ヒト好中球群れの化学化学および分子解析のための生体微粒子マイクロアレイ

要約

このプロトコルは、空間的に制御された好中球群を提供するバイオ粒子マイクロアレイを生成する。これは、好中球が移行中に放出するメディエーターに容易にアクセスでき、定量的な画像分析を可能にします。

要約

好中球の群れは、好中球が感染部位を封鎖し、組織の再編成を促進する協調プロセスである。群れの特徴を示す動物モデルにおいて、細胞移動の特徴的なパターンを示す動物モデルにおいて、古典的に生体内で研究されている。しかし、in vivoモデルには、アクセスと分析が困難な細胞間メディエーター、およびヒト好中球を直接分析することができないなど、いくつかの制限があります。これらの制限のため、ヒト好中球で群りを研究し、群れの間に生成される分子信号に容易にアクセスできるin vitroプラットフォームが必要です。ここでは、多段階マイクロスタンププロセスを使用して、生体内感染を模倣して群れを刺激するバイオ粒子マイクロアレイを生成します。バイオ粒子マイクロアレイは、制御された安定した方法で群れを作る好中球を誘導する。マイクロアレイでは、好中球は速度が上昇し、バイオ粒子クラスターの周りに安定した群れを形成します。さらに、好中球によって生成された上清が分析され、16個のタンパク質が群れの過程で異なって発現されていたことが発見された。このインビトロ・ストウォーミング・プラットフォームは、再現性のある空間的に制御された方法で好中球の移動およびタンパク質放出を直接分析します。

概要

好中球は、血流¹で最も豊富な白血球であり、潜在的な診断および治療標的として注目を集めている^2,3は^、色あさ4、敗血症^、外傷^5、6、癌^1、7、8、および様々な自己免疫疾患^5,9を含む様々な病状に関与する可能性があるためである。好中球の群れは、多段階で厳しく調節されたプロセスであり、複雑さを伴う複雑性を有し、研究^5、10、11の特に興味深い焦点となっている。群れの間、好中球は周囲の健康な組織^5、10、11から炎症部位を単離する。好中球群れの適切な調節は創傷治癒を促進するために不可欠であり、最終的には炎症解決^5、12。好中球の群れは、主にげっ歯類^{12、13、14、15}およびゼブラフィッシュ^{10、11、12、15}モデルで生体内で研究されている。しかし、これらのin vivo動物モデルの性質は、制限⁵を生じさせる。例えば、群れの間に好中球によって放出されるメディエーターは、分析⁵のために容易にアクセスできない。さらに、インビボで与えられたメディエーターには多くの潜在的な情報源があるので、インビボ実験は、所定のプロセス¹³におけるそのメディエーターの役割を調査するために細胞産生および/または相互作用を阻害する遺伝的欠乏を導入しなければならない。インビトロ実験は、追加の細胞のコンテキストなしで好中球観察を可能にすることによって、この合併症を回避する。さらに、ヒト好中球協調移動を記述する研究は限られた¹⁶である。インビトロの群れプラットフォームでは、ヒト好中球を直接分析することができます。インビトロの群れのプラットフォームは、in vivo研究の限界によって残されたギャップを埋める機会を提供することによって、インビボ研究から得られた知識を拡大する可能性がある。

インビボ好中球群れを模倣するインビトロプラットフォームの必要性に対処するために、好中球の群れを空間的に制御した方法でバイオ粒子マイクロアレイをパターン化できるマイクロスタンププラットフォームを開発しました。2段階のプロセスで、ガラススライド上にバイオ粒子マイクロアレイを生成します。まず、マイクロスタンプを使用して、カチオン性多電解質(CP)スポットのマイクロアレイを生成します。次に、静電気相互作用を介してCPスポットに付着するバイオ粒子の溶液を添加します。まずCP層をパターン化することにより、負に帯電したバイオ粒子を選択的にパターン化して、所望の好中球群れパターンを生成することができる。正に荷電した層は、CPを持たないガラススライド上の領域から生体粒子を取り除く精力的な洗浄ステップを経て負に荷電した生体粒子を保持する。これは、ガラススライドにミクロンサイズのバイオ粒子を固定化する非常に高い表面電荷を有し、したがって、ガラススライド上のパターン化された位置から粒子を除去することから好中球を阻害する。これは、マイクロアレイに配置されたバイオ粒子クラスターをもたらす。マイクロアレイに好中球を加えたところ、バイオ粒子クラスターの周りに安定した群れを形成しました。好中球の移動を追跡すると、群れの好中球が積極的にバイオ粒子クラスターに向かって移動することがわかりました。さらに、このプラットフォームを使用して、群れの間に好中球が放出する特定のメディエーターを分析しました。群れの間に差を出して表現される16のメディエーターを見つけました。彼らの濃度は、時間の経過とともに3つの一般的な傾向に従います: 増加, 減少, またはスパイク.私たちのインビトロ好中球群れプラットフォームは、空間的に制御されたヒト好中球群れの分析、ならびに好中球群れによって放出されるメディエーターの収集と分析を容易にする。以前の出版物では、特定の病状(外傷、自己免疫疾患、敗血症)を有する患者が、健康なドナーからの患者とは異なる機能を有する好中球^を有することを実証した5。今後の研究では、当社のプラットフォームを使用して、さまざまな患者集団の中で好中球機能を分析することができます。このプラットフォームは、好中球群れの複雑な配位を定量的に分析することができる。特定の患者集団の好中球機能または目的の病原体に対する好中球応答に関する洞察を提供するために、追加の研究を行うことができる。

