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要約

ここでは、i)CyanoGateモジュラークローニングツールキットを用いて自己複製ベクターを組み立てる方法を記述するプロトコルを提示し、ii)結合によりシアノバクテリア宿主にベクターを導入し、iii)を用いてトランスジェニックシアノバクテリア株を特徴付ける。プレートリーダーまたはフローサイトメトリー。

要約

シアノバクテリアは、有用な工業製品の再生可能な生産のために遺伝子組み換えすることができる原核生物の多様なグループです。合成生物学の最近の進歩は、シアノバクテリアへのその後の形質転換または共役転移のためのプラスミドベクターを構築するための標準化されたモジュラークローニングシステムであるCyanoGateなどのいくつかのクローニングツールキットの開発につながっています。ここでは、自己複製ベクター(例えば、蛍光マーカー発現カセットを運ぶ)を組み立てるための詳細な方法と、シアノバクテリア株シネキスシスプスPCC 6803またはシネココッカスへのベクターの共役移動の概要を説明します。エロンゲトゥスUTEX 2973。さらに、プレートリーダーまたはフローサイトメトリーを用いて遺伝的部分(例えばプロモーター)の性能を特徴付ける方法を概説する。

概要

シアノバクテリアは、多種多様な天然および異種値の代謝産物1、2、3、4、5の生合成に使用できる自己栄養性細菌である。 6.いくつかのハードルは、商業的生存率を拡大するためにまだ克服する必要があり、特に、異栄養性バイオプラットフォーム(例えば、大腸菌および酵母)に比べて比較的低い収率は7である。シアン細菌研究における利用可能な遺伝子工学ツールの最近の拡大と合成生物学パラダイムの取り込みは、このような課題を克服し、効率的なバイオファクトリーとしてシアノバクテリアをさらに開発するのに役立っています8,9、10。

シアノバクテリアにDNAを導入する主なアプローチは、形質転換、結合およびエレクトロポレーションである。形質転換またはエレクトロポレーションによってシアノバクテリアに移されるベクターは「自殺」ベクター(すなわち、相同組換えを促進する統合ベクター)であるのに対し、自己複製ベクターはシアノバクテリアに移すことができる。変換、結合またはエレクトロポレーション。前者の場合、自然変換11に適した工学モデル種に対してプロトコルが利用可能である。さらに最近では、CyanoGateと呼ばれるシアノバクテリア用モジュラークローニング(MoClo)ツールキットが開発されており、自然変換、エレクトロポレーションまたはコンジュゲーション12を用いたエンジニアリング用の標準化されたゴールデンゲートベクトル組み立て方法を採用している。

ゴールデンゲート型組み立て技術は近年ますます普及しており、組み立て規格や部品図書館は様々な生物に対して利用可能になりました13,14,15,16、17.ゴールデンゲートは、IIS制限酵素(例えば、BsaI、Bpi、BsmBI、BtgZIおよびAarI)とアクセプタとユニークなオーバーハングのスーツを使用して、「1つのポット」アセンブリ反応における複数の配列の方向性階層アセンブリを容易にします。IIS制限酵素は、一意の非対称配列を認識し、その認識部位から定義された距離を切断して、驚異的な「粘着性の端」カット(通常は4ヌクレオチド[NT]オーバーハング)を生成し、その後、順序付けられたDNAを駆動するために利用することができます組み立て反応15,18.これにより、PhytoBricks標準19のような一般的な構文によって定義されるモジュラーレベル0部品(例えば、プロモーター、オープンリーディングフレームおよびターミネータ)の大規模なライブラリの開発が容易になった。レベル0の部品は、レベル1式カセットに容易に組み立てることができ、その後、より複雑な高次アセンブリ(例えば、多遺伝子発現構造体)を選択12、15のアクセプタベクトルに組み込むことができる。ゴールデンゲート型組み立て技術の主な利点は、DNAファウンドリ20、21などの高スループット施設で自動化を行うことができるため、複雑な実験設計のテストが可能です。肉体労働では容易に達成できない。

シアノゲートは、確立されたプラントモクロシステム12、15に構築します。CyanoGateに新しい部品を組み込むには、まず部品シーケンスを家畜化する必要があります。オープンリーディングフレーム(すなわち、コード配列、CDS)の部品コードの場合、認識部位は、配列中の同義変異を生成することによって破壊され得る(すなわち、同じアミノ酸残基に対してコード化する代替にコドンを変更する)。これは、DNA合成からポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅ベースの戦略(ギブソンアセンブリ22など)に至るまで、様々なアプローチによって達成することができる。使用される発現ホストに応じて、翻訳23の効率を阻害する可能性のある希少なコドンの導入を避けるように注意する必要があります。プロモーターおよびターミネータシーケンスの認識部位を削除することは、通常、変更が機能に影響を与える可能性があり、部品が期待どおりに動作しない可能性があるため、リスクの高い作業です。例えば、プロモーター内のプットアトリプション因子結合部位またはリボソーム結合部位への変更は、誘導/抑圧に対する強度および応答性を変化させ得る。同様に、主要なターミネータ構造特徴(例えば、GCリッチステム、ループおよびポリUテール)に対する改変は、終端効率および効果遺伝子発現24、25を変化させ得る。プロモーターおよびターミネータ配列の活性を予測し、提案された突然変異がパフォーマンス26、27に影響を与えるかどうかを通知するために、いくつかのオンラインリソースが利用可能ですが、これらのツールは、多くの場合、不十分な予測変数ですシアノバクテリアでの性能28,29,30.そのため、改変部品の生体内特性評価は、依然として活性を確認することをお勧めします。再計算配列のクローニングを支援するために、CyanoGateは、BioBrickベクターpSB4K512、16、31に基づく低コピークローニングアクセプタベクターを含む。さらに、エディンバラゲノムファウンドリーを通じて「デザインとビルド」ポータルを利用して、ベクターデザイン(dab.genomefoundry.org)を支援します。最後に、最も重要なのは、CyanoGateには、自殺ベクターを用いてシアノバクテリアにDNAを導入するための2つのレベルTアクセプタベクター設計(レベル2アクセプタベクターに相当)15、または自己複製が可能な広範な宿主範囲ベクターが含まれています。いくつかのシアノバクテリア種で 32,33,34.

