器官であると広く仮定される。ほとんどの場合、このような仮定はメディエーターの放出を実証した研究に基づいています:静水圧4、5の変化にさらされた粘膜の断片から。ストレッチ6、7、低トニシティ誘発細胞腫脹7またはドラッグ力8に曝露された培養尿道細胞から;受容体または神経活性化時に分離された膀胱壁ストリップから9,10,11,12,13,14;膀胱充填の末端の膀胱内腔15、16、17、18、19.このような研究は、膀胱壁セグメントまたは培養尿中細胞の機械的刺激時にメディエーターの放出を実証するのに役立ったが、膀胱充填を再現する生理的刺激によって引き起こされる粘膜下のメディエーターの放出に関する直接的な証拠によって支持される必要がある。これは、SubU/LPが膀胱の充填中にSubU/LPの近くに簡単にアクセスするのを妨げる膀胱壁の深部に位置していることを考えると、挑戦的な作業です。

ここでは、膀胱の尿経骨、DSMおよび膀胱壁の他の細胞型との間のシグナル伝達に関与するメカノトランス誘導の局所的メカニズムに関する研究を容易にするために開発されたデトルター筋肉除去13を有する分散型(ex vivo)マウス膀胱モデルを例示する。このアプローチは、膀胱内の生理学的圧力および体積に応じて放出または形成される尿黒皮由来メディエーターのSubU/LP付近での直接測定を可能にし、細胞培養における潜在的な表形の変化を回避するため、平らな膀胱壁シート、膀胱壁ストリップまたは培養尿中細胞を使用する場合に優れています。これは、膀胱充填の異なる段階でSubU/LPにおけるメディエーターの可用性、放出、代謝および経尿中輸送を測定するために使用することができる(図1B)。調製物はまた、過活動および不活発膀胱症候群のモデルにおける尿動脈シグナル伝達およびメカノトランスクションを調べるために使用することができる。

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プロトコル

この原稿に記載されている動物に関するすべての手続きは、ネバダ大学の国立衛生研究所の実験動物のケアと使用のためのガイドと制度的な動物使用とケア委員会に従って行われました。

メモ:ここで提示されるモデルは、尿路およびSubU/LPがそのまま残っている間に除出し筋肉の除去から成り立っている(図1B)。

1. デトルッサーフリー膀胱製剤の解剖

  1. 単離した膀胱を冷たい(10°C)で満たされた解剖皿に入れ、5%CO2/95%O2クレブス重炭酸溶液(KBS)で酸素化し、次の組成(mM):118.5 NaCl、 4.2 KCl, 1.2 MgCl2, 23.8 NaHCO3, 1.2 KH2PO4, 11.0 デキストロース, 1.8 CaCl2 (pH 7.4)13.
  2. 孤立した膀胱のドームの小さな部分を、KBSで満たされたシルガードで覆われた解剖皿にピン留めします。ピンが、SubU/LPに面する筋肉の最も内側の端から遠く離れた、セローザまたはデトルッサー筋肉の最も外側の端を通過することを確認します。
  3. 顕微鏡を使用して、尿道と尿管を識別し、それらのそれぞれを解剖皿の底に固定します。
  4. 膀胱の全身、尿道、両方の尿管が表示されるように、余分な脂肪および結合組織を取り除きます。
  5. 6-0ナイロン縫合糸で尿管を結びます。次に、解剖皿の底に向かって尿管の開いた端を固定し、準備を確保します。
  6. 細かい先端鉗子を使用して、尿管と膀胱体の間の角で静かにセローザの一部を引っ張ります。
  7. 透明度を高め、脱筋肉の下の粘膜下のマージンを区別するために顕微鏡の光を調整します。
  8. デトルッサー筋層の内面に沿って細かい先端のはさみで膀胱壁を切断し始め(剥離しない)と、カットセグメントを準備からそっと引き離します。常に、粘膜の横端が見えるようにし、それに触れないようにしてください。
  9. 分解皿を回してデトルソー筋肉を完全に取り除き、準備の位置が脱気筋を解剖し続けることを快適にします。
  10. 膀胱ドームの上に小さなデトルソル筋肉を残して、プロトコルの残りのステップ中に準備を固定する能力を確保します。
  11. 6-0ナイロン糸のダブルループを作り、膀胱の準備の首の周りに置き、ループを緩めたままにします。
  12. 6-0シルク糸の2番目の二重ループを追加し、膀胱の準備の首の周りに置き、ループが失われたままにします。縫合糸を2つ持つことは縫合糸のまつれの漏れを防ぐ。
  13. 20 PEチューブ(カテーテル)の約2cmをカットし、炎に近い先端をゆっくりと動かして先端を燃やします。
  14. カテーテルに温かい(37°C)酸素化されたKBSを充填します。
  15. カテーテルを膀胱尿道のオリフィスに挿入し、カテーテル先端が膀胱のおよそ真ん中に達するまでカテーテルを軽く押します。
  16. カテーテルの周りの縫合糸と膀胱頸部の周囲の組織を結びます。
  17. 約50~100μLの暖かい(37°C)の酸素化KBSで膀胱をゆっくりと満たし、KBSの表面上で短時間(<10s)持ち上げ、縫合糸と膀胱体の漏れを監視します。
  18. 漏れが認められない場合は、実験の準備が整います。縫合糸の周りに漏れが見られた場合は、縫合糸を取り外して交換してください。膀胱体の穴からの漏れが気付いた場合は、準備を破棄します。

