単一分子観測のためのDNA折り紙ナノ構造に関するダインとキネシンモーターアンサンブルの製造

要約

このプロトコルの目的は、DNA折り紙ナノ構造上の分子モーターのアンサンブルを形成し、全内部反射蛍光顕微鏡を使用してアンサンブル運動性を観察することです。

要約

細胞骨格モーターは、有人化、貨物輸送、細胞運動性など、真核細胞の多種多様な機能を担っています。これらの機能の多くは、アンサンブルで動作するモーターを必要とします。個々の細胞骨格モーターのメカニズムに関する豊富な知識にもかかわらず、モーターアンサンブルのメカニズムと出現する挙動については比較的知られていない。モータ番号、位置、および構成を変更します。構造DNAナノテクノロジー、およびDNA折り紙の特定の技術は、モーターアンサンブルの明確に定義されたアーキテクチャの分子構造を可能にします。貨物構造の形状だけでなく、構造上のモーターの種類、数、配置はすべて制御することができます。ここでは、これらのアンサンブルを生成し、全内部反射蛍光顕微鏡を使用してそれらを観察するための詳細なプロトコルを提供します。これらの技術は細胞骨格モーターに特異的に適用されているが、この方法は、そのタスクを達成するために複合体で組み立てる他のタンパク質に一般化可能である。全体的に、運動タンパク質の明確に定義されたアンサンブルを作成するためのDNA折り紙法は、出現した運動挙動につながるメカニズムを解剖するための強力なツールを提供します。

概要

ダインとキネシンは、真核^細胞1における無数の機能を担う細胞骨格運動タンパク質である。ATP加水分解の化学エネルギーを生産的な作業に変換することにより、これらのモーターは微小管に転移し、様々な細胞内貨物を運搬し、分配します。また、人芽細胞に関連する大規模な細胞内再配列を調整し、染色体の位置決めと分離に寄与するオーケストレーション力を示します。単一分子観測を含む構造、生化学的、および生物物理学的アッセイは、個々のレベルでこれらのモータのメカニズムを明らかにしました(前の^{研究2、3、4}でよくレビューされています)。しかし、モータのタスクの多くは、類似および混合モータタイプの両方の小さなアンサンブルで動作する必要があります。比較的少ないこれらの^{アンサンブル5、6}の活動と究極の出現運動性を調整するメカニズムについて理解されている。このナレッジ ギャップは、モータの種類やコピー番号など、制御可能なフィーチャを持つアンサンブルを作成するのが難しいためです。この問題を解決するために、過去10年間にわたり、DNA折り紙の分子構築技術が採用されてきました。微小管ベースのモータについては、これらの調査のいくつかの例は、細胞質のダイネイン-1^7、8、9、イントラフラペラジネ^イン11、およびイントラフラペラジネインのアンサンブルの単一分子観察を含む。様々なキネシンモー^{タ12、13、}およびダイニンとキネシンの混合物7、14、15。ここでは、酵^{母7、16、17、18、19、20、}およびからモータの精製およびオリゴヌクレオチド標識の詳細を提供する。調合性^{コンプライアンス8}を用いたセグメント化されたDNA折り紙の折りたたみおよび精製、およびシャー^{シ構造7、18}を推進する酵母モーターのイメージング。

インビトロ単一分子観察のためのモータアンサンブルを構築するには、3つの主要な努力が必要です。第1は、DNA折り紙に付着するのに適したモータ構造体の発現、精製、標識である。2つ目は、定義されたDNA折り紙構造(しばしば「シャーシ」と呼ばれます)の製造と精製です。そして3つ目は、全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡を用いた観察に続いて、シャシー構造へのモータの結合です。ここでは、酵母サッカロマイセスセレビシエ7、16、17、18^{から精製された組換え微小管ベースのモータクルに対するこのプロセスのための確立されたプロトコルを提供します。19.}DNA折り紙ベースのモーターアンサンブルは、組換えキネ^シン15とダ^{イン7、8、18}の両方の構造を用いて調査されたこの酵母発現^{システム16 ,17,18,19}.このプロトコルは、ガラクトース誘導プロモーターによって制御され、精製(ZZおよびTEVプロテアーゼリンカー)およびDNAオリゴ結合(SNAPtag)のために同じタンパク質タグに融合することを考えると、これらの構造体に有効です。

