ヒト胚性幹細胞から脳オルガノイドを生成するための静的自己指向法

要約

このプロトコルは、脳細胞の多様性と細胞組織の多くの特徴を維持しながら、外因性成長因子または基下膜マトリックスを用いることなく、単純化された低コストの方法で脳オルガノイドを生成する手段として生成された。

要約

胚性幹細胞から分化したヒト脳オルガノイドは、3次元系における複数の細胞型の複雑な相互作用を研究するユニークな機会を提供する。ここでは、脳オルガノイドを生み出す比較的簡単で安価な方法を紹介します。このプロトコルでは、ヒト多能性幹細胞は単一細胞の代わりに小さなクラスターに分割され、異種基圧膜マトリックスまたは外因性成長因子を持たない基礎培地で増殖し、本質的な発達の手掛かりを形作ることを可能にする。オルガノイドの成長。この単純なシステムは、グリア細胞やミクログリア細胞、幹細胞、前脳、中脳、後脳のニューロンなど、さまざまな脳細胞型を作り出します。このプロトコルから生成されたオルガノイドは、明視野画像、組織学、免疫蛍光およびリアルタイムの定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって示される適切な時間および空間組織の特徴を示す(qRT-PCR)。これらのオルガノイドは脳の様々な部分の細胞型を含んでいるので、多くの疾患の研究に利用することができます。例えば、最近の論文では、このプロトコルから生成されたオルガノイドを使用して、低酸素が人間の脳に及ぼす影響を研究する方法を実証しました。このアプローチは、神経発達障害、遺伝性疾患、神経疾患などの研究が困難な配列を調査するために使用することができます。

概要

無数の実用的および倫理的な制限のために、人間の脳を研究する上で非常に困難がありました。げっ歯類を利用した研究は人間の脳の理解にとって重要でしたが、マウスの脳には多くの異種があります^。興味深いことに、マウスは霊長類脳^3、4よりも少なくとも7倍少ないニューロン密度を有する。霊長類は進化的な観点からげっ歯類よりも人間に近いですが、ほとんどの研究者が一緒に働くのは現実的ではありません。このプロトコルの目的は、脳細胞の多様性と細胞組織を維持しながら、異種の基下膜マトリックスまたは外因性成長因子を必要とせずに、簡略化された安価な方法を使用して人間の脳の多くの重要な特徴を再現することであった。

サザイ研究室からの造形研究は、胚体の血清自由培養(SFEBq)法を用いて、シグナル化胚性幹細胞(ESC)5,6から2次元および3次元神経細胞型を生成した。多くのヒト脳オルガノイド法は、シグナル化された^ESC7から比較的類似した経路をたどってきた^{、 8}.対照的に、このプロトコルは、外因性成長因子¹¹の追加前のパスカ研究所の脳オルガノイドプロトコルの^{初期段階と}同様に、トムソンおよび張研究所の精液作業の初期段階と同様に、分離されたヒトESC(hESC)のクラスターから始まる。下地膜マトリックス(例えば、マトリゲル)は、多くの脳オルガノイドプロトコルに利用されており、有効な足場⁸であることが示されている。しかし、最も一般的に使用される基下膜マトリックスは、生産¹²のバッチ変動にバッチで未知の量の成長因子と共精製するので、合併症なしでは来ない。さらに、これらのマトリックスは、画像化を複雑にし、汚染およびコストのリスクを高めることができます。

人間の脳オルガノイドは多くの質問に答えるために使用することができますが、心に留心する特定の制限があります。一つには、胚性幹細胞から始まり、オルガノイドは老化した脳よりも未熟な脳によく似ているため、アルツハイマー病のような老年期に起こる疾患の理想的なモデルではない可能性があります。第二に、我々のプロトコルは、脳の前脳、中脳および後脳のマーカーを発見し、協調して複数の脳領域からの細胞に対する治療または疾患の効果を研究するのに有用であるが、他のプロトコルは、特定の脳領域^13、14に集中するために従うことができる。最後に、オルガノイドモデルのもう一つの制限は、大きさのものであり、人間の脳の平均長さは約167mmであり、攪拌を用いて作られた脳オルガノイドは4mm⁸まで成長し、このプロトコルによって形成されたオルガノイドは1〜2週間に成長する。それにもかかわらず、このプロトコルは、ヒトの脳組織および複数の細胞型の相互作用を研究するための重要なツールを提供する。