プロトコル

著者らは、親切に献血した健康なボランティアを認めている。血液検体は、オハイオ州立大学の生物医学委員会によって審査#2018H0268機関審査委員会(IRB)プロトコルに従って、インフォームド・ボランティアの同意の後に得られました。

1. バイオ粒子マイクロアレイの微細加工

1. 標準的なフォトリソグラフィ手順を使用して、マスターシリコンウエハを生成します。
   1. コンピュータ支援設計(CAD)ソフトウェアを使用して目的の設計の証明を生成し、フォトマスクの製造者に送って、クロームフォトマスクを作ります。ここで使用される設計は、150 μmの中央から中央の間隔で円で満たされた直径30μmの4ミリメートルの長方形配列です。この設計は、さまざまなアプリケーションに合わせて変更できます。
   2. シリコンウェーハ上に40μmの厚い層の陰性フォトレジストをスピンコートします。ウェハを65°Cで5分間、95°Cで10分間焼きます。
   3. 150~160 mJ/cm²のクロムフォトマスクを通してウエハをUV光に露出させる(図1A)。
   4. 65°Cで5分間、95°Cで10分間焼き、フォトレジスト現像で10分間、イソプロピルアルコールでリンスします。この段階では、パターンがウエハ上に表示されているはずです(図1B)。
2. ポリジメチルシロキサンプレポリマーと硬化剤の10:1の比率(すなわち、プレポリマー20gおよび硬化剤2g)を十分に混合し、未硬化ポリジメチルシロキサン(PDMS)混合物をペトリ皿のマスターウエハ上に注ぐ(図1C)。
3. 真空は、マスターウェーハ上に気泡が存在しなくなるまで、未硬化のPDMS混合物を処理します。65°Cで一晩硬化する。
4. メスを使用してウエハーのパターンセクションの外側をカットし、硬化したPDMSスラブをゆっくりと取り除きます。パターン化された側面を上に向けて、PDMSスラブを清潔なまな板に置きます(図1D)。
5. PDMSスラブから8mmの生検パンチ(図1E)で個々のスタンプをパンチアウトします。1枚のガラススライドには、8枚の切手が必要です。
6. 各スタンプを粘着テープの上に下に置き、破片を取り除きます。
7. あらかじめ、水にCPの1.6mg/mL溶液を調製します。
   1. CP粉末の適正量を水に加えます(例:0.8g~500mL)。
   2. 室温で一晩かき混ぜ、またはすべての固体が水に溶解するまで混ぜる。CP溶液は、室温で6ヶ月間保存することができる。
   3. 必要に応じて、蛍光灯を発するポリL-リジンを蛍光(PLL-FITC)で標識した蛍光を発します。
      1. CP溶液のアリコート約10mL。少量のPLL-FITC(0.05 mg)を分量に加えます。量は、所望に応じて蛍光の明るさを調整するように変更することができる。
      2. 20 sのFITCで標識されたCP溶液をボルテックス、または溶液が均一な、淡い黄色になるまで。光から保護し、最大1ヶ月間4°Cで保管してください。
8. スタンプを上にして、CPの1.6mg/mL溶液の100 μLで各スタンプをプライムし、CP溶液とスタンプの間に気泡が形成されないようにします(図1F)。
9. CP溶液の層にスタンプを反転します(図1G)。
10. CP溶液から1時間後にスタンプを取り外します。
11. 濡れたスタンプを、きれいなガラスのスライド6~8xに下に下にして、余分な液体を取り除きます。
12. 1~2分の切手を真空処理します。
13. きれいなガラスのスライドの上に8つの井戸、9 mmの直径のイメージ投射スペーサーを押印の配置のためのガイドとして付着する。このスペーサーを使用すると、各ガラススライドは8つのマイクロアレイを持つことができます。
14. イメージスペーサーの各ウェルの中央にあるスライドガラスの上にスタンプを下に置きます(合計で8枚のスタンプを使用します)。
15. 各スタンプの上に5.6 ±0.1 gのバランスの取れた重さを置き、スタンプを10分にします(図1H)。バランスの取れた重量は、スタンプがガラススライドに均等に押し込まれ、CPをガラススライドに均等に移すために必要です。
16. ガラススライドから重みとスタンプを取り外します(図1I)。CP層を、ステップ1.17で説明したように、バイオ粒子を加える前に24時間室温で乾燥させます。CPにFITCタグが付けられている場合、この時点で488nmの蛍光顕微鏡でスタンプの有効性を確認してから、ステップ1.17(図1M)に進むことができます。
17. 空のPDMSスラブをイメージングスペーサーのサイズにカットし、8mmの生検パンチを使用して、イメージングスペーサーの井戸に合わせた井戸をPDMSに作成します。PDMSスラブをイメージングスペーサ(図1J)でガラススライドに付着させます。
18. バイオ粒子(例えば、大腸菌またはzymosan)の溶液を解凍し、注射用水(WFI)で500μg/mLに希釈します。
    注:バイオ粒子はオプソン化する必要はありません。好中球表面受容体は、これらの生体粒子^19、20、21上の分子を直接認識する。
19. 各PDMSウェルに100 μLのバイオ粒子溶液をグラススライドで加えます(図1K)。
20. グラススライドを30分間揺らす。
21. 井戸を水で十分に洗い流します。バイオ粒子マイクロアレイは、4°Cのダストフリー環境に最大3ヶ月間保存できます。この時点で、パターンは、ステップ2.1(図1N)に進む前に、594 nmの蛍光顕微鏡でチェックする必要があります。