特定の酵母株は、特定のモータ構造を生成します。例えば、貨物コンプライアンスの役割を研究するために使用されるダインは、株RPY1084^7,8から精製した。一般に、発現および精製のための適切な遺伝子改変を有するモータ構造を含む株は、それらのモータの使用を公表した実験室から要求することができる。突然変異やタグなどの新しい属性を持つ構造体は、酢酸リチウム^変換21および市販キットなどの組換え遺伝的技術を用いて作ることができる。単一分子研究のための酵母中の修飾運動タンパク質を作成するための詳細なプロトコル^が19に発表されました。SNAPtagに融合されるモータに加えて、モーターのラベルに使用されるオリゴは、SNAP基板、ベンジルグアニン(BG)に結合する必要があります。以前に公開されたプロトコルは、BG-オリゴコンジュ^ゲート18の形成および精製について説明する。ここで説明する全体的な戦略は、アクチンベースのモータ(例^{えば22、23、24)、}および他の生物および発現システムから精製されたモーター(前を参照)にも採用されている(例 7^,9,^{10,11,12,13,14})

重合された微小管(MT)は、2つの異なる手順でこれらの実験で使用される。機能性モータのMTアフィニティ精製には、他の機能基にラベル付けされていないMTが必要ですが、モータアンサンブル運動性TIRFアッセイにはビオチンおよび蛍煙素で標識されたMTが必要です。いずれの場合も、T は退化を防ぐためにタキソルで安定化されます。MTアフィニティ精製ステップは、これらのモータがシャーシに結合した場合にアンサンブルの運動性を変更できるため、高いMTアフィニティを持つ非運動性モータを除去するために使用されます。このプロセスの間、アクティブモーターはMTをバインド解除し、溶液中に残り、タイト結合モータはMTペレットでスピンダウンします。これにより、シャーシ上のすべてのモータがアクティブな集団から確実に使用されます。

様々なDNA折り紙構造は、細胞骨格運動アンサンブルを研究するために使用されています。アンサンブル輸送の機械的理解が深まるにつれて、実験で用いられるDNA折り紙構造は複雑化しています。原理的には、モーターおよび蛍煙素のための一本鎖DNA付着部位を含むように変更されていれば、任意の構造がこの目的に適応することができる。特定のシャーシの設計と属性は、モーターアンサンブルの出現動作に関する特定の質問を調査するのに役立ちます。例えば、硬質ロッドは、ダイネインとキネシン7、15、18、および2Dプラットフォームのチームによる輸送にコピー数がどのように影響するかについての基礎知識を開発するために使用^され、ミオシンアンサンブルを研究するために使用されてきました。アクチンネットワークのナビゲーション²².可変的または調節不可能な柔軟性を持つ構造は、モータ間の弾性カップリングの役割を理解し、ステッピング同期が運動^性8、24にどのように影響するかを調けるために使用されています。最近では、運動トラック結合に対する幾何学的制約が運動^性25のダイナミクスにどのように影響するかを知るために球状構造が使用されている。

このプロトコルでは、可変剛性を持つセグメントシャーシ上のアンサンブル実験のための特定のステップを提供します。シャーシ上の結合部位は「ハンドル」と呼ばれることがありますが、これらのハンドルを結合する相補的なDNA配列は「アンチハンドル」と呼ばれます。これらのシャーシ上のモータの数は、オリゴ標識モーター上のアンチハンドルオリゴに相補性を持つ拡張ハンドルステープルを含むセグメントによって決定されます。異なるセグメントで異なるハンドルシーケンスを使用すると、異なるタイプのモータをシャーシ上の特定の位置にバインドできます。ここで詳述するシャーシは、7つのシーケンシャルリジッドセグメントで構成され、それぞれが2つの同心円^リング8に配置された12本の二本鎖DNAヘリクスで構成されています。剛性セグメントにはモータハンドルが含まれており、フレキシブルな一本鎖DNAまたは硬質二本鎖DNA(それぞれ「リンカー」ステープルの不在または存在に応じて)に接続される領域を介して接続されます。シャーシ構造の準拠は、これらの「リンカー」ステープルの有無によって決まります。詳細と特定のDNA配列については、以前のレポートを参照してください⁸.さらに、シャー^シ26を浄化するために複数の方法を使用することができます。レートゾーングリセロール勾配遠心分離^法27をここに記載する。

