冠動脈血管形成術後の心血管予後における冠動脈前駆細胞と可溶性バイオマーカー

要約

冠状血管形成術後の心血管予後に影響を与える主要な有害心血管イベントの発症は、冠状動脈損傷および血管修復の程度に影響を受ける。新しい冠状動脈細胞および可溶性バイオマーカーの使用は、血管損傷および修復に反応し、MACEおよび予後の発達を予測するのに有用である。

要約

主要な有害心血管イベント(MACE)は、冠状虚血性損傷による冠動脈血管形成術を受けている患者の心血管予後に悪影響を及ぼす。冠状動脈損傷の程度と血管修復のメカニズムは、メイセの将来の発展に影響を与える要因である。プラークの特徴や冠状動脈の複雑さのような内因性血管の特徴は、MACEsの予後情報を実証しています。しかし、冠動脈内循環バイオマーカーの使用は、冠動脈損傷および修復を伴う動的メカニズムをより密接に反映しているため、MACEの早期同定および予後のための便利な方法として仮定されている。血管形成術中の冠状動脈循環バイオマーカーの測定は、単核前駆細胞(PPC)の亜集団数、炎症、細胞接着、修復を反映する可溶性分子の濃度など、血管形成術中のバイオマーカーの測定を可能にし、血管形成術中の細胞増殖性冠動脈形成術後6ヶ月のメイスの将来の発展と予後の評価。この方法は、その翻訳性と、患者のリスク階層化に適用される可能性のある心血管予後への影響に関する末梢血循環バイオマーカーよりも優れた性能によって強調される血管形成術を受けている冠動脈疾患を伴う。

概要

冠動脈形成術およびステント留置は、冠状動脈疾患(CAD)患者の救済処置を表す。しかし、心血管死、心筋梗塞、冠動脈再狭心症、狭心症または失補償心不全のエピソードを含む主要な有害心血管イベント(MACE)は、冠動脈介入の数ヶ月後に起こり、病院への予定外の訪問を促す。MACEは世界中で一般的であり、そのモルビ死亡率は高い¹.

冠動脈虚血性損傷は、分化能および/または血管切換可能性によるMPCの動員、ならびに細胞間接着分子(IcaM)、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)、および活性酸素種の産生を伴う早期血管応答および修復メカニズムを誘導する。プラーク特性や冠状動脈の複雑さのような本質的な血管特徴は、MACEを予測するために使用されてきたが、冠状動脈内皮で起こる傷害および修復のメカニズムに関連するバイオマーカーは、冠状動脈血管形成術^{2、3、4、5}に提出されたCAD患者における心血管イベントの早期同定および予後に非常に有用であり得ることを示唆している。

冠動脈採取は血管損傷および修復⁶をより密接に反映しているため、CAD損傷および修復の根底にあるメカニズムを理解することに継続的な関心が、冠状動脈循環バイオマーカーを研究する動機となっている。しかし、ヒト研究における冠状動脈バイオマーカーの特性評価は^7,8,9に乏しい。そこで、本研究の目的は、冠状動脈循環型PPCおよび可溶性分子の量を決定し、血管損傷および修復の両方を反映し、これらのバイオマーカーが冠動脈血管形成術を受けたCAD患者のMACEsおよび臨床的予後と関連しているかどうかを示す方法を記述することであった。この方法は、血管損傷に最も近い位置をサンプリングすることによって得られる血管関連の循環型PPCおよび可溶性分子の使用に基づいている。また、下肢虚血、脳卒中、血管炎、静脈血栓症、および血管損傷および修復を伴うその他の傷害の臨床研究にも有用である。

プロトコル

このプロトコルは、人間研究倫理委員会の制度ガイドラインを満たしています。

1. 冠動脈造影、超音波、血液採取

1. 冠動脈介入の前にベースライン臨床情報と人口統計学的情報を要求する。個人のデータを収集する:年齢、性別、現在の喫煙状況、体重指数(BMI)、高血圧、脂質異常症、糖尿病、薬、および現在の冠動脈造影の適応症。
2. 放射状アプローチを用いて心臓カテーテル法を通して冠動脈造影を行う。この手順は、専門家の心臓専門医によるヘモダイナミクス室の透視法ガイドの下で行われるべきである。
   注:貴重な船舶を特定します。本研究では、貴重な血管は、1.5mmを超える断面を有する動脈および50%以上の内腔狭窄と定義された。
3. 対象領域に血管内超音波カテーテルを進め、画像を記録します。適切なソフトウェアを使用して、最小のルミナル領域を特定して測定します。
4. 冠状カテーテルを使用して、プラークに最も近い場所から10 mLの血液を採取します。
5. 患者の退院後、定期的な診療評価をスケジュールして、研究エンドポイントをフォローアップします。電話での連絡ができない場合や、医師の診察が2ヶ月以上遅れた場合は、承認された人(以前に設計された人)に研究エンドポイントを確認するよう依頼してください。
   注:以下のMACEのいずれかを考慮してください:1)心血管死、2)新しい心筋梗塞、3)24時間以内の予定外の医療訪問を促す不安定狭心症、4)冠状動脈血管造影法によって示されるようにステント残骸症、5)補償なしのエピソード臨床的注意を必要とする心不全。

