ユビキチンおよびユビキチン様依存性翻訳後修飾のプロファイリングと有意な変化の同定

要約

このプロトコルは、治療または表現型などの特定の状態に関連するこれらの種類の翻訳後修飾(PTM)の変化を同定するために、ユビキチン(Ub)およびユビキチン様(Ubls)特異的プロテオームを確立することを目的としています。

要約

ユビキチン(ub)およびユビキチン様(ubl)依存性タンパク質の翻訳後修飾は、タンパク質の安定性、活性、相互作用、および細胞内局在を制御することにより、細胞内の基本的な生物学的調節的役割を果たします。それらは細胞が信号に応答し、環境の変化に適応することを可能にする。これらのメカニズム内の変更は、神経変性疾患や癌などの深刻な病理学的状況につながることができます。ここで説明する技術の目的は、培養細胞株からub/ubls依存PTMプロファイルを迅速かつ正確に確立することです。異なる条件から得られた異なるプロファイルの比較は、例えば治療によって誘発されるような特定の変化の同定を可能にする。レンチウイルス媒介細胞伝達は、修飾剤(ユビキチンまたはSUMO1またはNedd8のようなubl)の2タグ(6HisおよびFlag)バージョンを発現する安定な細胞株を作成するために行われる。これらのタグは、ユビキチンの精製を可能にし、したがって、細胞からのユビキチン化タンパク質の。これは 2 段階の精製プロセスを通じて行われます: 最初の 1 つは 6His タグを使用して変性状態で実行され、2 番目のタグは Flag タグを使用してネイティブ状態で実行されます。これは、その後、液体クロマトグラフィーによって同定され、半定量され、タンデム質量分析(LC-MS/MS)技術が続く、非常に特異的かつ純粋な修飾タンパク質の単離につながります。Excelソフトウェアを使用したMSデータの容易な情報分析により、バックグラウンド信号を排除することでPTMプロファイルの確立が可能になります。これらのプロファイルは、標準的な生化学技術による検証から始めて、より具体的に研究される特定の変化を識別するために、各条件間で比較されます。

概要

ここで提案される方法は、特定の状態(治療、分化など)に関連する潜在的な変化を同定するために、培養哺乳動物細胞からユビキチンファミリーメンバーによって媒介されるPTMを研究することに専念している。PTMはタンパク質の機能の調節の最後のステップ^{を表す 1}.実際、一度翻訳機械によって製造されると、ほとんどのタンパク質は、その活性、分子相互作用、および細胞内^位置1を調節する異なる種類のPTMを受けるわけではない。PTMの多くは、タンパク質のユビキチンファミリーによって媒介されるもの、ユビキチン自体およびすべてのユビキチン様、細胞内または部分的に細胞質タンパク^質2を調節する可能性を有する。それらはそれ自体がタンパク質であるため、互いに共役することができ、多様なトポロジの均質および異種鎖を形成し、それぞれが特定の調節機能^{に関連する2。}この複雑な機械を解読し、理解するためには、ツールが必要です。多くのアプローチは、独自の長所と短所を持って、世界中で開発され、ここでは培養細胞に適した高性能なものを提案します。

この方法の主な利点は、その精度です。実際、単離された修飾タンパク質の純度は、2つのタグ(6HisとFlag)と2つのステップ手順の組み合わせ使用によって高度に改善され、したがって、単一のタグ融合Ub/Ubl^3、4よりもはるかに選択的である。6Hisタグの存在は、完全変性状態での精製の第一段階を可能にし、それによってユビキチン結合ドメインまたはユビキチン化されたものに結合する他のタンパク質を含むタンパク質の共精製を回避する。これは、特異的^抗体5またはタンデムユビキチン結合要素(TUBEs)6のいずれかを用いたユビキチン化プロテオームの親和性精製に基づく他のいくつかのアプローチによって遭遇する技術的問題である。重要なことに、この技術は、モノおよび異なる種類の多言語の両方^が7を同定したので、いくつかの他のアプローチの場合と同様に、特定のタイプのユビキチン化の精製を支持するバイアスではない。したがって、いったん発見されると、ユビキチン化の変化は、関連するユビキチン化の正確な種類を特定するために、標準的な生化学的アプローチによってより詳細に検討されなければなりません。

最後に、このプロトコルのもう一つの技術的な利点は、レンチウイルスの使用であり、それは容易かつ迅速に、正常な細胞挙動を妨げることなく、タグ付き修飾剤の妥当なレベルの発現を有する安定した発現細胞株を作成する。

ユビキチン化の重要な役割の1つはプロテアソーム分解のためのタンパク質を標的とすることであるのに対し、潜在的に最も細胞内または部分的に細胞内タンパク^質1に対する他の多くの調節特性を有することが知られている。これらの機能の数は、タンパク質のような多くのユビキチンの存在によってさらに増強され、ほぼすべての細胞機構を調節するタンパク質のファミリー^{を形成する1.}彼らの改変は、細胞生物学に大きな影響を与える可能性があり、^癌9のような病理学的^状況8を導いたり、参加したりすることができる。したがって、ツールは、この広大な風景を探索し、新しい治療目標として役立つことができる病理学的状態に関連する変化を識別するために必要とされます。