プロトコル

1. ガラクトース誘導プロモーターによって制御される運動タンパク質の成長、発現および収穫

1. 酵母ペプトン-デキストロース(YPD)培養プレートと無菌接種スティックを用いて、所望の冷凍酵母株をストリークし、30°Cで3〜4日間インキュベートする。
2. 培養成長の1日目:午後に、直径1"ガラス培養チューブに2%デキストロースを含むYP培養培地の10 mLを追加し、プレートから単一のコロニーで接種します。一晩30°Cで急速に回転ローラードラムで成長します。
3. 2日目:午後、10mLの培養を2%のラフィノースで50mLのYP培養培地を含む250mLフラスコに移す。軌道シェーカーで250rpmで振りながら、30°Cで一晩インキュベートします。
4. 3日目:午後、60mLの培養物を2%ガラクトースでYP培養培地の1Lを含む3Lフラスコに移す。軌道シェーカーで250rpmで振りながら、30°Cで一晩インキュベートします。
5. 4日目:午前中に開始し、2時間ごとに600 nmで培養の光学密度(OD)を監視します。培養がOD 1.5と2の間にある場合は、次の手順を続けて細胞を収穫します。このOD範囲外の収穫は、OD 1.5より前の低い細胞数、またはOD2を上回る細胞静止およびタンパク質分解による収量を減少させる可能性がある。
6. 細胞培養を遠心ボトルにデカントし、上清を8分間4°Cで~6200 x gで回転させます。
7. 二重蒸_留H2O(ddH₂O)でボトル内の細胞ペレットを再中断します。
8. 細胞を4°Cで~6200 x gで8分間回転させ、上清を注ぎ、廃棄します。
9. セルペレットの粘度に応じて、最大2mLのddH₂Oを添加し、ピペッティングに十分な溶液液を作成します。
10. 10 mLピペットを装着した電動ピペットコントローラを使用して、細胞スラリーを液体窒素に一滴ずつゆっくりと分配します。これは酵母細胞の凍結ペレットを生成します。
11. 冷凍細胞を-80°Cで保存し、精製する準備ができるまで保存します。