ここでは、レベルT自己複製ベクターを生成するためのプロトコルとシネコシスティスPCC 6803とシネココッカス・エロンガトゥスUTEX 2973(シネコシスティスPCC 6803およびS.エロンガトゥス)の遺伝子改変を記述することに焦点を当てます。UTEX 2973以下)により、活用(トライペアレンタル交配とも呼ばれる)。細菌細胞間のDNAの共役移動は、よく記述されたプロセスであり、以前にシアノバクテリア種の工学に使用されてきましたが、特にS.エロンガトゥスUTEX 297335のような自然に有能でないもの、 36、37、38、39、40、41 .簡単に言えば、シアノバクテリア培養物は、移送されるベクター(「貨物」ベクター)とベクター(同じ大腸菌株または追加株のいずれか)を運ぶ大腸菌株をインキュベートして、コンジュゲーション(「モビライザー」)を可能にします。および "ヘルパー" ベクター)。共役転移が起こるためには4つの重要な条件が必要である:1)DNA移動に関与する細胞間の直接接触、2)貨物ベクターはコンジュゲーションシステムと互換性がなければならない(すなわち、適切な伝達起源(oriT)が含まれている必要があります。また、BOM(移動度の基礎)部位として知られ、3)DNAニッキングタンパク質(例えば、暴徒遺伝子によってコードされる)は、DNAをシアノバクテリウムへの一本鎖移動を開始するためにオリットでDNAをニックし、発現しなければならない貨物またはヘルパーベクターのいずれかから、および4)転写されたDNAは、レシピエントシアノバクテリウム内で破壊されてはならない(すなわち、例えば、制限エンドヌクレアーゼ活性によって分解に対して耐性でなければならない)35、42。貨物ベクターが持続するためには、複製の起源がレシピエントシアノバクテリウムと互換性があり、自己複製および後の分裂後の娘細胞への増殖を可能にする必要があります。条件3および4を支援するために、いくつかのヘルパーベクターは、ホストシアノバクテリウム43内の天然のエンドヌクレアーゼから保護するために、暴徒のためにコードするAddgeneおよび他の商業ソースおよびいくつかのメチルアーゼを介して利用可能である。このプロトコルでは、コビライザーおよびヘルパーベクターpRK24(www.addgeneorg/51950)およびpRL528(www.addgene.org/58495)をそれぞれ運ぶMC1061大腸菌株によって結合が促進された。共役転写に使用するベクターを選択する際には注意が必要です。例えば、CyanoGateキットでは、自己複製貨物ベクトルpPMQAK1-Tがモブタンパク質12に対してコード化される。ただし、pSEVA421-Tは44ではなく、そのため、mobは適切なヘルパーベクトルから発現されなければならない。使用されるベクターは、標的生物にも適している必要があります。例えば、Anabaena sp. PCC 7120における効率的な共役伝達は、消化からモビライザーベクトルを保護するヘルパーベクターを必要とします(例えば、pRL623は、3つのメチルアベイム、Eco47iiMおよびEcot22iM)45のためにコードする、 46.

このプロトコルでは、プレートリーダーまたはフローサイトメーターを使用して蛍光マーカーを使用して部品(すなわちプロモーター)の性能を特徴付ける方法をさらに概説します。フローサイトメーターは、大規模な集団に対して単一の細胞ベースで蛍光を測定することができます。さらに、フローサイトメーターは、ユーザーが取得したデータを「ゲート」し、バックグラウンドノイズ(例えば、培養または汚染中の粒子状物質から)を除去することを可能にします。対照的に、プレートリーダーは、所定の培養量の凝集蛍光測定を取得し、典型的には複数の複製井戸で得る。キロメートル計を超えるプレートリーダーの主な利点は、低コスト、高可用性、通常はダウンストリームデータ分析のためのスペシャリストソフトウェアの必要性がないことです。プレートリーダーの主な欠点は、細胞計に比べて感度が比較的低く、測定された培養物の光学密度に関する潜在的な問題です。比較分析では、プレートリーダーサンプルを各ウェル(例えば、培養密度の測定に、通常750nm[OD750]の光学密度での吸光度として取られる)を正規化する必要があり、これはあまりにも不正確なサンプルの不正確さにつながる可能性があります。高密度および/または十分に混合されていない(例えば、凝集または凝集が起こりやすい場合)。

概要として、ここではレベル0部品を生成し、続いてCyanoGateキットを使用して階層アセンブリを作成し、共役転送に適したベクトルにクローニングするという原則を詳細に示します。次に、共役伝達プロセス、蛍光マーカーを発現する軸経共役株の選択、およびフローサイトメーターまたはプレートリーダーを用いた蛍光データの取得について説明します。