このプロトコルは、励起タグ付き Ub/Ubl を発現するために伝達する必要があるため、培養中の細胞専用です。これらの安定した細胞株を作成すると、2Dまたは3Dまたは異種移植片の培養物からUblプロファイルを生成し、PTMプロファイルの研究に適用できるさまざまな実験モデルの地平線を拡張することができます。

プロトコル

1. 6His-Flag-Ublを発現する安定細胞株の生成

注:pCCL-6HF-Ubl、pVSVGおよびデルタヘルパーを用いたHEK-293T細胞の共トランスフェクション。

1. 0日目:6ウェルプレート中の種子293T細胞は、翌日に50〜70%の合流を得た。
2. 1日目:pCCL-6HF-UblまたはpCCL-GFPの1μg、pVSVGの1μgおよびデルタヘルパーベクターの1μgを組み合わせた50〜70%のコンフルエントセルを、レンチウイルス製造のためのトランスフェクション試薬およびプロトコルを使用する。トランスフェクションの6時間後、培地を形質転換する細胞に対応する新鮮なものに変える。6ウェルプレートに形質導入される細胞を播種し、翌日(転起開始日)に10〜20%の合流を得た。
3. 2日目:トランスフェクション後24時間、レンチウイルス粒子を含む培地を回収し、0.45μmフィルターを用いてフィルターをろ過する。必要に応じて、この時点で新鮮な培地を追加して、レンチウイルスの2番目のバッチを生成します。トランスフェクトされる細胞の培地(10~20%合流)をレンチウイルスを含むものに置き換えます。
   注:レンチウイルス培地は、転移前に数日間+4°Cに保つか、または-80°Cで数ヶ月間保存することができます。
4. 標準インキュベーター(37°、5%CO2)で24時間~72時間の間にレンチウイルスを含む細胞をインキュベートし、新鮮な標準のものの培地を交換します。可能であれば、反転蛍光顕微鏡を用いてGFP発現をチェックし、伝達の効率を評価する:発現細胞の割合と細胞当たりの相対的な発現レベル。蛍光が検出されない場合は、形質転換される細胞の種類に応じて発現に時間がかかる場合があるため、さらに2〜3日待ちます。
5. GFP対照が陽性の場合、抗Flag抗体を用いて免疫蛍光およびウェスタンブロットによる6HF-Ublの発現制御を行うのに十分な量を有するまで、すべての細胞を増殖させる。

2. 修飾タンパク質の二重精製

注: バッファー 1: 6 M グアニジニウム HCl, 0.1 M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH 8.0, 0.5% トリトン X-100.
バッファー 2: 50 mM NaH₂PO_4,150 mM NaCl, 1% Tween20, 5% グリセロール, pH 8.0.
バッファ 3: 100 mM NH₄HCO₃, pH 8.0.

1. 細胞リシス:準備ができたら、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を室温(RT)で少なくとも1回洗浄し、細胞リシスに進むか、または、_液体N2でフラッシュ凍結し、-80°Cで保存する。リシスの場合は、RTで15cm皿あたり2mLのバッファー1を追加し、細胞スクレーパーを使用して50 mL円錐遠心管(最終体積約20mL)ですべてのリサートを回収します。
2. 1分間の休止で分離した30sのリサートを3回超音波処理します。
3. 超音波処理されたリザースを15分間15,000 x gで遠心分離します。
4. 細胞ストレーナー(40μm)を使用して新しいチューブに上清を移します。
5. サンプルの濃度を決定し、必要に応じて調整して、同じ量のタンパク質と同じ体積を得ます。50~100mg(MiaPaCa-2細胞の直径15cmの10品)の間のタンパク質の総量を使用してください。
6. タンパク質1mgあたり2μLのビーズを使用して、Ni²⁺-NTAビーズを追加します。
7. RTで2.5時間の間に30 rpmで回転させます。
8. 5分間500×gでビーズをペレット。
9. バッファー1の1 mLでビーズを洗浄し、サンプルを1.5 mLマイクロ遠心管に移し、氷上でチューブを移します。氷または4°Cですべての次のステップを実行します。
10. 10 mM イミダゾールを含む氷冷バッファー 2 の 1 mL で 2 回洗浄します。
11. 結合タンパク質を溶出するには、250 mM イミダゾールを含むバッファー 2 の 600 μL を追加し、4 °C で 2 時間回転します。
12. 500 x gで遠心分離してビーズをペレット化し、新しい予冷された 1.5 mL チューブに上清を移し、50 μL の抗フラグ M2 抗体コンジュゲートビーズを追加します。
13. 30 rpmで4°Cで2.5時間回転させ、バッファ2の500 μLで2回洗浄し、次いでバッファ3の500 μLで2回洗浄します。
14. 最終的な溶出には、0.1μg/μLのフラグペプチドを含むバッファ3を100μL加え、4°Cで1.5時間回転させます。
15. 500 x gで1分間遠心分離し、新しい予冷チューブに上清を移します。
16. SDS-PAGEに10%(10°L)を取り、ゲルの銀染色を行い、精製品質を制御します。精製が良好に見える場合は、LC-MS/MSが残した90%を分析します。