2. 酵母細胞からの運動タンパク質の精製

1. 細胞溶解および可溶性タンパク質抽出
   1. 純粋なエタノールで0.1 M PMSFの新鮮な溶液の1 mLを調出します。PMSF は水中で不安定であるため、水性バッファーに PMSF を追加するのを待ちます。また、使用の20分以内(水中PMSFのおおよその半減期)まで水への暴露を避けてください。
   2. 5xリシスバッファーの5xリシスバッファーを氷上に50 mLのリシスバッファーを準備し、リシスバッファーの5xストックからのサプリメントを使用しますが、バッファーが酵母ペレットに適用される直前までPMSFを追加しないでください。
   3. 液体窒素冷凍酵母ペレットを、液体窒素であらかじめ冷やしたブレードタイプのコーヒーグラインダーで微粉末に粉砕します。
      注:このタンパク質抽出は、通常、酵母培養の2Lから採取された細胞ペレットから始まります。酵母培養の開始量は、以下のステップ2.2.2および2.3.1でIgGビーズとDNAオリゴの体積に相応の調整を加えて上下に調整することができます。
   4. 氷上のDTTおよびMg-ATPを有する4xリシスバッファーのAliquot 15 mLを、2 mMの最終濃度を達成するためにバッファーにPMSFを追加し、サプリメントを含む4xリシスバッファーの調製を完了する。
   5. 酵母粉末を氷の上に100mLのガラスビーカーにあらかじめ冷やします。バッファーの最終的な濃度が1倍を超えないように、サプリメントを含む4xリシスバッファーの少量を粉末に追加します。典型的には、酵母粉末の10mL毎にバッファーの〜1.5 mLを追加します。
   6. へらを使用して一定の撹拌で37°Cの水浴にビーカーを入れることによって、迅速に液体相に粉末を解凍します。
   7. 解凍直後にライサートのビーカーを氷の上に置き、50mL円錐管を用いてリザーゼ量を推定し、バッファーの最終濃度が~1倍となるように、サプリメントでさらに4倍のライシスバッファーを追加します。典型的には、酵母培養の2Lは、1xリシスバッファーを含むリサートの合計25〜35mLを得る。
   8. 氷の上の遠心ボトルにライサートを均等に分配します。各ペア間の質量差にボトルのバランスを慎重に 0.01 g 以下にし、ボトルの崩壊を防ぐために必要な最小量を各ボトルが超えていることを確認します。4°Cで25分間〜290,000 x gで遠心分離機。
   9. 氷上の50mL円錐管に可溶性タンパク質を含む上清を回収し、細胞破片や大小器官を含むペレットを廃棄する。彼らは後続のステップで使用される重力流れカラムを詰まらせることができるので、上清の曇り部分を収集しないでください。SDS-PAGE分析用の上清を10μL保存します。
2. IgG アフィニティ精製
   1. 上記のスピンの間に、氷の上または冷たい部屋に重力流クロマトグラフィーカラムを設定します。
   2. 50%IgGの50%のIIgの親和性ビーズスラリーの200 μLをカミソリの刃で切ったP-1000ピペット先端を使用してカラムに移し、入口ポートの直径を拡大します。細胞培養ペレットの2L以上またはそれ以下を精製する場合は、ビーズスラリーの体積を比例的に調整し、最小体積を100μLにする。
   3. アリコート DTT および Mg-ATP を使用した 4x リシス バッファーの別の 15 mL をアライコートし、PMSF をバッファーに追加して、最終的な濃度 2 mM を達成します。ddH₂O を追加して、氷上の 4x バッファーを 1x に希釈します。
   4. ビーズを1xリシスバッファーの5 mLで2xを洗浄します。
   5. サプリメントで1xリシスバッファーの200 μLでビーズを再中断します。
   6. 遠心分離から得られたタンパク質抽出物にビーズ懸濁液を加え、穏やかな回転で1時間4°Cで混合物をインキュベートする。
   7. インキュベーションの間、氷上に洗浄バッファーの25mL(表1で詳述)と1x TEVバッファーの50 mL(表1に詳述)を氷上に準備します。
   8. 1時間インキュベーションの後、上記のステップ2.2.2で使用されるのと同じクロマトグラフィーカラムを通して、氷上または冷たい部屋でライサートビーズ混合物を濾過します。SDS-PAGE解析用のフロースルーを10μL保存します。
   9. 残りのモーターバウンドビーズを5mLの洗浄バッファーで氷2x上で洗います。SDS-PAGE分析のための最初の洗浄の10 μLを救う。
   10. ビーズを1x TEVバッファーの5 mLで一度氷の上に洗います。バッファが列から完全に排出されます。
3. DNAオリゴヌクレオチドおよびTEV切断による標識
   1. 設定からクロマトグラフィー列を取り外し、列の下部をキャップします。同じカラム内で、100μLの1x TEVバッファーでモータービーズを100μLでインキュベートし、精製されたBG-オリゴの10~20μMを室温(RT)で10~15分間インキュベートします。細胞培養ペレットの2L以上またはそれ以下を精製する場合は、1x TEVバッファーの体積を比例的に精製し、BG-オリゴを精製する。モータラベリングの歩留まりと速度を上げる必要がある場合は、メーカーの指示に従ってインキュベーション時間を長くしますが、インキュベーション時間が長いほど、RTでのタンパク質変性による機能不全モータの割合が増加する可能性があることに注意してください。
   2. インキュベーションの毎分、ビーズをそっと再び取り付けます。
   3. ラベル付きモータービーズ4xを1x TEVバッファーの4mLで洗浄し、以前と同じクロマトグラフィーカラムとセットアップを使用します。最終的な洗浄がカラムから完全に排出されます。
   4. カラムの底部をキャップし、1x TEVバッファーの200 μL以下でモータービーズを再中断し、2 mLの丸底マイクロ遠心管に移します。
   5. 穏やかな回転で16 °Cのモータービーズ混合物のμL当たり約0.3単位のTEVプロテアーゼで懸濁液をインキュベートします。チューブは、ビーズが接触するチューブの全表面積を最小限に抑えるために取り付ける必要があります。
   6. 管を冷たい部屋で30秒の21,130 x gのマイクロ遠心分離機で遠心分離し、チューブの底部に混合物を濃縮する。
   7. まだ冷たい部屋で、カットP-1000ピペットチップを使用して、混合物をスピンカラムと遠心分離機に21,130 x gで30s.TEV切断、精製モーターを含む濾過物を回収します。TEVプロテアーゼは、モーターと同様に濾液中になります。
   8. SDS-PAGE分析用の濾液を10μL保存します。TIRF実験では2μL、微小管親和性精製では50μLの体積で残りの濾過をアリコートします。フラッシュは液体窒素でアリコートを凍結し、-80 °Cで保存します。
   9. SDS-PAGE 解析用に、フィルターに残っているビーズを 1x TEV バッファーに再停止します。上記のステップ 2.3.4 と同じボリュームの 1x TEV バッファーを使用します。