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プロトコル

1. プラントモクロおよびシアノゲートツールキットを使用したベクトルアセンブリ

注:ベクターアセンブリを進める前に、プラントおよびCyanoGate MoCloシステム12、15のベクトルレベル構造に精通することを強くお勧めします。

  1. レベル0部品の建設
    注: レベル 0 のパーツは、完全なベクトルとして合成することも、レベル 0 アクセプタを持つアセンブリの線形シーケンスとして合成することもできます(例: gBlocks、IDT)。あるいは、配列は、ソーステンプレート(例えば、ベクターまたは精製ゲノムDNA)から増幅することができる。ここでは、増幅された製品から新しいレベル0部品を生成する方法について説明する。レベル 0 からレベル T までのゴールデン ゲート アセンブリ プロセスの概要は、図 1.
    1. プライマーを設計します。
      1. どのレベル 0 モジュールを組み立てるかを決定し、適切な 5′ および 3′ のオーバーハングを識別します (表 1)12,15。BpiIまたはBsaI制限部位の存在を複製するDNA配列を確認してください。
        注: これらのサイトのいずれかを含むシーケンスは、制限サイト シーケンス内の 1 つ以上の登録を変更して、家畜化する必要があります。ゴールデン ゲート アセンブリを使用してこれを行う方法を図 2に示します。
      2. DNA配列を増幅するには、適切な前方および逆プライマーのペアを設計します。フォワードプライマーの場合は、DNAテンプレート配列の5′末端に相補的な18−30 bpを選択します。逆プライマーの場合は、DNAテンプレート配列の3′末端を相補的に18−30 bp逆を選択します。
        注: 融解温度(Tm)が 58~62 °C のプライマーは、通常、最も一貫した増幅結果を得ます(図 1A)。
      3. フォワードプライマーの5′端部に次の値を追加します: 1)BpiIサイトの5′末端に4-6のNTのランダムストリング、2)BpiI制限部位(GAAGAC)、3)2つのランダムNT、および4)ステップ1.1.1.1で選択した5′オーバーハング。逆プライマーの5′端部に以下を追加します: 1)BpiIサイトの5′末端に4-6のNTのランダムストリング、2)BpiI制限部位(GAAGAC)、3)2つのランダムNT、および4)ステップ1.1.1.1で選択した3′オーバーハング。ファイナライズしたら、プライマーペアを注文します。
        メモ:フォワードプライマーとリバースプライマーのペアの例については、図 1Aを参照してください。
    2. ゲノムDNAからDNA配列を増幅する。
      1. セクション5に記載のゲノムDNAを抽出する。高忠実度DNAポリメラーゼを用いてPCRにより製品を増幅する (材料表)。
        メモ:例として、製造元の指示に従ってPCR反応(20-50°L)を設定します。反応ごとに約100ngのゲノムDNAを使用します。30sの98°Cの初期変性ステップからなるサーマルサイクリングプログラムを使用し、その後、10sの98°Cで25サイクル以下の変性、15°Cの58°Cでプライマーアニーリング、30sの72°Cで製品拡張(後者に応じて変更する)使用されるDNAポリメラーゼの製品/タイプのサイズ)、続いて2分間72°Cの最終延長工程を行う。
      2. PCR産物をゲル化させる場合は、セクション6に記載されているように、アガロースゲル上でPCR反応全体を実行します。目的のバンドをアガロースゲルから切り取り、ゲル抽出キット(材料の表)を使用して精製します。
      3. ステップ1.1.2.2の代わりに、PCR産物をゲル精製せずに使用する場合は、アガロースゲル上でPCR反応試料(〜5μL)のアリコートを実行してバンドサイズを確認する。ゲルに適切なバンドのみが表示され、プライマーダイマーの証拠がない場合は、DNA精製キット(材料表)を使用してPCR製品を精製します。
      4. 少量の脱イオン水(例えば10μL)で精製されたDNAを溶出し、高いDNA濃度を得た(>20ng/μLで十分)。
    3. 増幅されたDNA製品(または製品、図2を参照)をレベル0で組み立てます。BpiI (図 1B)を使用して 20 μL の反応ミックスを準備し、表 2に示すようにサーマル サイクラー プログラムをセットアップします。組み立てられたレベル0反応ミックスの5μLを用いて大腸菌変換に進む(セクション2で説明)。
  2. レベル 1 アセンブリの構築
    1. 組み立てるレベル 0 パーツを決定します (図 1Cと表 1)。適切なレベル 1 アクテクタ ベクトル15を選択します。
      注: この段階では、レベル 1 アクセプタ ベクトルの選択に影響を与えるため、最終的なベクトル設計がレベル T に何になるかを知ることが重要です。レベル 1 (前方) アクセプタ ベクター (pICH47732) は、レベル T に単一のレベル 1 アセンブリ (例えば、遺伝子発現カセット) を持つことを目標とする場合に、デフォルトとして使用できます。ただし、2 つ以上のレベル 1 アセンブリをレベル T でアセンブルする場合は、各レベル 1 アセンブリの位置と方向を考慮する必要があります。レベル 1 アクセプタ ベクトルを適切な位置12に使用すると、レベル T のアクセプタ ベクトルに最大 7 つのレベル 1 アセンブリをアセンブルできます。
    2. レベル 0 のパーツをレベル 1 で組み立てます。BsaIを用いて20μLの反応ミックスを準備し、表2に示すようにサーマルサイクラープログラムを設定する。組み立てられたレベル1反応ミックスの5μLを用いて大腸菌変換に進む(セクション2で説明)。
  3. レベル T アセンブリの構築
    1. アセンブルするレベル 1 アセンブリを決定します (図 1D)。適切なレベル T アクセレクタ ベクトルを選択します。
      注:pUC19A-T(アンピシリン耐性)およびpUC19S-T(スペクチノマイシン耐性)は、シアノバクテリアでは複製できず、主にゲノム統合(すなわち、遺伝子のノックインまたはノックアウト)に使用される高コピー数の統合ベクターです。相同組換え12.集積ベクターの送達は、アミシブルシアノバクテリア種11における自然な形質転換によって進行することができる。pPMQAK1-Tは、共役転送によって提供される広いホスト範囲、複製ベクトルである(セクション3)。
    2. 適切なエンドリンクを選択して、最終レベル1アセンブリの3′エンドをレベルTバックボーン15にリゲートします。
      注: 必要なエンドリンクは、最終部品の位置と同じ番号です。たとえば、レベル 1 の位置 1 (前方または逆方向) のパーツが 1 つだけのレベル T ベクトルでは、レベル T バックボーンへのライゲーションにエンド リンク 1 (pICH50872) が必要です。
    3. レベル T で 1 つ以上のレベル 1 アセンブリを組み立てる. BpiI および必要な End-Link ベクトルを使用して反応ミックスを準備し、表 2に示すようにサーマル サイクラー プログラムを設定します。組み立てられたレベルT反応ミックスの5μLを用いて大腸菌変換に進む(セクション2で説明)。

2.大腸菌変換とベクター精製

  1. 大腸菌変換(1日目)
    1. 化学的に有能な大腸菌細胞(材料表)のアリコート(〜25°L)を解凍し、氷上の1.5 mLチューブにやさしくピペットを入れます。5°Lの組み立てミックス(レベル0、1またはT)を加え、さらに30~60分間氷上でチューブをインキュベートします。
    2. ヒートショックセルは、チューブを42°Cの水浴で30sでインキュベートし、その後2分間氷の上にチューブを戻し、カタボライトリプレス(S.O.C.)培地(250°L)を用いて室温(RT)最適なスープを加えます。振とうインキュベーターで225rpmで1時間37°Cでチューブをインキュベートします。
    3. 適切な最終濃度の抗生物質を含むLB寒天プレート上の培養プレート40μL(スペクチノマイシン二塩酸塩ペンタ水和物に対して100μg/mL、カルベニシリン二ナトリウムの100μg/mL[レベル1]、またはカナマイシン硫酸カナマイシンの50μg/mLレベルT])、1mMイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)および5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド(X-Gal)の40μg/mLをブルーホワイトスクリーニング用に示す。プレートを37°Cで一晩インキュベートします。
      注:めっきされた培養量は、大腸菌能細胞の効率およびライゲーション反応に応じて変化させることができる。一晩インキュベーション後に<10コロニーが観察される場合は、より大きなボリュームをプレートします。
  2. 白色コロニーの選択と液体培養の調製(2日目)
    注:組み立て反応とその後の変換の効率に応じて、LB寒天プレートにはコロニー、青いコロニーまたは白いコロニーが含まれていない場合があります(図3)。青色のコロニーは、制限を受けていないアクセプタベクターを示す(すなわち、lacZの機能コピーがまだ存在する)。白いコロニーは、lacZ発現カセットが失われ、部品/アセンブリに置き換えられたことを示します。
    1. 必要に応じて、セクション 7 で説明されているように PCR を実行して、白いコロニーに期待されるベクターが含まれることを検証します。
    2. 10°Lの先端を持つ単一の白いコロニー(またはPCR検証コロニー)を選択し、LB培地(5 mL)と適切な抗生物質濃度を含む15 mL遠心管に移します(ステップ2.1.3)。振とうインキュベーターで225rpmで一晩37°Cでチューブをインキュベートします。
  3. プラスミドベクター精製(3日目)
    1. 場合によっては、ベクターの長期凍結保存のための一晩大腸菌培養物のグリセロールストックを調製する。500 μLの細菌培養物を500μLの500°Lに加えて、-80°Cでの凍結保存用の適切な1.5−2.0 mLチューブに500°L(v/v)グリセロールを加えます。5-10xを反転して軽く混ぜます。液体窒素中のフラッシュ凍結サンプルを-80°Cの冷凍庫に保存します。
    2. 15 mL遠心管の培養物を3,000 x gで5−10分間スピンダウンします。プラスミド精製キット(材料表)を用いてベクターを精製する。脱イオン水の35μLで精製ベクターを溶出する。
      注: より低い溶出量を使用して、ベクトル濃度をさらに増加させます。同じ溶質は、収率を高めるための精製カラムを2回通すことができます。
    3. 分光光度計(材料表)を用いて溶出物中のベクトルの濃度を測定する。
      注: pUC19 などの大腸菌の高いコピー番号ベクトルは、通常、pPMQAK1-T のような低いコピー番号ベクトルで収率が 50-300 ng/μL になりますが、通常は 15-60 ng/μL の収率を与えます。
  4. ベクター検証
    注: ベクトルは、制限ダイジェスト(ステップ 2.4.1)および/またはシーケンス(ステップ 2.4.2)によって検証できます。
    1. 適切な制限酵素を使用してベクトルの 0.5-1 μg を制限し、セクション 6 (図 4)で説明されているように、予想されるバンド サイズを確認します。
      注: 通常、不適切なバンド サイズは誤ったアセンブリを示し、その場合、より多くの白いコロニーをスクリーニングしたり、アセンブリを繰り返すことができます。BsaI および BpiI を使用すると、それぞれレベル 0 アセンブリとレベル 1 アセンブリの挿入の正しいサイズを検証できます。BsaIまたはBpiは、挿入および/またはベクターバックボーン内で切断する追加の互換性のある制限酵素と組み合わせて使用して、消化後によく分離されたバンドの明確なセットを生成することができる。
    2. 商業シーケンシング機能を用いて、組み立てられた領域の上流の適切なプライマーを用いてサンガーシーケンシングによってベクトルを配列する(表3)。
      注: すべての新しいレベル 0 パーツは、予期されるシーケンス ID を確認するためにシーケンス化する必要があります。レベル 1 および T ベクトルのシーケンス検証は、通常、以前にシーケンスされたレベル 0 のパーツから組み立てられる場合は必要ありません。

3. 活用による変異体の生成

注:ここで、シネコシスティスPCC 6803またはS.エロンガトゥスUTEX 2973 11、47への自己複製貨物ベクトルの共役転送のためのプロトコルが記載されている。このプロトコルは、他のモデル種(例えば、S.エロンガトゥスPCC 7942およびシネココッカスsp.PCC 7002)に適用可能である。シアノバクテリア(および関連する緩衝剤製剤)とのすべての作業は、層流フード内の滅菌条件下で行われるべきである。