2. 循環型PPCの決定(図2)

1. 採取から1時間以内に血液を処理する。採取した血液の6mLを15mLの円錐管に移し、1:1(v/v)1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈し、pH=7.4とした。
2. 3つの試験管に2mLの密度勾配媒体を加えます。希釈された血液の3つの等量のアリコートを、密度勾配培地を含む各試験管に慎重に移す。
   注:濃度勾配培地と希釈血液の総体積は、試験管の最大容量の4分の3を超えてはならない。
3. 遠心分離機 1,800 x g、4°Cで 30 分間、レイヤー間の界面でバンドを新しいチューブに移します。PBSと遠心分離機を1,800 x gで2 mL加え、6分間4°C。ペレットには、PPC が含まれます。
4. ペレットを数回洗います。前の溶液を吸引し、フレッシュPBSで細胞ペレットを静かに再懸濁します。その後のスミッシュの場合、1,800 x g、4°Cで2分間の遠心分離機を処理 6x.
5. 細胞ペレットをPBSの1 mLで再懸濁する。20 μLの細胞懸濁液を0.4%トリパンブルーで混合し、1:1(v/v)希釈した。血球計に滴をかけ、染色されていない細胞を光顕微鏡で数えます。
6. PPC 判定に進みます。標識5 mLフローサイトメトリーチューブおよびアリコートアウト 1 x 10⁶細胞 1チューブ当たり。対応するアイソタイプマッチコントロール抗体を準備する。遠心分離機 1,800 x g,4°Cで6分間、上清を捨てます。
7. 1x PBS(pH= 7.4)、2 mMエチレンジアミンテトラセチン酸(EDTA)、および0.05%ウシ血清アルブミン(BSA)からなる抗体インキュベーション溶液の100μLで希釈した一次抗体を加える。10sのために再サスペンドし、光保護された4 °Cで20分間インキュベートします。このプロトコルは、PBS中の4%パラホルムアルデヒドにリンパ球を固定し、4°Cで最大24時間サンプルを貯蔵することによって、このステップで一時停止することができる。
   注:本プロトコルで使用された一次抗体の最終濃度は、CD45 1:50、CD34 1:20、KDR 1:50、CD184 1:20、CD133 1:50であった。
8. 遠心分離機 1,800 x g,4°Cで2分間、上清を捨てます。1x PBS(pH = 7.4)の500μLで再サスペンド、2 mM EDTA。
9. フローサイトメトリー分析を行います。アイソタイプマッチコントロール抗体を使用して、背景染色を設定します。次に、FSC/SSCプロットで広がるリンパ球を選択し、残存顆粒球、細胞破片、およびプロット中の左下に位置する他の粒子を排除しようとしている。このような分布は100%と考えられる。
10. 一般的な免疫表現型CD45+およびCD34+を有する多数の細胞を含む^{ゲートを使用}する。二重陽性免疫フェノタイプの場合は、以前に識別されたゲートCD45 +、CD34+、KDR(VEGFR-2)+、CD133+、またはCD184+のいずれかを加えて使用する。MPC サブ集団を特定のセル サーフェス マーカーで識別します。ゲート付きイベントの割合として報告します。
11. MPC の主要なサブ集団を識別します。本研究では、主な免疫フェノタイプはCD45⁺CD34⁺CD133 + CD133⁺CD45⁺CD34⁺CD184⁺CD45⁺CD133⁺CD184 + CD45 + CD34+ Cd184⁺CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD45+ CD34+ CD14 +^CD14+ CD14 +^CD14+ CD44 + CD14 + CD14 + CD44 + CD44 + CD14 + CD14 + CD14 + CD14 + CD14 + CD14 + CD14 + CD14 + CD44 + CD44 + CD44 + CD44 + CD14 + CD14 + CD144 + CD144 + CD44 .
    注:使用した細胞表面マーカーはCD45(リンパ球)、CD34(内皮および/または血管細胞)、KDR(VEGFR-2、内皮細胞の膜マーカー)、CD133(内皮前駆細胞)、およびCD184(造血幹細胞および内皮細胞)であった。