3. 微小管(MT)重合

1. TIRFアッセイ用チューブリンミックスの調製
   1. コールドルームでは、各タイプの凍結乾燥チューブリン(標識されていないウシチューブリン、ビオチン化チューブリン、蛍光チューブリン)を再構成バッファー(表2に詳述)に別々に溶解させ、最終的な濃度を10mg/mLにする。氷の上に10分間座りましょう。
      1. 以下の成分を混ぜて、冷たい部屋で10分間氷の上に座らせます(最終濃度は括弧内に示されます):18 μLのウシチューブリン(約8.2mg/mL)、2μLのビオチン化チューブリン(約0.9mg/mL)、蛍光チューブリン(~0.9mg/mL)。
   2. 液体窒素中のチューブリン混合物とフラッシュ凍結の3 μLアリコートを調調します。混合物を-80 °C.で保存します。
2. モータのMTアフィニティ精製用チューブリンの調製
   1. 冷たい部屋で、凍結乾燥牛チューブリンを再構成バッファーに溶解し、最終的な濃度を10mg/mLにする。氷の上に10分間座りましょう。
   2. 液体窒素中のチューブリン混合物とフラッシュ凍結の3 μLアリコートを調調します。混合物を-80 °C.で保存します。
3. チューブリンをMTに重合
   1. -80 °C冷凍庫からチューブリンの3 μLアリコートを取り出し、チューブの底を保持して液体相に非常に迅速かつ短時間解凍します。直ちに氷の上に置き、少なくとも3分間インキュベートします。
   2. 2x重合ミックスの3μLを穏やかに層化し(表2に詳述したレシピ)チューブリン溶液の上に置く。チューブを軽くフリックして混ぜるが、せん断力がMTの核と伸びを妨げる可能性があるため、ピペッティングによって混合しないでください。
   3. 37°Cの水浴で30分間混合物をインキュベートします。
   4. RT 1x BRB80の6 μLを上に置き、フリックして混ぜるサプリメント(表2に詳述)を加えます。ピペッティングで混ぜないでください。
   5. 混合物を37°Cで少なくとも10分間インキュベートします。
   6. MTアフィニティ精製に進むか、またはTIRFアッセイを行う場合は、RTで一晩暗闇の中でMTをインキュベートして、より長いMTを形成する。
   7. RTで暗闇の中で何週間も重合されたMTを保存します。

