ヒト羊膜の異なる解剖学的領域からの上皮細胞のインビトロ培養

要約

このプロトコルは、ヒト羊膜の異なる解剖学的領域からの上皮細胞の単離を記述し、臨床および生理学的病理学モデルにおける可能な適用のための異質性および機能的特性を決定する。

要約

ヒト羊膜上皮細胞(HAEC)の単離および培養のための文献にはいくつかのプロトコルが報告されている。しかしながら、これらは羊膜上皮が均質な層であると仮定する。ヒト羊膜は、反射、胎盤、臍の3つの解剖学的領域に分けることができる。各領域は、病理学的状態などで異なる生理学的役割を有する。ここでは、ヒト羊膜組織を3つのセクションで解剖し、インビトロで維持するプロトコルについて説明する。培養では、反射した羊膜に由来する細胞は立方体形態を示し、胎盤領域と臍領域の両方の細胞は扁平上皮であった。それにもかかわらず、得られた全ての細胞は上皮表現型を有し、E−カドヘリンの免疫検出によって実証される。したがって、その場での胎盤領域と反射領域は細胞成分と分子機能が異なるため、IN vitro試験ではHAECの使用に生理的な影響を及ぼす可能性があるため、これらの違いを考慮する必要がある場合があります。生物医学研究と再生医療におけるこれらの細胞の有望な応用

概要

ヒト羊膜上皮細胞(HAEC)は、胚発生の初期段階で、約8日後の受精で生じる。それらは、羊^膜1の最も内側の層から派生するエピブラストの扁平上皮細胞の集団から生じる。従って、HAECは、^胚2の3つの生殖層に分化する可能性を有するエピブラスト由来の多能性細胞の残骸と考えられる。過去10年間に、多様な研究グループは、これらの細胞を妊娠期の羊膜から分離し、インビ^トロ3、4の培養モデルにおける推定多能性関連特性を特徴付ける方法を開発した。

従って、表面抗原SSEA-3、SSEA-4、TRA 1-60、TRA 1-81などのヒト多能性幹細胞(HPSC)のHAEC特徴特性が判明した。多能性転写因子OCT4、SOX2、およびNANOGのコア;増殖マーカーKI67は、それらが自己更新していることを示唆する5、6、7。さらに、これらの細胞は、3つの生殖層(外胚葉、中胚葉、内胚葉)^の系統特異的マーカーに対して陽性の細胞を得るために分化プロトコルを用いて挑戦^{されてきた4、5、8、}ならびにヒト疾患の動物モデルにおいて。最後に、HAECエクスプレスE-カドヘリンは、HPSC^5、9と同様に上皮的な性質を保持していることを実証します。

胚起源とは別に、HAECは、抗炎症分子および抗菌分子10、11、成長因子およびサイトカイン^放出12の分泌、HPSC2とは対照的に免疫不全マウスに移植された場合の奇形腫の形成、および免疫学的耐性など、異なる臨床用途に適した他の本質的特性を有する。移植¹³.

しかし、これまでの報告では、ヒト羊膜は同種の膜であると仮定しており、解剖学的および生理学的に3つの領域に分けられることを考慮せずに:胎盤(デシドゥア基底を覆う羊膜)、臍帯(臍帯を包む部分)、および反射(膜の残りの部分は胎盤に付着^{していない)14。}羊膜の胎盤および反射領域は、形態、ミトコンドリア活性、活性酸素^種15の検出、miRNA^発現16、およびシグナル伝達^経路17の活性化における変化を示すことを示している。これらの結果は、ヒト羊膜が異なる機能を有する異種集団によって統合され、その結果またはインビトロモデルのいずれかで行われるさらなる研究のために考慮されるべきであることを示唆している。他の研究室は、膜全体からHAECを分離するためのプロトコルを設計していますが、我々の研究室は、異なる解剖学的領域から細胞を分離、培養、および特徴付けるプロトコルを確立しました。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