3. 血漿溶性バイオマーカーの測定

1. 酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を使用して、SICAM-1およびMMP-9の濃度を決定します(図3、上段)。
   1. 血液サンプルを3,000 x gで遠心分離し、室温を5分間、血漿を収集する。
   2. 規格、サンプルチューブ、制御管にラベルを付けます。ELISAキットに設けられた洗浄バッファーで2xを洗浄することにより、予め塗ったウェルをアッセイプレートに平衡化する。
   3. 標準、サンプル、およびコントロールを井戸に移します。37°Cで90分間密閉し、インキュベートします。
      注:井戸を完全に乾燥させないでください。
   4. 内容物を廃棄し、ビオチン検出抗体を追加する。37°Cで60分間密閉し、インキュベートします。
   5. 内容物を捨てて3倍洗います。プラークを密封し、ストレプタビジン作動溶液を用いて順次インキュベートし、続いてテトラメチルベンジジン基質を30分間37°Cで、光保護した。インキュベーションの間に3倍洗います。色が現れるときは、停止液を加え、マイクロプレートELISAリーダーで光学密度吸光度を読み取ります。
2. 免疫磁気多重アッセイを用いて、腫瘍壊死因子α(TNFα)およびインターロイキン1β(IL-1β)の濃度を決定する(図3、下段)。
   1. 規格、サンプルチューブ、制御管にラベルを付けます。
   2. 30 s.ビーズの懸濁液を適切なサイズのチューブに移し、その後多重アッセイプレートのウェルに送ります。周期的な渦はビーズの沈殿を避ける。
   3. ハンドヘルド磁気プレートの洗濯機をしっかりと差し込み込む。ビーズが各ウェルの底に蓄積するまで2分間待ち、手持ち型の磁気プレート洗濯機とプレートアセンブリの両方をシンクまたは廃棄物容器の上に素早く反転させます。ウェル内のビーズを維持するために、手持ち型の磁気プレートを使用することを忘れないでください。
   4. 各ウェルに150μLの洗浄バッファーを加え、30秒待ってビーズが底に蓄積できるようにします。ステップ 3.2.3 のように内容を破棄します。次に、25 μL のユニバーサルアッセイ バッファー (キットに付属) を加え、その後に 25 μL の準備済みスタンダード、サンプル、およびコントロールを追加します。
   5. プレートを密封し、室温で最低60分間インキュベートし、光保護され、500rpmで一定の振とう。あるいは、4°Cで一晩インキュベートし、光保護し、可能であれば500rpmで一定の振とうを行う。
   6. 150 μLの洗浄バッファを加えて2倍洗浄し、30秒待ちます。2分待って、シンクまたは廃棄物容器の上に反転します。
   7. 25 μLの検出抗体混合物を連続してインキュベートし、続いて25 μLのストレプトアビジン-PE溶液を室温で30分間、密閉し、光保護し、500rpmで一定の振盪を行います。ステップ3.2.6で説明したように、インキュベーション間で2xを洗浄する。
   8. 測定値を取得します。120 μLの読み取りバッファを追加します。プレートを密封し、室温で5分間インキュベートし、光保護され、500rpmで一定の振とう。多重アッセイリーダーで読み取りを実行します。各分析物に従って読み取りパラメータを調整します。

結果

冠動脈、静脈静脈、及び末梢血を冠動脈造影を受けた52人の患者(図1)から採取し、高血圧および脂質異常症の有病率が高いことを示した。臨床フォローアップでは、11(21.1%)冠動脈造影術の6ヶ月後に発生したMACEs:死(n=1)、入院を必要とする狭心症(n=6)、心筋梗塞(n =2)、および/または心不全の証拠(n = 4)。

ディスカッション

冠状動脈の血中採取が困難な場合があります。冠状動脈は、ほとんどアクセスできない場合があります。この場合、静脈の静脈からのサンプリングは代替であり得る。冠動脈と静脈の静脈の静脈の循環バイオマーカーを比較する検証試験を行いましたが、有意な違いはありません。しかし、循環バイオマーカーの性能は冠状動脈サンプリングに対してのみ検証された。従って、静脈の静脈か?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA	Roche	10735086001	Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending.
Calibration Beads	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-607	MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests
CD133/1 (AC133)-PE	Milteny Biotec / MACS	#130-080-801	Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer
CD184 (CXCR4)-PE-VIO770	Miltenyi Biotec / MACS	#130-103-798	Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated
CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-601	Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer
CD34-FITC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-081-001	The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34
CD45- VioBlue	Miltenyi Biotec / MACS	#130-092-880	Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated
Conical Tubes	Thermo SCIENTIFIC	#339651	15ml conical centrifuge tubes
Cytometry Tubes	FALCON Corning Brand	#352052	5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12x75 style. Sterile.
EDTA	BIO-RAD	#161-0729	Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe <0.01%, As <1ppm, Insolubles <0.005%
Improved Neubauer	Without brand	Without catalog number	Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2)
K2 EDTA Blood Collection Tubes	BD Vacutainer	#367863	Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL.
Lymphoprep	Stemcell Technologies	01-63-12-002-A	Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL
Paraformaldehyde	SIGMA-ALDRICH	#SZBF0920V	Fixation of biological samples, (powder, 95%)
Pipette Transfer 1,3mL	CRM Globe	PF1016, PF1015	The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy.
Test Tubes	KIMBLE CHASE	45060 13100	Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm