腸内細胞増殖細胞および死細胞の定量化

要約

提示されたプロトコルは、フローサイトメトリーを使用して、培養マウスエンターイドにおける増殖細胞および死細胞の数を定量化する。この方法は、オルガノイドの増殖および生存に対する薬物治療の効果を評価するのに役立つ。

要約

腸上皮は、病原性微生物叢や毒素などの発光内容物が身体の残りの部分に入るのを防ぐ障壁として機能する。上皮バリア機能は、腸上皮細胞の完全性を必要とする。上皮細胞の増殖はバリアを形成する細胞の連続層を維持する一方で、上皮損傷はバリア機能障害を引き起こす。その結果、明るい内容物は、制限のない経路を介して腸の障壁を越えることができます。腸内バリアの機能不全は、炎症性腸疾患などの多くの腸疾患に関連している。単離されたマウス腸管は、腸オルガノイドまたは「腸内ロイド」と呼ばれるクリプト・ビラス様構造として培養および維持することができる。腸内ロイドは、腸管上皮細胞の増殖および細胞死をインビトロで研究するのに理想的である。このプロトコルでは、培養エンテロイド中の増殖細胞および死細胞数を定量化する簡単な方法を説明する。5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)およびヨウ化プロピジウムは、腸内の増殖および死細胞の標識に使用され、増殖および死細胞の割合は、フローサイトメトリーによって分析される。これは、腸上皮細胞増殖および細胞生存に対する薬物治療の効果を試験するのに有用なツールである。

概要

腸管上皮細胞の基本的な機能は、病原性細菌および毒素^1、2などの発光内容物の侵入を保護することです。このような機能を果たすために、腸幹細胞は、腸球細胞や分泌細胞を含む様々な上皮細胞に増殖し、かつ分化し、密閉結合を形成して障壁を形成する^3。腸管上皮細胞の急速な再生は、細胞増殖、細胞分化、および細胞死^4、5の厳密な調整を必要とする。細胞増殖の減少または過剰な細胞死は、上皮損傷および障壁機能^1、6の侵害につながる。腸内バリアの機能不全は炎症性腸疾患^7,8に関連付けられている。

腸管の納骨堂を培養する方法が以前に開発されている。この技術を用いて、単離されたマウスの陰窩は腸オルガノイド(腸内ロイド)に成長し、構造のような陰窩を有し、全ての腸上皮細胞系統^9、10を含有する。5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)は、細胞増殖中に複製を受けているDNA中のチミン(T)を置換することができるチミジンアナログである。増殖性細胞は、EdU染色により迅速かつ正確に標識することができる。ヨウ化プロピジウム(PI)は、二本鎖DNAへの挿入時に赤色蛍光を放出する臭化エチジウムの類似体である。PIは、損傷した細胞膜を通過するだけなので、特に死細胞を検出する。

このプロトコルでは、まず、マウス小腸から被検査を分離し、それを腸内で腸状として培養する方法を説明する。次に、EdUおよびPIの組み込みおよびフローサイトメトリーによる腸内の増殖細胞および死細胞の分析方法を説明する。