2. サンプルの準備

1. 目的のドナーからK2-EDTAチューブに少なくとも2 mLの新鮮な血液を集める。好中球の期待される収量は、1~2 x 10⁶細胞/1 mL全血です。イメージングアッセイには約1.5 x 10⁵の好中球が必要であり、上清の分析には1 x 10⁶好中球が必要です。血液を4時間以内に使用します。
2. 赤血球(RBCs)を分離し、全血に対して1:5の比率で赤血球凝集剤を添加する。RBCの層から分離するために、半透明の層(バフィーコート)が45分待ちます。
3. バフィーコートを取り出し、1 mLバフィーコート(9 mL PBS)を使用してリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗います。
4. 遠心分離機は190×gおよび20°Cで5分間。
5. 上清を吸引し、ペレットを5 x 10⁷細胞/mLで再懸濁します。
6. 負の免疫磁気選択キットを使用して好中球を分離します。
   1. 50 μLの抗体カクテル/1 mL細胞懸濁液を添加します。10分待ちます。
   2. 100 μLの磁気ビーズ/1 mLセルサスペンションを追加します。10分待ちます。
   3. 丸底チューブにセルサスペンションを追加し、円筒形の磁石に入れ.10分待ちます。
7. 遠心分離管に上清を注ぎます。最大 10 mL の PBS を追加します。遠心分離機は190×gおよび20°Cで5分間。
8. 吸海上清。0.4%のヒト血清アルブミンを用いてIMDM中の白いペレットを再懸濁する。
9. 37 °Cで10分間、20 μg/mLのホーチスト33342を有する染色核。
10. 0.4%のヒト血清アルブミンをリンスにIMDMの5 mLを加える。遠心分離機は190×gおよび20°Cで5分間。
11. 0.4%のヒト血清アルブミンを用いてIMDM中の^7.5 x 10 5細胞/mLで細胞を再懸濁する。
12. バイオ粒子マイクロアレイを含むPDMSウェルに細胞懸濁液を100μL加える。セル懸濁液がPDMSの上部に凸で覆われ、泡が含まれていないことを確認します。
13. 直径12mmのカバースリップでシール。PDMSの開口部を直径12mmのカバースリップでうまく覆います。余分な細胞懸濁液がウェルの端に逃げないように、ピンセットでカバースリップにそっと押し下げます。組織を使用して、余分な細胞懸濁液を除去する。