このプロトコルは、メキシコシティのナシオナル・デ・ペリナトロジアの倫理委員会によって承認されました(レジストリ番号212250-21041)。これらの研究で行われたすべての手順は、ナシオナル・デ・ペリナトロジーア内科学会の倫理基準、ヘルシンキ宣言、および保健省の公式メキシコ規格に定められたガイドラインに従っていました。

1. 準備

1. EDTAで1x PBSの溶液を準備します。これを行うには、0.5 m EDTA ストックの 500 μL を 1x PBS の 500 mL に加え、最終濃度 0.5 mM EDTA を入力します。
2. HAECの培養培地を準備します。高グルコースDMEMの450 mLを取り、5mLのピルビン酸ナトリウム(100mM)、幹細胞に適格な熱不活性胎児ウシ血清の50mL、非必須アミノ酸5mL(100x)、抗生物質抗粘薬(100x)の5mL、L-グルタミンの5mLを補う。500 μL のメルカプトエタノール (1,000x)。
3. 組織を輸送し、処理するための容器を殺菌する:手術室から実験室に胎盤全体を輸送するための蓋付きのステンレス鋼の容器、前に胎盤全体から血液を洗浄し、除去するトレイ(20 cm x 30 cm x 8 cm)羊膜の解剖と、羊膜を3つの領域に分離するプラスチック製のまな板と。
4. 手術器具(メス、はさみ、鉗子、クランプ)、500 mLビーカー、綿ガーゼ、生理食塩水を殺菌します。

2. 胎盤組織の取得

注:羊膜は、全身妊娠(37−40週)の女性から得られ、帝王切開の徴候の下で、活動的な分娩の証拠もなく、そして感染の微生物学的特徴もない。完全な分離および培養手順は、無菌条件下でバイオセキュリティキャビネット内で行われた。

1. 手術室で臍帯を締め、組織の残りの部分への血流を防ぎます。滅菌容器にクランプされた臍帯で胎盤全体を収集します。
2. 500 mL の生理塩水を容器に加える。
3. 容器を閉じ、室温で実験室に組織を運ぶ。
4. バイオセキュリティキャビネット内に胎盤入りの容器を入れます。
   注:分離物が胎盤を採取してから15分以内に行われなかった場合は、処理まで容器を氷上に置きます。胎盤を得て解剖を開始するまでの経過時間は1時間を超えないようにしてください。

3. 羊膜の領域ごとの機械的分離

メモ:手順は、無菌条件下および室温でバイオセキュリティキャビネット内で行う必要があります。

1. 容器から胎盤全体を取り出し、臍帯を上向きにトレイに置きます。
2. 滅菌綿ガーゼを使用して、胎盤を覆う絨毛膜羊膜の表面から血栓をきれいにします。
3. 膜の3つの領域を特定する:臍帯を包む臍羊膜、デシドゥア基底を覆う胎盤羊膜、および胎盤に付着していない残りの羊膜である反射領域(図1)。
4. 臍羊膜領域を解剖する ( 図2A)。
   1. 解剖鉗子を使用して、胎盤および臍帯の接合部を覆う羊膜の部分を保持する。
   2. メスで、コードを囲む領域を解剖し、コリオンから分離するためにストレッチします。
   3. 分離した組織を100mLの生理線溶液で標識ビーカーに堆積させます。
5. 胎盤羊膜領域を解剖する(図2B)。
   1. 無菌綿ガーゼで、胎盤を覆う絨毛膜羊膜の表面から血栓を取り除きます。
   2. 胎盤と反射領域の間の境界に膜を保持し、鉗子を解剖する。
   3. メスで胎盤の円周に沿ってカットします。
   4. 胎盤羊膜を絨毛から分離し、胎盤から血管を切断しないように注意する。
   5. 分離した組織を、300 mLの生理線溶液を含む別の標識ビーカーに入れる。
6. 胎盤に付着していない羊膜の残りの部分(すなわち、反射部分)を絨毛膜から分離する(図2C)。
   1. 300 mL の生理線溶液を使用して、別のラベル付きビーカーに反射領域を収集します。
      メモ:組織が乾燥するのを防ぐために、解剖中に生理塩水を継続的に加えます。