  1. シアノバクテリア培養の成長(1日目)
    1. Lea-Smith et al.11に従ってBG11培地を調製し、LB-BG11およびBG11+Kan50を有する寒天プレート(セクション8)を用いて調製する。
    2. アックスシスティスPCC 6803またはS.エロンガトゥスUTEX 2973の新鮮な培養を設定し、斧BG11寒天板から供給された細胞で新鮮なBG11培地(50mL)の100 mL円錐フラスコを接種します。シネコシスティスPCC 6803培養物を30°Cで成長させ、100μmol光子m-2 s-1を100rpmで成長させ、S.エロンゲタスUTEX 2973を40°Cで成長させ、300μmol光子m-2 s-1を100rpmで成長させる。OD750 = 0.5−1.5(通常は1−2日)まで培養を成長させる。
      注:S.エロンガトゥスUTEX 2973培養物は、高い光強度で40°Cで成長させることができる(例えば、2000μmol光子m-2s-1)48。
  2. ヘルパーおよび貨物大腸菌株の成長(2日目)
    1. アンピシリン(最終濃度100μg/mL)とクロラムフェニコール(最終濃度25μg/mL)を含むMC1061大腸菌株を含むベクターpRK24およびpRL528(すなわち、ヘルパー株)を含むLB培地を接種し、225rpmで一晩37°Cで成長する揺れるインキュベーターで。1 mL の培養が必要であると仮定して、ヘルパー株培養の十分な量を育てる。
    2. 貨物ベクター(すなわち、レベルTベクター)を運ぶ大腸菌培養と適切な抗生物質を含有するLB培地(5mL)を接種する。振とうインキュベーターで225rpmで一晩37°Cで培養を成長させる。
  3. 共役転移(三親交配)(3日目)
    1. 大腸菌ヘルパーと貨物株を準備します。ヘルパーと貨物大腸菌を室温で10分間3,000 x gで遠心分離します。細胞ペレットを乱さずに上清を捨てる。
    2. 抗生物質なしで新鮮なLB培地を加えてペレットを洗浄します。初期カルチャと同じボリュームを使用します。ペレットをゆっくりと上下にピペットで再差し込みます。文化を渦に入ないでください。このステップ3xを繰り返して、一晩培養物から残留抗生物質を除去する。
    3. 再懸濁培養物を遠心分離し(ステップ3.3.1のように)、上清を廃棄し、初期培養量のLB培地の半分の体積(例えば、一晩培養が5mLであった場合は2.5mL)に再懸濁する。ヘルパーひずみの450°Lと2mLチューブ内の貨物株の450°Lを組み合わせ、ステップ3.3.6まで脇に置きます(RTで残します)。
    4. シアノバクテリア培養を準備する。各コンジュゲーション反応には、1 mLのシアノバクテリア培養物(OD750 = 0.5−1.5)を使用する。
    5. RTで10分間1,500xgでシアン化培養の必要な総体積を遠心分離し、その後、細胞ペレットを乱すことなく慎重に上清を廃棄する。同じ初期容積の新鮮なBG11培地を加えてペレットを洗浄する。ペレットを上下に軽くピペットして再サスペンドし、培養物を渦巻きさせないでください。この手順3xを繰り返し、洗浄した培養物を脇に置きます。
    6. 2mLチューブに大腸菌株(ヘルパーと貨物)(900°L)を合わせた大腸菌培養物(900°L)に洗浄したシアノバクテリア培養物(900°L)のアリコートを加えます。ゆっくりと上下にピペットで培養物を混ぜます。渦をしないでください。シネコシスティスPCC 6803の場合はRTで混合物を30分間インキュベートするか、S.エロンガルタスUTEX 2973の場合は2時間インキュベートする。
    7. 混合物をRTで10分間1,500 x gで遠心分離し、上清の1.6 mLを除去する。残りの~200μLの上清でペレットを再サスペンドします。抗生物質を欠いているLB-BG11寒天プレートに0.45μmの膜フィルターを1つ置きます(セクション8)。大腸菌/シアノバクテリア培養ミックスの200μLを無菌スプレッダーまたは滅菌曲げ先端で膜に慎重に広げ、パラフィンフィルムでプレートを密封します。
    8. LB-BG11プレートを24時間膜でインキュベートし、シネコシスティスPCC 6803培養物で膜を30°C、100μmol光子m-2 s-1に維持する。S. エロンガルトゥスUTEX 2973 培養物を用いた膜を40°Cで150μmol光子m-2s-1で維持する。
  4. 膜移動
    1. 24時間後、適切な抗生物質を含む新鮮なBG11寒天プレート(セクション8)に炎殺菌鉗子を用いて膜を慎重に移し、貨物ベクターを選択する。パラフィンフィルムでプレートを密封します。
    2. シナ響菌PCC 6803またはS.エロンガトゥスUTEX 2973については、コロニーが現れるまで、適切な成長条件下でBG11寒天プレートをインキュベートする。
      注: コロニーは通常、シネコシスティスPCC 6803 の場合は 7~14日後、S. elongatus UTEX 2973 の場合は 3-7 日後に表示されます。
  5. 共役の選択
    注:貨物ベクターを運ぶシアノバクテリアコロニーのみが膜上で成長することができます(図5)。
    1. 熱滅菌ループを用いて、膜から少なくとも2つの個々のコロニーを選択し、適切な抗生物質を含む新しいBG11寒天プレートにストリークする(図5C)。
      注:新鮮な縞模様のコロニーは、コンジュゲーションから持ち越された大腸菌で汚染されている可能性があるため(つまり、小さな白いコロニーがプレート上に明らかな場合)、新鮮なBG11寒天プレートに再ストリークする2~3ラウンドが通常あります。斧チアノバクテリア培養を得るために必要とされる。
    2. シアン化培養物のストリークをLB培地5mLを含む15mL遠心管に接種し、振とうインキュベーターで225rpmで一晩37°Cでインキュベートすることにより、大腸菌汚染がないことを確認します。十分な成長期間(〜7日)の後、個々の軸系コロニーを選んで、長期凍結保存またはその後の実験のための液体培養物を設定する。
  6. シアノバクテリア株の凍結貯蔵
    1. BG11(セクション3.1で説明)でシアノバクテリア液体培養物をOD750 = 1.5−3.0まで成長させる。1,500 x gで10分間10mLの培養を遠心分離し、上清を除去し、新鮮なBG11培地の5mLで細胞を再中断する。
    2. 最終的なグリセロール濃度〜20%(v/v)49に対してオートクレーブ滅菌50%(v/v)グリセロールの3.5mLを添加する。このアプローチは、シネコシスティスPCC 6803に適しています。あるいは、16%(v/v)ジメチルスルホキシド(DMSO)を含むフィルター滅菌BG11を5mL添加し、最終的なDMSO濃度〜8%(v/v)50を得た。このアプローチは、S. エロンゲタスUTEX 2973 を含むほとんどの株に推奨されます。
      注意: DMSO は有毒であり、適切な保護で処理する必要があります。
    3. 5-10xを反転して軽く混ぜます。サブアリコート~1 mLの培養を別々のクライオストレージ互換1.5 mLスクリューキャップチューブ(材料表)に凍結保存用の-80°C冷凍庫にチューブを入れます。液体窒素中で凍結をフラッシュしないでください。
      注:ひずみごとに少なくとも3つのストックをお勧めします。
    4. 回収には-80°冷凍庫からチューブを取り出し、35°水浴でゆっくりと混ぜながら解凍します。解凍した培養物を新鮮なBG11培地の50mLに加え、液体培養として成長させる(セクション3.1で説明)。
      注:または、培養は、新鮮なBG11寒天プレート上でストリークと成長することができます。選択マーカーを運ぶトランスジェニック培養物は、最初は抗生物質を使わずにBG11寒天プレート上で復活させ、その後、適切な抗生物質でBG11寒天プレートに引き込む必要があります。