2. 緻密膀胱製剤の充填

  1. 水(37°)の3 mL室にシルガードの底を付けたジャケットオルガン皿にKbS(37°)をパーフューズ。
  2. 酸素および吸引ラインを調節しなさい。
  3. うなじの膀胱の準備を部屋に入れ。
  4. カテーテルをチャンバーの側面に固定し、調製物が灌流液の表面の上に浮かばないようにします。
  5. 膀胱カテーテルを、同じサイズのフィッティングを使用して3方向ストップコックに接続された長いPE20チューブ(注入ライン)に接続します。
  6. 注入ポンプ、圧力トランスデューサ、膀胱の間の線が開いていることを確認します。
  7. 注入注射器に新鮮で暖かい(37°C)と酸素化されたKBSを充填します。
  8. ポンプパラメータを調整する:シリンジのタイプ/体積(すなわち、1 mL)、操作(すなわち注入)、流れ(すなわち、一定)、および流量(すなわち、15 μL/分)。
  9. シリンジポンプのスタートボタンを押して膀胱を埋めます。
  10. 膀胱充填中の充填量と静脈内圧を監視します。

3. 緻密膀胱製剤のSubU/LP様におけるメディエーターの検出

  1. 氷冷マイクロ遠心管または高速液体クロマトグラフィー(HPLC)インサートに浴液のアリコートを収集します。
  2. 適切な検出アプリケーションに従ってサンプルを準備し、処理します。プリンの利用可能性を検出する場合は、蛍光検出13、18でHPLCによりサンプルを処理する。

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結果

マウスデトルッサーフリー膀胱調製物の壁はそのままであり、DSMおよびセロサを除くすべての層を含む。原理実証研究は、DSMフリー膀胱壁に尿座とSubU/LPが含まれており、ツニカ筋肉およびセロサが存在しない(図2)13であることを実証した。

デトルッサーフリー膀胱の充填は?...

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ディスカッション

膀胱には、尿の貯蔵と空隙という2つの機能があります。これらの機能の正常な動作は、消失筋の興奮性を調節するために膀胱壁の細胞を介して信号のイントラルミナスボリュームと圧力と伝達の適切な機械的センシングを必要とします。膀胱粘膜(尿黒体)は、膀胱壁の多数の細胞型に影響を与えるSubU/LP内の様々なシグナル伝達分子を放出することによって膀胱の興奮性を調節すると考えられ...

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開示事項

この作品の一部は、以前に生理学雑誌(PMCID:PMC6418748;DOI:10.1113/JP27692413) 。本書の資料の使用に関して、ワイリー・アンド・サンズ社から許可を得ています。著者は開示する財政的または他の矛盾を持っていません。

謝辞

この研究は、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所グラントDK41315によって支援されました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
CaCl2FisherC79Source flexible
DextroseFisherD16Source flexible
Dissecting pinsFine Science Tools26002-20Source flexible
Infusion PumpKent ScientificGenieTouchSource flexible
KClFisherP217Source flexible
KH2PO4FisherP284Source flexible
Light sourceSCHOTT ACEISource flexible
MicroscopeOlympus SZX7Flexible to use any scope
MgCl2FisherM33Source flexible
NaClFisherS671Source flexible
NaHCO3FisherS233Source flexible
Needles 25GBecton Dickinson305122Source flexible
Organ bathCustom madeFlexible source; We made it from Radnoti dissecting dish
PE-20 tubingIntramedic427405Source flexible
Pressure transducerAD instrumentSource flexible
S&T ForcepsFine Science Tools00632-11Source flexible
Software pressure-volumeAD InstrumentsPower lab
Suture Nylon, 6-0AD surgicalS-N618R13Source flexible
Suture Silk, 6-0Deknatel via Braintree Scientific, Inc.07J1500190Source flexible
Syringes 1 mLBecton Dickinson309602Source flexible
Vannas Spring ScissorsFine Science Tools15000-08Source flexible
Water circulatorBaxterK-MOD 100Source flexible

参考文献

  1. Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72, 1057-1064 (2007).
  2. Fry, C. H., Vahabi, B. The Role of the Mucosa in Normal and Abnormal Bladder Function. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. , 57-62 (2016).
  3. Merrill, L., Gonzalez, E. J., Girard, B. M., Vizzard, M. A. Receptors, channels, and signalling in the urothelial sensory system in the bladder. Nature Reviewes Urology. 13, 193-204 (2016).
  4. Ferguson, D. R., Kennedy, I., Burton, T. J. ATP is released from rabbit urinary bladder epithelial cells by hydrostatic pressure changes--a possible sensory mechanism? Journal of Physiology. 505, 503-511 (1997).
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  7. Mochizuki, T., et al. The TRPV4 cation channel mediates stretch-evoked Ca2+ influx and ATP release in primary urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 284, 21257-21264 (2009).
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  19. Gonzalez, E. J., Heppner, T. J., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. Purinergic signalling underlies transforming growth factor-beta-mediated bladder afferent nerve hyperexcitability. Journal of Physiology. 594, 3575-3588 (2016).

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