3. アッセイと画像解析の実行

1. 37°C、5%CO2、および90%相対湿度に設定されたケージインキュベーターを備えた顕微鏡を備えた顕微鏡を用いて、生きた細胞イメージングステーションに細胞を搭載した微粒子アレイをロードします。
2. タイムラプス蛍光および明視野顕微鏡を使用して、405 nm、594 nm、およびブライトフィールドで10sごとに10倍の倍率で画像を記録します。典型的な実験では、画像は最大2時間収集されます。
3. 自動化された細胞追跡ソフトウェアを使用して、バイオ粒子クラスターに向かう個々の好中球の移動を追跡します。
   1. スポット検出セルトラッキングソフトウェアの自己回帰モードを使用します。スポット半径を 5 μm (好中球核のおおよそのサイズ) に設定します。最小トラック長を 120 s に設定し、最大ギャップサイズを 1 フレームに設定します。
   2. 細胞追跡ソフトウェアによって生成されたデータから、好中球の位置および速度を含むファイルを抽出する。これらのファイルは、好中球移動トラック(図2C)と速度対時間のヒートマップ(図2D)を生成するために、グラフ化ソフトウェアと共に使用することができます。
4. 405 nm 蛍光画像を使用して、選択した画像解析ソフトウェアで時間の経過とともに群れのサイズを追跡します。
   1. 好中球が群がる各バイオ粒子クラスターの周辺の関心領域(ROI)を定義します。各バイオ粒子クラスターを分析するために同じサイズのROIを維持します。
   2. 各ROI内の405nm画像の平均蛍光強度を経時に分析します。
   3. 0 μm²から最大群サイズまでのさまざまな群れサイズで手動で測定を行い、平均蛍光強度の較正曲線を生成して群れサイズを測定します。このキャリブレーションを使用して、時間の経過に合った群れのサイズを計算します。

4. 上清の収集とタンパク質の検出

1. 37°Cでのバイオ粒子マイクロアレイを含むウェル内の好中球をインキュベートし、3時間の5%CO2で。希望の時間にサンプルを取ります。通常、サンプルは 0、0.5、1、および 3 h で取得されます。タンパク質アレイアッセイの検出限界を克服するために、単一ウェルの上清の全容積(200μL)を各時点に用いた。各時点を三重で分析した。
2. 明視野顕微鏡を使用して、マイクロアレイ上に群れが形成されていることを確認します。
3. 上清を200μLピペットで吸引し、0.45μm遠心フィルターチューブに負荷を入れられます。
4. 上清を190×g、20°Cで5分間遠心分離し、濾過容を収集します。
5. サンプルは、処理時間まで-80°Cで保存します。
6. サンプルを処理するために、さまざまなヒトタンパク質を検出するマイクロアレイキットを使用します。
   1. キットに付属の透析チューブに各サンプルの200 μLを加えます。
   2. 透析管を少なくとも500 mLのPBS(pH= 8.0)を含むビーカーに入れる。4°Cで少なくとも3時間、かき混ぜ皿の上で軽くかき混ぜます。ビーカーの PBS を変更し、この手順を繰り返します。
   3. 各サンプルをきれいな遠心分離管に移し、9,000 x gで5分間遠心分離し、沈殿物を除去します。各上清を清潔なチューブに移します。
   4. ビオチン化したサンプルは、透析サンプル中の全タンパク質1mg当てキットから36μLの1x標識試薬を180μLの透析試料に添加する。20°Cで30分間インキュベートし、5分ごとに穏やかに混ぜます。
   5. キットに付属の3μLの停止溶液を各サンプルチューブに加えます。各サンプルを新鮮な透析チューブに移し、ステップ4.6.2~4.6.3を繰り返します。この段階では、サンプルは、続行する準備ができるまで-20 °Cまたは -80 °Cで保存できます。
   6. キットに付属のガラススライドは-20°Cで保存されます。室温に戻すことを許可します。組み立てられたガラススライドを、室温で1~2時間の層流フードに入れます。
   7. 組み立てられたガラススライドの各ウェルに、キット付属のブロッキングバッファを400μLずつ加えます。室温で30分間インキュベートします。
   8. 調製したサンプルを9,000 x gで5分間遠心分離し、沈殿物または微粒子を除去する。ブロッキングバッファーで5倍希釈します。
   9. 各ウェルからブロッキングバッファを削除します。希釈したサンプルを400μLを適切なウェルに加えます。ロッキングしながら室温で2時間インキュベートします。
   10. 各井戸からサンプルをデカントします。1xウォッシュバッファの800μLで3xを洗浄し、ロッキングしながら、それぞれ5分間室温でキットを用意しました。
   11. きれいな容器に、組み立てられたガラスのスライドを1xウォッシュバッファI.5分間室温で洗い流し、揺らしながら2xを洗います。
   12. 各サブアレイに、1x Cy3-conjugated streptavidinの400 μLを追加します。プラスチック製の接着剤ストリップで覆います。プロトコルの残りの部分のために光から保護します。
   13. ロッキングしながら室温で2時間インキュベートします。
   14. 溶液をデカントし、サンプルチャンバーからガラススライドを分解します。
   15. キットに付属の30 mL遠心チューブに、ガラススライドと十分な1x洗浄バッファIを慎重に追加して、ガラススライドをカバーします。ロッキングしながら室温でそれぞれ10分間3倍洗います。
   16. 30 mL遠心管内で、1x洗浄バッファー II で 2x を洗浄し、ロッキングしながら室温でそれぞれ 5 分間洗浄します。
   17. 30 mLのddH₂Oで5分間洗い流し、遠心管からガラススライドを取り出し、層流フードで20分間乾燥させます。準備したガラススライドは、スキャンの準備ができるまで-20°Cで保存することができる。
   18. 555 nmの蛍光発光でマイクロアレイスキャナーでガラススライドをスキャンします。