4. 微小管(MT)アフィニティ精製

1. 遠心分離による非重合チューブリンの除去
   1. 以下の成分を混ぜて60%のグリセロールクッションを作ります:1x BRB80(サプリメントなし、表2に詳述されているレシピ)、20 μMタキソール(DMSOに溶解)、1 mM DTT、および60%グリセロール。
   2. グリセロールクッションの60μLを超遠心管に移します。標識されていないMTの12μLを緩やかに層化し、以前にクッションの上に重合した。MTのせん断を防ぐために、カットピペットチップを使用してそれらを転送します。
   3. 22°Cで約97,300 x gで混合物を遠心分離し、15分間使用します。スピン後、過剰なチューブリンは一番上の液体層に残り、MTは底部にペレットを形成する。ペレットが肉眼で見えない場合があるため、ペレットを見つけるのに役立つスピンの前にチューブの外側の端をマークします。
   4. グリセロールクッションの上の液体層(~12μL)を慎重に取り外し、SDS-PAGE分析のために10μLを節約します。
   5. 液体層とクッションの間のインターフェースを1x BRB80の20 μLで軽く洗い流します。20 μL リンスを取り外して廃棄します。
   6. グリセロールクッション(約60μL)を慎重に取り外し、SDS-PAGE分析のために10μLを節約します。MTペレットの邪魔にならないように注意してください。
   7. 1x BRB80の60 μLでペレットを軽く洗い流します(表2に詳述)。MTペレットの邪魔にならないように注意してください。すす液を破棄します。
   8. カットピペットチップを使用して、タキソール補充リシスバッファー(表3で詳述)の24 μLでMTペレットを再中断します。
2. MTベースの親和性クロマトグラフィーによる機能性モータの精製
   1. -80C冷凍庫から酵母から精製したモーターの50μLアリコートを2つ取り出し、すぐに液体相に解凍します。すぐに氷の上に置きます。
   2. 次の成分を指定された順序で新しい超遠心管に追加し、RTで混合物を10分間インキュベートする:(1)酵母から精製されたモータの100 μL、(2)5x ATP/タキソールミックスの29 μL(表3で詳述)、(3)12μLの精製されたMTsトランカットピペットチップで推測。
   3. 約97,300 x gと22 °Cで15分間混合物を遠心分離します。スピン後、機能性モータは上清中に残り、MTはペレットを形成し、それらに結合された非機能モーターと共に形成する。
   4. 上清を回収し、2μLのアリコートでフラッシュフリーズし、-80°Cで保存します。
   5. SDS-PAGE分析用の上清を10μL保存します。SDS-PAGE分析用に1x BRB80の141 μLでペレットを再ステースします。アクチンなどのタンパク質規格を使用して、以前に詳細に説明したように精製されたモータの濃度を定量するための標準曲線^{を作成します。}
   6. ステップ 6.1.3 でモータをシャーシに結合する場合は、この濃度情報を使用します。

5. セグメント化されたDNA折り紙シャーシの生産

1. シャーシの形成
   1. 以前に公開された表⁸に記載されている主食のオリゴヌクレオチドを、トリスバッファーの 250 μM で濡れ、または乾燥してからトリスバッファーで 250 μM に再サスペンドします。
   2. 各コアステープルの5 μLを混合することにより、コアステープルのプールを作成します(ドリラー-コランジェロ2016⁸の表S1を参照)。
   3. 各リンカーステープルの5 μLを混合することにより、リンカーステープルのプールを作成します(ドリラー-コランジェロ2016⁸のリンカーステープルテーブルを参照)。
   4. 各蛍混ぜ物ハンドルステープルの5 μLを混合することにより、蛍眼結合ステープルのプールを作成します(ドリラー・コランジェロ2016⁸の蛍機管テーブルを参照)。
   5. 以下のコンポーネントと50 μL折りたたみ反応を混合: 1x折りたたみバッファー;100 nM 8064 足場;600 nMコアステープルプール。600 nM蛍煙素のステープルプール;9 μM蛍煙素鎖(ドリラー・コランジェロ2016⁸の蛍機防止アンチハンドルテーブルを参照)。各モータ結合部位について、4.2 μM拡張ハンドルストランドまたは必要に応じてハンドルのない600 nMストランドのいずれか(ドリラー・コランジェロ2016⁸のモータハンドル/アンチハンドルステープルテーブルを参照)。所望の600 nMリンカー⁸;追加 6 mM MgCl₂;と水。
   6. 次のプログラムを使用して熱サイクラーで折る:80 °Cに急速加熱し、75分にわたって65°Cに単一度増分で冷却し、その後、17.5時間にわたって30°Cに単一度で追加の冷却。
   7. 0.5x TBEバッファーの2%アガロースゲルのアッセイ折りたたみ品質(レシピの表4参照)は、11mM MgCl₂およびDNAゲル染色を補充した(材料の表を参照)。0.5x TBEバッファーでゲルを実行し、70 Vで11 mM MgCl₂を60〜90分間実行し、氷水浴または冷たい部屋でゲルを実行し、過度の加熱およびその後のシャーシ構造の退化を防ぎます。
   8. ステップ5.1.7で使用するDNAゲル染色に適した条件を用いてゲルを画像化する。
2. シャーシの精製
   1. 精製前日の午後遅くに、遠心管内の1x折り紙折りたたみバッファーに45%、40%、35%、30%、25%、および15%のグリセロールをそれぞれ80μLを穏やかに重ねてグリセロール勾配を作成します(レシピの表4参照)。レイヤー間の境界は少し見える必要があります。
   2. 一晩4°Cでグラデーションをインキュベートします。
   3. 翌朝、折りたたみシャーシ溶液に1x折り紙折りたたみバッファーに45%のグリセロールを加え、最終的な濃度10%のグリセロールを加えます。遠心管の勾配の上に穏やかに混ぜて層を混ぜます。
   4. シャーシを 243,000 x gで回転し、4 °C で 130 分間回転させます。
   5. チューブから上から下の方向に50 μLの分画を収集します。
   6. 11 mM MgCl₂およびDNAゲル染色を補充した0.5x TBEバッファーに2%のアガロースゲルを鋳造する。
   7. ゲル上の各画分の5 μLをロードし、70 V.70 V.で90-120分のために11 mM MgCl₂を補充した0.5x TBEバッファーでゲルを実行し、過度の加熱およびその後のシャーシ構造の退化を防ぐために冷たい部屋でゲルを実行します。
   8. ステップ5.2.6で使用するDNAゲル染色に適した条件を用いてゲルを画像化する。
   9. 組み込みされていないステープルを含まない、折りたたまれたモノマー構造を示す将来の実験用に分数を選択します。
   10. 260 nmでの紫外線吸収などの適切な分光法を用いて選択された画分の定量濃度を定量した。ステップ 6.1.3 でモータをシャーシに結合する場合は、この濃度情報を使用します。