3. 質量分析データの処理により、Ub/Ubls PTM のプロファイルを生成し、それらの間の有意な相違点を特定する

注:MS分析の結果には、各サンプルで同定された各タンパク質の合計数のペプチドとピーク面積値(TOP 3ペプチド^領域10の平均)を含む多くの情報が含まれています。これらのデータは、ペプチド数数またはピーク面積値、あるいはその両方を用いて処理することができる。ピーク面積を使用した計算では、これらの値は通常10⁶の範囲にあるため、以下と同じ式を適用する前に、この順序で除算する必要があります。カウントの両方の方法論で得られた結果は、通常と同様に強い相関関係を示す必要があります。同定されたタンパク質ごとに、次の式を使用します。
非処理ユビキチン試料中のv1ペプチド値(例えば、Ub - 薬物)
ゲムシタビン処理ユビキチン試料中のv2ペプチド値(例えば、Ub+薬物)
非処理対照GFP試料中のk1ペプチド値(例えば、GFP - 薬物)
ゲムシタビン処理コントロールGFP試料中のk2ペプチド値(例えば、GFP+薬物)。

1. 正規化: 次の式を使用して、ユビキチンと GFP の薬物処理細胞と未処理細胞の間の値を正規化します。正規化 v = V および正規化された k = K.
   V1=v1.(≥v1+ ≥v2) / (2. v1) ;V2=v2.(≥v1+ ≥v2) / (2. ≥v2)
   K1=k1.(≥k1+ ≥k2) / (2. ≥k1) ;K2=k2.(≥k1+ ≥k2) / (2.
2. 背景の除去:次の式を使用して、ユビキチンサンプルの値から対照サンプル(GFP)の値を減算し、両方の条件で同定されたタンパク質ごとに特定の値(V'1およびV'2)を得る。
   V'1=V1-K1 の場合 V1-K1≥0;V'1=0 (V1-K1<0 の場合)
   V'2=V2-K2 の場合 V2-K2≥0;V'2 =0 の場合 V2-Lt;0
3. ユビキチンの変動(Var)。薬物によって誘導されるPTMの正と負の変動のスコア(-100と+100の間)を得るために、処理されたサンプルと未処理サンプルの特定の値の差を、以下のものを含むすべての値の合計で除算する次の式を使用します。制御(コントロールGFPでも同定されたタンパク質を罰する)を、100を掛ける。
   Var = (V'2-V'1)/(V1+K1+V2+K2)*100 ;-100-50 (PTM の抑圧) または 50 を超えるバリエーション (PTM の誘導) は、通常、有意と見なされます。
4. 自信(Conf)。0 ~ 100% の信頼度値を取得するには、次の式を使用します。
   Conf = ((V1+V2)²/(1+V1+V2+K1+K2)²(*100 - 100/(1+V'1+V'2) ;値 0 (<0)
   50 を超える値は、通常、自信を持っていると見なされます。
5. 誘導/抑圧値のより良い分布を取得し、変動パラメータと信頼パラメータの両方を考慮するには、V VarとC Confの次の式を使用してVarとConfの値を乗算します。
   =SI(V2>0;((V2*C2)^2)/(10^6);-(V2*C2)^2)/(10^6))
   注:ピーク面積の値は通常、ペプチドカウントよりも正確であるため、ペルセウス(https://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus)のようなこの種のデータの解釈に特化した特定のソフトウェアを使用することが可能です。使用の推奨事項。

結果

培養哺乳動物細胞の伝達は、GFPおよび6HF-Ub発現細胞を作成する
MiaPaCa-2細胞をトランスデュースするために後で使用されるレンチウイルスを産生するために、70%コンフルエントHEK-293T細胞は、pCCL-6HF-ユビキチンまたはGFP/デルタヘルパー/pvSvGの3つのベクターの等量で共トランスフェクされる。24時間の製造後、レンチウイルス粒子を含む培地を回収し、濾?...

ディスカッション

私たちは、主要なユビキチンファミリーメンバーによって修飾されたタンパク質のプロファイルを生成するための堅牢で信頼性の高い方法論を開発しました。実際、このプロトコルを適用して、ユビキチン、およびSUMOとNedd8によってPTMのプロファイルを生成し、特定の遺伝子の過剰発現またはノックダウンに応じて^治療7に関連する変更を検出することに成功しました(デー?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220-5ML	binds all Flag tagged proteins
anti-Flag M2 antibody	Sigma-Aldrich	F3165	to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl
Cell strainer 40 µm	Falcon	352350	to remove floating pellet from guanidine lysed cells
Flag peptide	Sigma-Aldrich	F3290	elute flag tagged proteins from anti-flag beads
Guanidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	50933	chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513	eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses
Lobind tubes	Sigma-Aldrich	Z666491	avoids absorption of precious material
Membrane Filter, 0.45 µm	Millipore	HAWP04700F1	to filter the lentiviral supernantant
Ni-NTA	Qiagen	30210	purification of the 6His tag