4. 膜の洗浄

メモ:手順は、室温で滅菌条件下でバイオセキュリティキャビネット内で行う必要があります。

1. 各膜領域の生理線溶液を別々に廃棄する。
2. 100 mL の新鮮な生理塩水溶液を臍の領域に追加します。
3. 300 mL の新鮮な生理塩水をそれぞれ胎盤領域と反射領域に加えます。
4. 血液残渣を除去するために鉗子を解剖の助けを借りて膜をかき混ぜます。
5. 生理線溶液を廃棄します。
6. 膜が半透明になるまで、少なくとも3倍はワッシュと攪拌を繰り返します。
7. ボード上の膜を配置して拡張し、洗浄で除去されなかった血栓を無菌ガーゼで洗浄します。
   注:その存在はトリプシン機能および後続の細胞培養の生存率に影響を与えるので、できるだけ多くの赤血球を除去することは非常に重要です。

5. 異なる領域からの膜の酵素消化

メモ:手順は、無菌条件下でバイオセキュリティキャビネット内で行う必要があります。

1. 反射領域と胎盤領域を 2 つまたは 3 つの断片にカットします。
2. 臍の領域を切断しないでください。
3. 各領域の断片を遠心管に入れます。反射領域と胎盤領域に0.5%トリプシン/EDTAの20 mLを追加し、それぞれ0.5%トリプシン/EDTAの5 mLを臍上領域に追加します。
   注:反射領域と胎盤領域はトリプシン溶液に完全に浸漬する必要があるため、より小さな部分にカットすることが重要です。
4. 遠心管を30s軽く振るトリプシンを捨てる。
5. 反射領域と胎盤領域に新しい0.5%トリプシン/EDTAの30 mLを追加し、それぞれ臍領域に新しい0.5%トリプシン/EDTAの15 mLを追加します。
6. インキュベーター内のローテーターにチューブを入れます。
7. 37°Cで40分間回転(20 rpm)でインキュベートします。
   メモ:チューブローテーターが利用できない場合は、10分ごとにチューブを軽く振ります。
8. トリプシン/細胞溶液を各領域から新しい遠心管に移します。
9. 酵素を不活性化するために、チューブあたり37°Cで前温したHAECメディアの体積を2倍加えます。
10. 最初の消化を氷の上に保管します。
11. 2 回目の消化期間について、手順 5.6~5.8 を繰り返します。
12. 各領域について、解剖鉗子を使用して羊膜部分の一方の端を保持し、組織に沿って別のペアを絞って、以前の潜伏期間中に完全に剥離しなかった上皮細胞の列を除去する。
13. 2番目の消化を別の遠心管のセットに収集し、HAEC媒体の2倍の容積で不活性化する。
14. 消化した膜をバイオハザード容器に捨てる。

6. HAECの絶縁

メモ:手順は、無菌条件下でバイオセキュリティキャビネット内で行う必要があります。

1. 4 °Cで10分間、200 x gですべてのチューブを遠心分離します。
2. 上清を捨て、チューブとピペットごとに10mLの前温HAECメディア(37°C)を加えて、各ペレットを分解します。
3. 各膜領域の個々のチューブ内の2つの消化の細胞懸濁液を組み合わせます。
4. 100μm細胞ストレーナーを使用して細胞懸濁液を濾過し、細胞外マトリックス破片を除去し、単一細胞を得る。
5. マイクロ遠心管に90°Lのトリパンブルーを入れ、3つのアリコートを用意します。
6. 膜領域あたり各細胞懸濁液の10μLをマイクロ遠心管に加え、混合します。
7. 光場顕微鏡で細胞をヘモサイトメーターで数えます。