プロトコル

1. 幹細胞のメンテナンス

1. 製造者の指示に従って、H9 hESCを下層膜マトリックス(材料表を参照)を維持する(したがって、単に行列と呼ばれる)。
   1. 1つの6ウェルプレートまたは1つの1つの1つの1つの10 cmの皿をコーティングするには、氷冷Dulbeccoの修正イーグル媒体(DMEM)/F12メディアの5.9 mLとマトリックスの100 μLを組み合わせます。プレートをパラフィンフィルムで包み、4°Cで一晩保存します。超過マトリックス/メディアが吸引された後、次の日に細胞を通過するためにそれらを使用してください。
2. 週~週に培養した細胞を、7日毎に約1:12の分割比で培養する。mTESR-1培地を使用して、酸素インキュベーター(5%O2、CO2 5%)で細胞を維持します。毎日メディアをリフレッシュします。ガラスツールを使用して、通路間の培養細胞を分離した。
3. H9細胞は、オルガノイドを産生するためにそれらを利用する前に4〜6日に継代するべきである。細胞は、細胞クラスターの約1:8の比率で継代にする必要があります。これを行うには、まずDMEM F12培地で細胞をすすぐ、中性プロテアーゼ(例えば、デスパーゼ、単にプロテアーゼと呼ばれる)で細胞を解ソシエートし、DMEM/F-12でリンスし、4プレート(6ウェルまたは10cm)の4プレート(6ウェルまたは10cm)のプレートを20%にまたいでプレートを30〜60細胞クラスターとしてプレートする。収穫の2日前に、それらを通常のインキュベーター(21%O2、5%CO2)に移行する。オルガノイド形成を開始する場合、プレートは80%の合流率に達するはずです。

2. オルガノイド文化のためのhESCの解離

1. プロテアーゼストック溶液(5 U/mL)をアリコートする。
   注:我々は通常、数ヶ月にわたって使用するために-20 °Cで1 mLアリコートを凍結します。
2. hESCの6ウェルまたは10cmプレートごとに、ストック溶液1mLにDMEM/F12を加えたプロテアーゼストック溶液を、動作濃度に希釈します。
3. 細胞培養培地を吸引除去し、次いでプロテアーゼ溶液でhESCを覆う。インキュベーターにプレートを10〜15分間置くか、コロニーの端が切り上がり、マトリックスから分離し始めるまで置きます。
4. プレートを傾け、プロテアーゼ溶液を吸引し、DMEM/F12で細胞を3回軽く洗浄します。6ウェルプレートを使用する場合は各洗浄に2mL/ウェルを使用し、10cmプレートを使用する場合は6 mLを使用します。この手順を実行する際は、コロニーがマトリックスに付着していることを確認してください。
5. 各ウェルに約1.5 mLの新鮮なmTESR培地を戻し(または10cmプレートの場合は5 mL)、穏やかなピペッティングを使用して細胞をプレートから洗い流します。
6. 10 mLピペットを使用して、元のサイズの約1/30^に達するまで、プレート内で静かに吸引し、hESCを分配します。コロニークラスターは、これらのステップの完了時に〜250〜350 μmの正方形に似ているはずです。