4. プロモーターの特性評価

注:ここでは、プレートリーダーまたはフローサイトメーター12のいずれかを用いて72時間成長期間に続く蛍光マーカー(eYFP)の発現量を測定することによりプロモーター部分の強度を分析するための標準的なアプローチについて説明する。

  1. 文化の成長
    1. 蛍光マーカー発現カセットを運ぶトランスジェニックシアノバクテリア株の単一コロニーを含む適切な抗生物質を含むBG11培地の10mLを接種して種子培養を設定する。また、適切な負のコントロール株(例えば、野生型株および/または同じベクターバックボーンを運ぶが、蛍光マーカー発現カセットを欠いているトランスジェニック株)のための種子培養を準備する。
      注:少なくとも4つの生物学的複製が推奨される。
    2. 種株に適した成長条件下で48時間またはOD750 = 1−1.5まで種子培養物を成長させます。
    3. プロモーター発現を経時間の経過とともに追跡するには、まず各種子培養物のOD750を測定する。各カルチャを開始 OD750 = 0.2 にするための希釈要件を計算します。薄化実験培養サンプル(総体積2mL)をフラットボトム24ウェルプレート(材料表)に設定します。
    4. 適切な成長条件下で、白色LEDライト(材料テーブル)で揺れるインキュベーターでプレートをインキュベートします。プレートリーダー(セクション4.2)またはフローサイトメーター(セクション4.3)のいずれかを使用して、培養成長密度(OD750)と強化された黄色蛍光タンパク質(eYFP)蛍光を測定します。
      注:シネコシスティスPCC 6803およびS.エロンゲタスUTEX 2973培養は、ステップ3.1.2のように成長させることができる。プレートは高湿度(95%)培養試料の蒸発を避けるため。
  2. プレートリーダー
    1. 24ウェルプレート(ステップ4.1.4)の培養物を穏やかなピペットと簡単に混ぜます。各培養物のサブサンプルを黒いフラットボトム96ウェルプレート(材料の表)に転送します。必要に応じて希釈します(最終ボリュームは100°L)。これは測定精度を妨げる可能性があるので、気泡の形成を避けてください。
      注: すべての測定は、0.2−1.0のOD750範囲のサンプルに対して行われることをお勧めします。24ウェルの培養物の密度は時間の経過とともに増加するので、標準的な成長条件の予想される増加に基づいて、次の希釈が推奨されます:0 hで希釈なし、24時間で1:4、48時間で1:10、72時間で1:10。そこで例えば、24時間で25μLの培養物を収穫し、BG11培地の75μLと混合する。
    2. 96ウェルプレートに2つのブランクウェル(すなわち、BG11培地の100 μL)を含めます。96ウェルプレートをプレートリーダー(材料の表)に入れます。プレートリーダーの軌道シェーカーを使用して、500 rpmで60sのプレートを振り、井戸を混ぜます。
      注:シアノバクテリア培養物は凝集および/または凝集することができるので、正確な測定のために読み取る前に良好な混合が重要です。
    3. 485 nm/520 nmで励起/発光波長でOD750およびeYFP蛍光を測定します。
    4. シアノバクテリア培養を含む各サンプルウェルのOD750測定値から、2つのブランクウェルのOD750測定値の平均を差し引きます。
    5. 各培養試料の蛍光値を、eYFP蛍光測定(ステップ4.2.3)を調整されたOD750で培養物で割ることによって正規化する(ステップ4.2.4)。次いで、eYFP発現カセットを運ぶトランスジェニック株から適切な陰性対照株の生物学的複製の平均正規化eYFP蛍光値(eYFP蛍光/OD750)を差し引く。
      注:シアノバクテリアは、クロロフィルやフィコビリタンパク質などの顔料の存在により自然に蛍光を与えます。
    6. 時間の経過に伴うプロット培養の成長(図6A)と、所望の時点における各実験培養物の平均正規化eYFP蛍光値(例えば、72時間;図 6B) を図 6 に示します。
  3. フローサイトメーター
    1. フローサイトメーター液体ハンドリングシステムに対応したプレートを選択します。たとえば、このプロトコルで使用されるフローサイトメーター (材料のテーブル)と丸底の 96 ウェル プレート (材料のテーブル) を使用します。
    2. 24ウェルプレート(ステップ4.1.4)の培養物を穏やかなピペットと簡単に混ぜます。OD750 = 0.1−0.2に培養液を希釈し、液体ハンドリングシステムのノズル閉塞を回避します。適切な量の培養サンプルを96ウェルプレートに加え、フィルター殺菌された1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で250μLの最終容積にします。BG11の60°Lと1x PBSの190°Lを含むプレート上の媒体溶液用のブランクウェルを含めます。
      注: サンプルを再実行する必要がある場合は、このボリュームをお勧めします。各ウェルの最大体積は300°Lであるため、250μLを超える体積はお勧めしません。
    3. フローサイトメーターを使用する準備ができたら、液体ハンドリングステーションに培養サンプルを含む96ウェルプレートを置きます。フローサイトメーターのソフトウェアプロトコルを設定して、10,000個の個々のイベント(例えば、細胞)の測定値を収集します。励起/発光波長488 nm/515-545 nmでeYFP蛍光を測定します。まず、空白の井戸からの読み取り値を測定し、確認してから(図7A)、サンプルを実行します。
    4. 空の読み取りと共通の領域を除く、前方および側面の散乱データセット内のシアノバクテリア細胞の集団をゲートする(図7B)。eYFP発現カセットを運ぶトランスジェニック株から適切な陰性対照株の生物学的複製の平均eYFP蛍光値を減算する(図7C,D)。所望の時間時点における各実験培養の細胞当たりの中央値蛍光値の平均をプロットする(例えば、72時間;図 7E) を図 7 に示します。