プロトコル

このプロトコルは、ケンブリッジ・スーダゲノムリソースセンター(CAM-SU)の動物ケアと使用委員会によって承認されました。

1. 腸内オルガノイドの分離と文化

1. 腸管の分離と腸内の文化
   1. CO₂吸入で8週齢の野生型マウスを安楽死させる。約8cmの回腸を解剖するために、ティッシュ鉗子と細かい虹彩ハサミを使用してください。
   2. 氷冷ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)の約40mLを持つガベージ給餌針を持つ注射器を使用して洗い流し、ハサミで縦に切断し、回腸を開きます。
   3. 回腸を小さく(0.5-1.0 cm)切ります。15 mLの円錐形チューブに5mLの無菌氷冷DPBSを入れ、氷の上で5分間ロックします。
   4. ピペットコントローラを使用してDPBSを吸引し、10 mLのコールドバッファ1(DPBSで2 mM EDTA)に交換します。氷の上で30分間ロックします。
   5. ピペットコントローラを使用してバッファ1を吸引し、10 mLのコールドバッファ2(DPBSで54.9mM D-ソルビトール、43.4 mMスクロース)に置き換えます。手で2-3分(約80シェイク/分)を振ります。
   6. 振盪後20μLのバッファー2内容物を取り、顕微鏡で検査します。
   7. 70 μmの無菌細胞ストレーナーでバッファ2内容をフィルターし、50 mL円錐形チューブで濾過したバッファーを集める。
   8. ピペット20 μLの切り出しをスライドにろ過して納骨堂を数えます。ステップ 1.1.7 から十分なバッファー 2 を転送して、~ 500 クリプト/ウェルがあることを確認します。
   9. 4 °Cで10分間150×gでスピンダウンします。回転が終わったら、慎重に上清を吸引します。
   10. 500個のクリプトあたり50μLの基細胞膜マトリックス(例えば、マトリゲル)でクリプトを懸濁し、ピペットを上下に(気泡を避けるように注意してください)、24ウェルプレートの1つの井戸の中央に50μLの基質膜マトリックス/クリプトミックスを置きます。37°Cで30分間インキュベートし、基細胞膜マトリックスを重合します。
   11. 重合の30分後、慎重にミニ腸培地の600 μLを追加します(高度なダルベッコの修飾イーグル培地[DMEM]/F12、2 mM L-アラニン-L-グルタミン、ペン/ストレップ[100単位/mL]、 10 mMヘペス、N2サプリメント[1:100]、B27サプリメント[1:50]表皮成長因子[EGF;50 ng/mL]、ノギン[100 ng/mL]、R-スポンディン[500 ng/mL]、およびY27632[10μM])を各々C.4°Cに戻します。毎日顕微鏡で観察し、2-3日ごとにメディアを交換してください。
2. 腸イド通過
   注: 長い文化の場合、エンテロイドは毎週に分割する必要があります。
   1. 腸イドを通過するには、組織培養プレートを氷の上に置きます。メディアを吸引し、各ウェルに冷たいDPBSの1 mLを追加します。P1000 チップを使用して、固体基質膜マトリックスチャンクが残らないまでピペットを上下に使用します。
   2. 1 mLインスリンシリンジ(27G)を通って1回上下に15mLの円錐形チューブに入ります。4 °Cで150 x gで5分間スピンダウンします。
   3. DPBS を削除するには、ピペットを使用します。基調膜マトリックス/ウェルの50 μLで再サスペンド。
   4. プレートを37°Cのインキュベーターに30分間入れ、基細胞マトリックスを重合させます。ENR培地(ミニガット培地、50ng/mL EGF、100 ng/mLノギン、500 ng/mL R-スポンディン)を各ウェルに重ね合わせ、プレートをインキュベーターに戻します。