7. HAECの文化

1. 3つの領域からHAECを3×104細胞/cm2の密度で予備温めHAEC媒体で別々に播種し、ヒト表皮増殖因子(EGF)の10ng/mLを補う。
   1. 細胞を100mmプレートに播種し、インビトロまたは24ウェルプレートに維持し、免疫化学的分析を行います。
2. 加湿インキュベーターでノルモキシカル条件(5%CO2)で37°Cで料理をインキュベートします。
3. EGF を毎日追加し、3 日ごとに培地を変更します。.
   メモ:細胞は4-6日後にコンフルになります。
4. 従来の免疫ヒストケミストリー、細胞選別解析、凍結保存、RNAおよびタンパク質抽出のために細胞を使用するか、または通路を継続します。

8. HAECの通過

1. HAEC培地を取り外し、PBS/EDTA 0.01M溶液で2x洗浄します。
2. PBS/EDTA 0.01M溶液で37°Cで15分間インキュベートします。
3. PBS/EDTAを取り外し、1.5 mLのトリプシン/EDTAを追加します。
4. 37°Cで5−8分間インキュベートする。
5. HAEC媒体の2つの容積の酵素を不活性化する。
6. 混合溶液と遠心分離機を200 x gで5分間収集します。
7. 細胞をカウントし、次の箇所に進むか、さらに分析するために細胞を使用します。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

HAECは、羊膜の3つの解剖学的領域のそれぞれから単離し、インビトロで個別に培養した。48時間培養した後、上皮表現型を有する細胞がプレートの表面に付着し、培地には細胞破片や浮遊細胞も含まれていたが、培地が変化すると除去した(図3)。

一次培養(通路ゼロ、P0)の処理中に、実験データ分析を妨げる可能性のあるいくつかの合併症が生じる可...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

HAECを用語膜から分離する新しいプロトコルを実装した。各膜は、各膜から細胞を分析するために分離する前に、その3つの解剖学的領域に分割されたという点で、以前の報告とは異なります。

プロトコルの最も重要なステップの1つは、上皮細胞を分離する際にトリプシンの活性を妨げる可能性があるため、すべての血栓を除去する膜の洗浄である。このステップを適切?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture reagents
2-Mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific/Gibco	21985023	55 mM
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific/Gibco	15240062	100X
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Thermo Fisher Scientific/Gibco	12430054	Supplemented with high glucose and HEPES
EDTA	Thermo Fisher Scientific/Ambion	AM9260G	0.5 M
Embryonic stem-cell FBS, qualified	Thermo Fisher Scientific/Gibco	10439024
Non-Essential Amino Acids	Thermo Fisher Scientific/Gibco	11140050	100X
Paraformaldehyde	any brand
Phosphate-Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific/Gibco	10010023	1X
Saline solution (sodium chloride 0.9%)	any brand
Sodium Pyruvate	Thermo Fisher Scientific/Gibco	11360070	100 mM
Trypsin/EDTA 0.05%	Thermo Fisher Scientific/Gibco	25300054
Disposable material
100 µm Cell Strainer	Corning/Falcon	352360
100 mm TC-Treated Culture Dish	Corning	430167
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates	Corning/Costar	3526
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates	Corning/Costar	3516
Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube	any brand		with conical bottom
Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl.
Sterile cotton gauzes
Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL	any brand
Sterile surgical gloves	any brand
Equipment
Biological safety cabinet
Centrifuge
Micropipettes
Motorized Pipet Filler/Dispenser
Sterile beakers of 500 mL
Sterile plastic cutting board
Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps
Sterile stainless steel container
Sterile tray
Tube Rotator	MaCSmix
Antibodies and Kits			Antibody ID
Anti-E-cadherin	BD Biosciences	610181	RRID:AB_3975
Anti-KI67	Santa Cruz	23900	RRID:AB_627859)
Anti-NANOG	Peprotech	500-P236	RRID:AB_1268274
Anti-OCT4	Abcam	ab19857	RRID:AB_44517
Anti-SOX2	Millipore	AB5603	RRID:AB_2286686
Anti-SSEA-4	Cell Signaling	4755	RRID:AB_1264259
Anti-TRA-1-60	Cell Signaling	4746	RRID:AB_2119059
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11029	RRID:AB_2534088
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-11036	RRID:AB_10563566
Tunel Assay Kit	Abcam	66110