5. シアノバクテリアからのゲノムDNA抽出

注: 以下のプロトコルは、市販の DNA 抽出キット (材料表) を使用しています。

  1. BG11(セクション3.1で説明)でシアノバクテリア液体培養物をOD750 = 1.5−3.0まで成長させる。3,000 x gで10mLの培養物を10分間スピンダウンし、上清を廃棄する。30分間-20°Cでチューブをインキュベートしてペレットを凍結します。
  2. 400 μL の溶解バッファー (バッファー AP1) と 400 μL のリボヌクレアーゼ溶液 (RNase A) とガラスビーズの 50% (w/v) (直径 0.5 mm) を加えます。30 Hz (つまり、1,800 発/分に相当) のビードミル (材料の表)を使用してサンプルを 6 分間中断します。
  3. 17,000 x gで5分間スピンし、新しいチューブに上清を慎重に移し、ペレットを廃棄します。製造元の指示に従って進みます (資料資料の表)。

6. アガロースゲル電気泳動

  1. 0.02%(v/v)臭化エチジウムを含む1%(w/v)アガロースゲルを鋳造する。サンプルと適切なDNAラダーリファレンスをロードします。
  2. 125 V で 50 分間サンプルを実行し、紫外線(UV)トランスイルミナタのバンド分離を確認します。
    注:実行時間とアガロースゲルのパーセンテージは、予想されるバンドサイズに合わせて変更できます。例えば、アガロースゲルの割合が高く、実行時間が長いと、DNA産物のバンド分解能と分離が改善され、<500 bpが得られます。

7. コロニーPCR

  1. 標準キット(材料表)とプライマーの適切な組み合わせ(例えば、アセンブリ領域を横切るプライマー、またはアセンブリ領域内のシーケンスに固有のプライマー)を使用してPCR反応ミックスを設定する(表3)。ピペット10μLをPCRチューブに入れます。
  2. 滅菌爪楊枝または10°Lピペットチップで単一の白いコロニーの上部に穏やかに触れ、PCR反応ミックスを含むPCRチューブを接種します。コロニーをマークし、特定のPCRチューブと一致するように注意してください。反応ミックスを軽くかき混ぜて、大腸菌細胞が溶液中に流されることを確認します。
  3. PCRによって製品を増幅します。60sの場合は95°C、15sでは95°Cの30ラウンド、15sの場合は58°C(プライマーのTm値より少ない度数)、30s(挿入の30 s/kb)の72°Cからなるプログラムを使用してください。、続いて72°Cの最終延長ステップを5分間行う。

8. BG11媒体及び版の調製

  1. 100x BG11培地のストック溶液を調製し、鉄(クエン酸アンモニウム)、微量元素、リン酸塩(K2HPO4)、Na2CO3およびTES緩衝液をLea-Smith et al.11に記載する。オートクレーブリン酸塩およびNa2CO3ストック。TESバッファ(pH 8.2)およびNaHCO3ストックソリューションをフィルタリングするには、0.2μmフィルタを使用します。
  2. BG11培地の1Lを用意します。100x BG11の10 mL、微量元素1mL、鉄ストック1mLを混ぜ、976 mLの水で溶液をオートクレーブします。溶液がRTに冷却されたら、リン酸ストック1mL、Na2CO3ストック1mL、NaHCO3の10 mLを加え、1 M HClでpH 7.6−7.8に調整します。
  3. LB-BG11寒天プレート (1.5% [w/v])
    1. 700mLの脱イオン水と15gの寒天をガラスフラスコに入れます。2番目のフラスコに、186 mLの水、100x BG11の10 mL、微量元素1mL、鉄ストック1mLを加えます。両方のソリューションをオートクレーブします。
    2. 溶液が約60°Cに冷却されたら、それらを組み合わせて、リン酸ストック1 mL、Na2CO3ストックの1 mL、NaHCO3ストックの10 mL、LB滅菌培地の50 mLを加え、25で1 L.キャストペトリ料理の最終量を与える必要があります LB-BG11寒天培地のmL。
  4. BG11+Kan50寒天プレート (1.5% [w/v])
    1. 700mLの脱イオン水と15gの寒天をガラスフラスコに入れます。2番目のフラスコに、チオ硫酸ナトリウム3g(Na2S2O3)、226mLの水、100x BG11ストックの10mL、微量元素1mL、鉄ストック1mLを加えます。両方のソリューションをオートクレーブします。
    2. 溶液が約60°Cまで冷却されたら、それらを組み合わせて、リン酸ストック1 mL、Na2CO3ストックの1 mL、TESバッファストックの10 mL、NaHCO3ストックの10 mLを追加し、最終的な体積を1 L.加えるカナマイシン硫酸塩を与える必要があります50 μg/mLの最終濃度にし、35 mLの媒体でペトリ料理を鋳造する。

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結果

ゴールデンゲートアセンブリワークフローを実証するために、次のレベル0の部分を含むレベル1(前方)アクセプタベクトル(pICH47732)に発現カセットを組み立て、C-フィコシアニンオペロンP cpc560(pC0.005)のプロモーターを、eYFP (pC0.008) およびダブルターミネータ TrrnB (pC0.082)12のコーディングシーケンス。組み立て反応の変換?...

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ディスカッション

ゴールデンゲートアセンブリは、他のベクトルアセンブリメソッドと比較して、特にスケーラビリティ20、21の点でいくつかの利点があります。それにもかかわらず、ラボでゴールデンゲートシステムを設定するには、さまざまな部品とアクセプタベクトルライブラリと全体的なアセンブリプロセスに精通する時間が必要です。多くの場合、より複?...

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開示事項

著者たちは何も開示する必要はない。

謝辞

著者らは、産業バイオテクノロジー・バイオエネルギー研究評議会(BBSRC)ネットワークと産業バイオテクノロジーイノベーションセンター(IBioIC)の資金援助に感謝しています。GARG、AASO、APは、BBSRC EASTBIO CASE PhDプログラム(助成金番号BB/M010996/1)、コンセホ・ナシオナル・デ・シエンシア・イ・テクノロジア(CONACYT)博士課程、およびIBioIC-BBSRC共同トレーニングパートナーシップ(CTP)博士プログラムからの資金援助を認め、それぞれ。コンラッド・ムリノー(ロンドンのクイーン・メアリー大学)とポール・エリック・ジェンセンとジュリー・アンネマリー・ゼドラー(コペンハーゲン大学)は、プラスミドベクターとプロトコルの貢献とアドバイスに感謝します。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)Thermo Fisher ScientificR0404Used in 2.1.3.
Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium saltSigma-AldrichA2383Used in Table 2.
Agar (microbiology tested)Sigma-AldrichA1296-500gUsed in 8.3.
AgaroseBiolineBIO-41026Used in 6.
Attune NxT Flow CytometerThermo Fisher Scientific-Used in 4.3.1.
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153Used in Table 2.
BpiI (BbsI)Thermo Fisher ScientificER1011Used in Table 2.
BsaI (Eco31I)Thermo Fisher ScientificER0291Used in Table 2.
Carbenicillin disodiumVWR InternationalA1491.0005Used in 2.1.3.
Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well platesSigma-AldrichCLS3527Used in 4.1.3.
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Thermo Fisher ScientificBP231-100Used in 3.6.2.
DNeasy Plant Mini KitQiagen69104DNA extraction kit. Used in 5.
FLUOstar Omega Microplate readerBMG Labtech-Used in 4.2.2.
GeneJET Plasmid Miniprep KitThermo Fisher ScientificK0503Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2.
Glass beads (0.5 mm diameter)BioSpec Products11079105Used in 5.2.
GlycerolThermo Fisher Scientific10021083Used in 2.3.1, 3.6.2.
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)Thermo Fisher Scientific10356553Used in 2.1.3.
Kanamycin sulphate (Gibco)Thermo Fisher Scientific11815-024Used in 2.1.3.
Membrane filters (0.45 μm)MF-MilliporeHAWP02500Used in 3.3.7
Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) µCLEARGreiner Bio-One655096Used in 4.2.1.
Monarch DNA Gel Extraction KitNew England BiolabsT1020SUsed in 1.1.2.2.
Monarch PCR DNA Cleanup KitNew England BiolabsT1030DNA purification kit. Used in 1.1.2.3.
Multitron Pro incubator with LEDsInfors HT-Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4.
MyTaq DNA PolymeraseBiolineBIO-21108Used in 7.1.
NanoDrop OneThermo Fisher ScientificND-ONE-WUsed in 2.3.3.
One Shot TOP10 chemically competent E. coliThermo Fisher ScientificC404010Used in 2.1.1.
Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate)VWR InternationalK813Used in 4.3.2.
Q5High-Fidelity DNA PolymeraseNew England BiolabsM0491SUsed in 1.1.2.1.
Quick-Load 1 kb DNA LadderNew England BiolabsN0468SUsed in Figure 4.
Screw-cap tubes (1.5 ml)Starstedt72.692.210Used in 3.6.3
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrateVWR InternationalJ61820.06Used in 2.1.3.
Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well platesThermo Fisher Scientific612U96Used in 4.3.1.
T4 DNA ligaseThermo Fisher ScientificEL0011Used in Table 2.
TissueLyser IIQiagen85300Bead mill. Used in 5.2.

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