3. オルガノイドの生成

1. 細胞を、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を伴わないmTESR培地の30mLを含む単一の超低結合T75フラスコに移す。
2. 翌日、フラスコを傾けて、生細胞が隅に溜るようにします(これは初日に5〜10分かかるかもしれませんが、クラスターが大きくなるにつれて速くなります)。
   注: このステップまたは後続のステップでフラスコの底に付着した細胞が多数ある場合は、その細胞を新しいフラスコに移します。最初の2日間は死細胞の集団が多いのが普通です。メディアの変更を行う場合は、できるだけ多くの細胞の破片を除去するようにしてください。
3. 細胞が沈降したら、生細胞を含む培地の約10mLを残して培地および死細胞を吸引する。
4. 低bFGF培地(DMEM/F12を1x N2、1x B27、1x L-グルタミン、1x NEAA、0.05%ウシ血清アルブミン(BSA)、および0.1mMモノチオグリセロール(MTG)を加える30 ng/mL bFGFを加える。
5. 2日目にセルを確認します。細胞のほとんどが健康で明るく見える場合, 何もする必要はありません。.しかし、細胞の3分の1以上が暗く見える場合は、20ng/mL bFGFを補充した20mLの低bFGF培地にメディアを交換してください(ステップ3.2と同じ傾きの手法を使用)。
6. 3日目に、半分の培地(ステップ3.2の傾き技法を使用)を10ng/mL bFGFを補う低bFGF培地の20 mLに置き換えます。
7. 5日目に、半分の培地(ステップ3.2の傾き技術を使用)を20 mLのニューラル誘導媒体(NIM:DMEM/F12、1x N2サプリメント、0.1 mM MEM NEAA、2 μg/mLヘパリン)に置き換えます。
   注: 他の細胞やオルガノイドの大きなクラスターが他のものよりもはるかに大きい場合は、培養から削除する必要があります。サイズは顕微鏡下での外観によって推定される;例えば、レチクル付き接眼部を使用する。オルガノイドの大部分は、同様の大きさ(約100±20μm)です。私たちは、他のものよりも約2倍小さいか大きいオルガノイドを取り除いた。
8. 半分の培地(15 mL)を(傾きのテクニックを使用して)NIMを1日おきに交換してください。
9. 培養で3週間後、100xペニシリン/ストレプトマイシンを培地に加え(NIM:DMEM/F12、1x N2サプリメント、0.1 mM MEM NEAA、2 μg/mLヘパリン)を必要に応じて1xの最終濃度で加えます。1 日おきにメディアを更新します。
   注:この方法では、文化の中で最大6ヶ月間オルガノイドを維持しました。

4. RNAの抽出と準備

1. 10 mLピペットを使用してフラスコから約15個のオルガノイド(大きさに応じて)を軽く抽出し、1.5mLのチューブに入れします。
   1. 遠心分離機(1分間200xg)でオルガノイドを穏やかにペレットし、1xダルベッコのPBS(DPBS)を3回リンスします。
2. 検証済みのシステムまたはプロトコル(例えば、RNeasyキット)を使用してRNAを抽出します。
3. 260 nm および 280 nm で各サンプルの光学密度値を測定します。
4. 検証済みのシステムまたはプロトコル(例えば、iScript cDNA合成キット)を使用してcDNAを準備します。
5. 少なくとも1つのハウスキーピング遺伝子を含む事前検証済みのプライマー(表1)を用いてqRT-PCRを行う。