2. 腸内のEdU陽性細胞のフローサイトメトリー解析

注:図 1は、エンターイド中の EdU 陽性細胞のフローサイトメトリー解析のワークフローを示しています。

1. EdUを使用した腸内ロイドのインキュベーション
   1. 5-7日間のステップ1.2.4から腸内ロイドを成長させる。通路は1:2の分割比で新しい24ウェルプレートにエンテロイド。各ウェルに600μLのENR培地を加えます。37 °Cインキュベーターで4-5日間腸イドをインキュベートする。
   2. コントロール群(未処理のエンテロイド)および実験群(5 ng/mLインターロイキン22[IL-22]で処理された腸イド)を設定する。各グループに対して少なくとも 3 つのレプリケートを準備します。
   3. ENR培地にEdUを加え、50μMの濃度でEdU培地を調製した。各ウェルに600μLのEdU培地を加え、37°Cのインキュベーターで2時間インキュベートします。背景減算の負のコントロールとして EdU 処理を行わないエンタロイドの 1 つの井戸を設定します。
2. 基状膜マトリックスからの腸ロイドの収穫
   1. ピペットコントローラーを使用してEdU培地を吸引し、DPBSで1xを洗浄します。DPBS の 1 mL を追加します。
   2. P1000ピペットチップとピペットを上下に使用し、固体基質膜マトリックスチャンクが残らないまで使用します。15 mLのチューブに移し、300 x gで5分間スピンダウンします。
   3. 500 μLの細胞解離酵素(材料表)を加え、37°Cで15分間インキュベートします。P200ピペットチップとピペットを上下に使用して、イチオイドを単一の細胞に分解します。
   4. 10%のウシ血清(FBS)を含むDMEM培地を3 mL加え、P1000ピペットチップを繰り返しピペットに加える。
   5. 300 x gで5分間スピンダウンし、上清培地を吸引します。1 mLのDPBSで細胞を再サスペンドする。
3. 細胞の固定と透過
   1. 細胞懸濁液を1.5 mLのチューブに移し、300 x gで5分間スピンダウンし、上清を捨てます。
   2. 1 mL 4% パラホルムアルデヒド (PFA) で細胞を再サスペンドし、室温 (RT) で 15 分間固定し、300 x gで 5 分間スピンダウンします。
   3. 1 mL の非イオン性界面活性剤を使用して細胞を再懸濁します。RTで10分間インキュベートします。
   4. 300 x gで5分間スピンダウンし、上清を吸引します。DPBSで1xを洗い、スピンダウンして上清を取り除きます。
4. EdU の検出
   1. 各成分のストック液を事前に用意する:1)Alexa Fluorアジドの作動液、2)1x EdU反応バッファーの作動溶液、および3)10xのEdUバッファー添加剤のストック溶液。
   2. 10x溶液1:10を脱イオン水で希釈して1x EdU緩衝液添加剤を調製する。このソリューションを新鮮に準備します。
   3. 表1に従って反応カクテルを準備する。
      注: 表に示されている順序で、成分を追加します。準備から15分以内に反応カクテルを使用してください。
   4. 1.5 mLのチューブに100μLの反応カクテルを加えます。細胞を再懸濁し、光から保護し、RTで30分間インキュベートする。
   5. 300 x gで5分間遠心分離し、ピペットチップで反応液を軽く吸引します。
   6. 各チューブに0.5%の非イオン界面活性剤浸透剤を加え、RT.遠心分離機で300xgで5分間洗い、ピペットチップで上清を穏やかに吸引し、DPBSの1 mLで細胞を再懸濁させる。
5. フローサイトメトリーによる細胞の解析
   1. 40 μm のストレーナーで再懸濁した細胞をフィルター処理し、15 mL 円錐形のチューブでフィルター処理されたセルを集めます。FACS オンマシン検出をできるだけ早く実行します。
      注:条件が限られている場合、細胞染色されたサンプルは、4°Cで暗闇の中に保存し、3日以内にフローテストする必要があります。
   2. フローサイトメトリー分析に適したチャネル(EdUキットのAlexa Fluor azideの種類に応じて、ここでは赤チャネル)と電圧(ここでは〜150~350V)を選択します。
   3. ガティング戦略
      1. FSC-A (x 軸)とSSC-A (y 軸) の疑似カラー プロットを描画し、ほとんどのセルを、電圧を調整して、ドット マップの可視範囲に分配します。セルの母集団(R1)を選択し、左下隅にある細胞の破片を除外します。
      2. R1 セルの母集団から、FSC-A (x 軸)対を確立します。FSC-H(y軸)疑似カラープロットを、単一のセル(R2)を選択してセルの束を除外するようにゲートを設定します。
      3. R2細胞集団から、蛍光強度(x軸)対.セル番号(y軸)プロットを作成し、負の制御を使用してゲートを設定します。蛍光シグナルの領域は、正の細胞領域(R3)である。実験群と対照群との間のEdU陽性細胞(R3)の比率を比較する。