結果

好中球をバイオ粒子マイクロアレイに添加すると、バイオ粒子クラスターに接触する好中球が活性化し、群れ応答を開始します。バイオ粒子マイクロアレイは、タイムラプス蛍光顕微鏡法を用いて、バイオ粒子クラスターに向かう好中球の移動を追跡することを検証した(Video S1)。個々の好中球核の移動は、バイオ粒子クラスターに向かって移動する過程で追跡される。好中球が?...

ディスカッション

インビトロ好中球群を刺激するバイオ粒子の均一な配列を生成するマイクロスタンププラットフォームを開発しました。私たちのプラットフォームのインビトロの性質は、私たちはin vivo群れの実験、すなわち群れの好中球⁵によって放出されるメディエーターを分析する能力が低い、で生じる合併症を回避することを可能にします。さらに、in vivoモデルは、通常、げっ歯類1...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
"The Big Easy" EasySep Magnet	STEMCELL Technologies	18001	Magnet to use with neutrophil isolation kit
Cell Incubator	Okolab	777057437 / 77057343	Okolab cage incubator for temperature and CO2 control
EasySep Human Neutrophil Isolation Kit	STEMCELL Technologies	17957	Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils
Eclipse Ti2	Nikon Instruments	MEA54010 / MEF55037	Inverted research microscope
Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate	Invitrogen	E2863	Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag® array
Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch	Sigma Aldrich	Z708925	To cut PDMS stamps
HetaSep	STEMCELL Technologies	7906	Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570	Nucleus fluorescent stain
Human L1000 Array	Raybiotech Inc.	AAH-BLG-1000-4	High density array to detect 1000 human proteins
Human Serum Albumin (HSA)	Sigma Aldrich	A5843	Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils
Iscove's Modified Dulbeccos' Medium (IMDM)	Thermo Fisher Scientific	12440053	To resuspend isolated neutrophils
K2-EDTA tubes	Thermo Fisher Scientific	02-657-32	Tubes for blood collection
Low Reflective Chrome Photomask	Front Range Photomask	N/A	Dimensions 5" x 5" x 0.09" (L x W x D)
Microarray Scanner	Perkin Elmer	ASCNGX00	Fluorescence reader of protein patterned microdomains
Microscopy Image Analsysis Software - Imaris	Bitplane	9.3.0	Software for automatic cell tracking analysis
NiS Elements Advanced Research Software Package	Nikon Instruments	MQS31100	Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation
Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC)	Sigma Aldrich	P3069-10MG	30,000 - 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution
SecureSeal 8-well Imaging Spacer	Grace Bio-Labs	654008	8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer
Silicon Wafer	University Wafer	590	Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 μm SSP test
Spin Coater	Laurell	WS-650MZ-23NPPB	Used to spincoat a 40-µm layer of photoresist onto silicon wafer
SU-8 2025	MicroChem	2025	Negative photoresist to make silicon master wafer
SU-8 Developer	MicroChem	Y020100	Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer
Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS)	Dow	1673921	2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells
UV Exposure Masking System	Kloé	UV-KUB 2	Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light
Water	Thermo Fisher Scientific	A1287303	High quality water to dilute bioparticles
Zetag 8185	BASF	8185	Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms "inking solution" for microstamping when dissolved in water
Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate	Invitrogen	Z2843	Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array