6. スライドアッセイチャンバーの作成

1. 両面テープの2つのストリップをガラススライドに貼り付け、カバースリップを上に置くことによってスライドアッセイ室を作ります。部屋はカバースリップとガラススライドの間に挟まれた狭いスペースで、テープの2つのストリップによって側面に囲まれています。図1はアッセイ室を示す。
2. 溶液でスライドを準備する場合は、ピペットを使用して一方の側からチャンバーに流体を流し、フィルターペーパーのストリップを使用して、反対側の流体の流れを収集します。

7. モーターアンサンブル運動性TIRFアッセイ

1. DNAシャーシへのモータの結合
   1. 氷上で、DTT補充BRB80、タキソール補充リシスバッファー、カゼインタキソール補充リシスバッファー(表5に詳述)の各新鮮な1 mLを調製する。各バッファーの 200 μL を RT チューブに転送します。
   2. 氷の上で、冷たいカゼインタキソル補充リシスバッファーを使用して、4倍のエネルギーと4倍のスカベンジャーミックスを調製します(表5に詳述)。
   3. 氷上の5 μLで~300 nM精製モータの10 μLを15~30分間氷上でインキュベートします。これらのモータ濃度は、このインキュベーション時間のためにシャーシのモータ結合部位を飽和させるために示されています。
      注:モータの占有率は100%ではなく、個々のシャーシ^構造8、28のハンドルステープルが確率的に欠落している可能性があります。
   4. インキュベーション中に、RTタキソール補充リシスバッファーでビオチンおよび蛍油標識MTを希釈し、以下の手順に従ってサイズ排除カラムクロマトグラフィーに適したゲル濾過樹脂を調製する。
2. モータシャーシコンジュゲートからの余分なモーターの取り外しサイズ除外カラムクロマトグラフィー
   1. 50 mLの円錐管で、dH 2 Oの45 mLでゲル濾過樹脂2xの5mLを洗浄する。洗浄ごとに円錐管に水と樹脂を混ぜ、460 x gで1分間回転させます。
   2. 上記と同じ方法で、1xリシスバッファー(表5に記載のレシピ)の45mLで樹脂2xを洗浄します。
   3. 洗浄樹脂を1xリシスバッファーで1:1比で再停止し、樹脂がバッファー内で約50%のスラリーになるようにする。洗浄樹脂は、少なくとも1ヶ月間4°Cで保存することができる。
   4. 樹脂懸濁液の800μLをスピンカラムに移します。余分なバッファーを重力の流れで 5 分間排出します。 最終的な樹脂容積は約350-400 μLである必要があります。
   5. カゼインタキソル補充リシスバッファーでモーターシャーシミックスを50μLの最終容積に希釈し、希釈したミックスを樹脂を詰めたスピンカラムに移します。
   6. スピンカラムを6sの1,000 x gで遠心分離します(今回は加減速時間を含みます)。ろ過を保存して純粋なモーターシャーシコンジュゲートを収集し、余分なモーターを保持するカラムを廃棄します。
3. イメージング用スライドの準備
   1. 1mg/mLのビオチン化牛血清アルブミン(ビオチン-BSA)の13 μLをスライドアッセイ室に流す。BSAをガラスに結合できるように2分間インキュベートする。
   2. チャンバーの片側のバッファーに流れ、余分な液体をフィルターペーパーのストリップを使用して反対側から離れてウィッキングすることにより、RT DTT補充BRB80の20 μLでチャンバ2xを洗浄します。
   3. 0.5 mg/mL連鎖化ビジンの20 μLの流れ。BSA上のビオチンへのストレプトアビジンの結合を可能にするために2分間インキュベートする。
   4. RTタキソール補充リシスバッファーの20 μLでチャンバー2xを洗浄します。
   5. カットピペットチップで希釈されたMTの20 μLで穏やかに流れます。MTとストレプトアビジン上のビオチン間の結合を可能にするために2分間インキュベートする。
   6. RTカゼインタキソル補充リシスバッファーの20 μLで2xを洗浄します。カゼインがチャンバー全体に浸透できるように2分間インキュベートする。
   7. 精製されたモーターシャーシコンジュゲートを5x~10xの単分子条件(~10〜100 pM)に希釈し、タキソール補充リシスバッファーを使用します。次のコンポーネントを混ぜ合わせて、モータシャーシ希釈の 10 μL、4 倍のエネルギーミックスの 5 μL、4x スカベンジャー ミックスの 5 μL を生成します。
   8. 最終モータシャーシ混合物の20 μLをアッセイスライドチャンバに流し、TIRF顕微鏡検査に進みます。
4. イメージングとデータ取得
   1. TIRF顕微鏡でスライドをすぐにイメージします。通常、各スライドは 30 ~ 60 分間使用できます。
   2. MTチャンネルで静止画を取得し、シャーシチャンネルでムービーを取得します。このプロトコルのモータの場合、フレームレートが0.5fps、露出時間が200ミリ秒の10分のムービーが適しています。
   3. シャーシムービーから、ImageJまたは同様の画像処理^{ソフトウェア29}で各MTに対して1つのキモグラフを生成する。kymograph³⁰上の走行の傾きと水平距離を測定することにより、モーターシャーシアンサンブルの速度と走行長を分析します。