3. 腸内のPI陽性細胞のフローサイトメトリー解析

注:図 2は、腸内の PI 陽性細胞のフロー サイトメトリー解析のワークフローを示しています。

1. PIを使用したエンチド細胞のインキュベーション
   1. 5-7日間のステップ1.2.4から腸内ロイドを成長させる。通路は1:2の分割比で新しい24ウェルプレートにエンテロイド。各ウェルに600μLのENR培地を加えます。37 °Cインキュベーターで4-5日間腸イドをインキュベートする。
   2. コントロール群(未処理)および実験群(IL-22処理)を設定し、各群に対して少なくとも3回の反復を用いた。
   3. ENR培地にPIを加え、3μMの濃度でPI培地を調製します。
   4. 各ウェルに600μLのPI培地を加え、37°Cのインキュベーターで30分間インキュベートします。背景減算の負のコントロールとして PI 処理を行わないエンタロイドの 1 つの井戸を設定します。
2. 2.2.1-2.2.5 のステップに従って、基質膜マトリックスからエンチドエントイドを収穫します。
3. フローサイトメトリーによる細胞の解析
   1. 40 μmのストレーナーで再懸濁した細胞をろ過し、15 mL円錐形のチューブで濾過した細胞を集めます。
   2. FACS オンマシン検出をできるだけ早く実行します。
      注:条件が限られている場合、細胞染色されたサンプルは、4°Cで暗闇の中に保存し、3日以内にフローテストする必要があります。
   3. フローサイトメトリー分析に適したチャンネル(ここでは赤チャネル)と電圧(~150~350V)を選択します。
   4. セクション 2.5.3 で説明した同じ gating 戦略を使用します。

結果

小腸のクリプトは、基細胞膜マトリックス中の腸ロイドとして単離し、培養した。エンターイドは、分離の2日後に芽を形成し始めました。6日目、腸内ロイドは、内腔に多くの破片(死細胞)を持つ多くの芽を持っていました。この段階で腸ロイドは継代を行う準備ができていました(図3)。

多くの研究は、炎症性サイトカインが腸上皮性恒常性の維持?...

ディスカッション

このプロトコルは、インビトロで腸内の腸イトの培養に必要なステップを詳述し、腸内のEdU-およびPI陽性細胞をフローサイトメトリーで定量する。この戦略には、いくつかの利点があります。まず、EdU ラベリングは、腸内の増殖細胞を検出するために使用されます。従来のBrdUアッセイと比較して、EdUラベリング法はより速く、より敏感で、より正確である。EdUはチミン(T)と非常によく似て?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml centrifuge tube	Corning	430791
22 G gavage needle	VWR	20068-608
24-well plate	Nunc	142475
40 mm sterile cell strainer	BD	352340
50 ml centrifuge tube	Corning	430829
70 mm sterile cell strainer	BD	352350
Advanced DMEM/F-12	GIBCO	12634010
Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer	Invitrogen	A24863
B-27 Supplement	GIBCO	17504044
Buffer 1			2 mM EDTA in DPBS
Buffer 2			54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS
C57/B6 mice	Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University
Cell-dissociation enzymes (TrypLE)	Life technologies	12605-010
Centrifuge	Eppendorf	5424
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit	Life technologies	C10639
CO2 incubator	Panasonic	MCO-18AC
DPBS	GIBCO	14190144
D-sorbitol	BBI	SB0491
EDTA	BBI	EB0185
ENR media			Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-106
Fine Iris Scissors	Tansoole	2037454
Fluorescence microscope	Olympus	FV1000
GlutaMAX Supplement	GIBCO	35050-061
Goat Serum	Life technologies	16210-064
HDMEM	Hyclone	SH30243.01B
HEPES	Sigma	H4034
Matrigel	Corning	356231
Minigut media			Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50)
N2 supplement	R&D	AR009
Nonionic surfactant (Triton X)	BBI	TB0198-500ML
Operating Scissor (12.5 cm)	Tansoole	2025785
Paraformaldehyde (PFA)	sigma	158127-500g
Penn/Strep	Invitrogen	15140-148
Phase contrast microscope	Nikon	TS1000
Propidium iodide	Sigma	P4170-25MG
Recombinant EGF	PeproTech	315-09
Recombinant Mouse Noggin	PeproTech	250-38
Recombinant Mouse R-Spondin 1	R&D	3474-RS-050
Recombinant Murine IL-22	PeproTech	210-22-10
Sucrose	BBI	SB0498
Tissue Forceps	Tansoole	2026704
Y-27632 2HC1	Selleck	S1049