5. 免疫学化学

1. 固定
   1. 4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液を調製し、それを4°Cに置きます。
   2. 滅菌カミソリを使用して、滅菌転送ピペットの先端を切り取ります。
   3. 特に大きくなると簡単に分解できるため、カットトランスファーピペットを使用してオルガノイドをそっと抽出し、追加の培地またはDPBSを備えた6ウェルプレートに配置します。
   4. プレートを傾け、培地を吸引し、1x DPBSに交換します。1x DPBSで細胞を2回さらにリンスします。
   5. DPBSを4%PFA溶液に交換し、4°Cのシェーカーに置きます。
      注:2日間(小さなオルガノイドの場合)から7日間(オルガノイド>3ヶ月)を修正しましたが、より短い時間(例えば、16〜24時間)も可能です。
   6. DPBSで30%、20%および10%のスクロース溶液を調製してください。
   7. PFAで固定した後、10%のスクロース溶液に交換し、24時間4°Cのシェーカーに置きます。
   8. 10%のスクロースを20%のスクロースに交換し、24時間4°Cのシェーカーに置きます。
   9. 20%のスクロースを30%のスクロースに交換し、24時間4°Cのシェーカーに置きます。
2. 凍結されたセクション
   1. ドライアイスの平らな層を準備し、その上にラベル付きのプラスチック製の金型を配置します。
   2. 最適な切削温度媒体(OCT)の薄い層を金型に注ぎ、(数秒以内に)硬化を開始します。
   3. チップを切り落としたトランスファーピペットを使用して、型のOCTの上部にいくつかのオルガノイドを置き、オルガノイドの位置に細心の注意を払います。
   4. モールドがいっぱいになり、オルガノイドが覆われるまで、OCTでゆっくりと追加します。さらに10分間は完全に硬化させます。
      注:10分以上凍結すると、断絶のための複数のオルガノイドの理想的な相対配置が保証されますが、エタノールドライアイスミックスまたは液体窒素を使用してより迅速に凍結することが可能です。
   5. 切り取るときに見つけやすくするために、オルガノイドの相対的な位置をマーカーでマークします。
   6. カビを袋または箱に入れ、切り取り部を切る準備ができるまで-80°Cで保管します。
   7. クライオスタットを使用して、10 μmの切片をスライスし、その組織を標識された正の帯電スライドに置きます。
3. 染色
   1. ブロッキング溶液(0.3%トリトンX-100、PBS中の4%正常ロバ血清)を準備します。
   2. 組織の周囲に描画するために疎水性パップペンを使用してください。
   3. 各5分間PBSでスライドを3回リンスします。
   4. PBSを室温で1時間ブロッキング溶液に交換してください。
   5. ブロッキング溶液を抗体溶液(抗体を適切な濃度で、0.1%トリトンX-100、PBS中の4%正常ロバ血清)で一晩4°Cに置き換える。
   6. 翌日、スライドをPBSで3回洗浄し、それぞれ10分間洗浄します。
   7. PBSを、室温で1時間の抗体溶液中で希釈した適切な二次抗体(適切な濃度で)に置き換える。
   8. 1x PBSで毎回10分間3回すすります。
   9. 4',6-ジアミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)の染色を適用し、1x PBSでそれぞれ10分間3回リンスします。
   10. 貼り付け液でスライドの前にリップを覆い、暗所で室温で乾燥させ、4°Cで暗闇の中に保管します。

結果

図1は、プロトコルの異なる段階を通して細胞/オルガノイドがどのようなものかを示すいくつかの時間点の代表的な明視野画像を示す。hESCを組織培養プレートから取り出し、小片に分割し、T75超低付着フラスコに入れ、そこで球体を形成した。これらのクラスターの中心に暗く死にかけている細胞を含めずに、細胞のサイズが明るく似ている点に注意することが重要で?...

ディスカッション

他のオルガノイドモデルと同様に、これはいくつかの注意点が付属している人工システムです。全体的な発現レベルの点でバッチ変動にバッチはほとんどなかったが、個々のオルガノイドは違いを示さなかった。例えば、Sox-2正の領域の位置は、すべてのオルガノイドで同一ではなかった(図3)。qPCRは細胞のバッチの全体的な変化を探すために適しているが、単一細胞RNAEqのような...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	A11029
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	A11035
B27 Supplement	Gibco, Waltham, MA, USA	17504-044
bFGF	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	PHG0263
BSA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	A9647
BX43 microscope	Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan
DAPI stain	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	D1306
Dispase	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	07913
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	11330-032
DPBS	Gibco, Waltham, MA, USA	10010023
FluroSave	MilliporeSigma, Burlington, MA	345789
GFAP antibody	NeuroMab, Davis, CA	N206A/8
Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix)	Corning, Corning, NY, USA	356231
H9 hESCs	WiCell, Madison, WI, USA	WA09
Heparin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	9041-08-1
iQ SYBR Green Supermix	Bio-Rad, Hercules, CA, USA	1708880
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad, Hercules, CA, USA	1708891
L-glutamine	Gibco, Waltham, MA, USA	25030-081
Monothioglycerol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M6145
mTESR media	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	85850
N2 NeuroPlex	Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA	400-163
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	ND-2000
NEAA	Gibco, Waltham, MA, USA	11140-050
Normal Donkey Serum (NDS)	ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA	017-000-121
OCT	Sakura Finetek, Torrance, CA, USA	25608-930
PFA	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA	RT15710
qPCR machine	Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA	1855196
RNeasy kit	Qiagen, Hilden, Germany	74104
Sox2	MilliporeSigma, Burlington, MA	AB5603
TMS-F microscope	Nikon, Melville, NY, USA
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T8787-100ML
Ultra-low attachment T75 flasks	Corning, Corning, NY, USA	3814