結果

モータおよびシャーシ構造の精製に成功し、ゲル電気泳動によってアッセイされた。SDS-PAGE分析は、ステップ2.3.7で収集された最終的な濾過物が〜350 kDaの位置で明確で鋭いバンドを示したように、酵母からのダインの抽出に成功したことを確認した(図2)。予想通り、このダインバンドは、不要なタンパク質を除去する流れと洗浄、およびダイン?...

ディスカッション

DNA折り紙の分子構築技術は、定義されたアーキテクチャ、モータ番号、およびタイプを持つモータアンサンブルを構築するユニークな方法を提供し、特定のモータ構成から出現する挙動の研究を可能^{にする31。}構造および細胞の研究がチームで働く細胞骨格モーターの例を解明し続けるにつれて、アンサンブルのモーターの生物物理学的および生化学的メカニズムを分離し?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Round Bottom Tube	USA Scientific	1620-2700
Biotin labeled tubulin protein: porcine brain, >99% pure	Cytoskeleton.com	T333P-A
Biotin-BSA	Sigma	A8549-10MG
Bottle Assembly, Polycarbonate, 250 mL, 62 x 120 mm	Beckman Coulter	356013
Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate, 10.4 mL, 16 x 76 mm	Beckman Coulter	355603
Centrifugal Filter Unit	Millipore Sigma	UFC30VV00
IgG Sepharose 6 Fast Flow, 10 mL	GE Healthcare	17096901
Micro Bio-Spin Chromatography Columns, empty	Bio-Rad	7326204EDU
P8064 Scaffold	Tilibit	2 mL at 400nM
Poly-Prep Chromatography Columns	Bio-Rad	731-1550
ProTev Protease	Promega	V6101
Scotch Double Sided Tape with Dispenser	amazon.com	N/A
Sephacryl S-500 HR	GE Healthcare	17061310
Streptavidin	Thermo Fisher	434302
SYBR Safe DNA stain	Invitrogen
Tubulin protein (>99% pure): porcine brain	Cytoskeleton.com	T240-B
Tubulin, HiLyte 647	Cytoskeleton.com	TL670M-A
Ultra-Clear Centrifuge Tubes	Beckman Coulter	344090