冠動脈血管新生のインビトロモデル

要約

冠状血管新生のインビトロモデルは、冠状血管新生の細胞および分子機構の発見に利用することができる。静脈内および心内膜組織のインビトロ外植培養はVEGF-Aに応答して強固な成長を示し、in vivoと同様のCOUP-TFII発現パターンを示す。

要約

ここでは冠状血管新生を研究するためのインビトロ培養アッセイについて述べる。冠状血管は心臓の筋肉を養い、臨床的に重要です。これらの血管の欠陥は、アテローム性動脈硬化症などの深刻な健康上のリスクを表し、患者の心筋梗塞や心不全を引き起こす可能性があります。その結果、冠状動脈疾患は、世界中の主要な死因の1つである。臨床的に重要であるにもかかわらず、損傷した冠状動脈を再生する方法について比較的少し進歩が見られた。しかしながら、冠状血管の発達の細胞起源と分化経路の理解において最近の進歩が見られた。研究者が前駆細胞に蛍光標識し、その運命に従い、生体内の子孫を視覚化することを可能にするツールと技術の出現は、冠状血管の発達を理解するのに役立っています。インビボ研究は貴重ですが、実験設計における速度、アクセシビリティ、柔軟性の面で限界があります。あるいは、冠状動脈血管新生の正確なin vitroモデルは、これらの限界を回避し、研究者が速度と柔軟性を持つ重要な生物学的質問を尋問することを可能にする。適切なin vitroモデルシステムの欠如は、冠状血管の成長の細胞および分子機構の理解の進展を妨げている可能性があります。ここでは、冠状血管の多くが生じる2つの前駆体組織である静脈内静脈(SV)および心内膜(Endo)から冠状血管を成長させるインビトロ培養システムについて説明する。また、この文化が既知のin vivoメカニズムの一部を正確に再現していることも確認した。例えば、SV由来の培養中の血管新生は、生体内で観察されるものと同様のCOUP-TFII発現を下方制御することを示す。また、VEGF-Aは、生体内の血管新生因子として知られており、SV培養および遠東培養の両方から血管新生を強く刺激することを示す。全体として、冠状動脈血管新生を研究するための正確なインビトロ培養モデルを考案しました。

概要

心臓の血管は一般に冠状血管と呼ばれる。これらの血管は、動脈、静脈、および毛細血管で構成されています。開発中、高度に分岐した毛細血管が最初に確立され、その後、冠状動脈と静脈^{1、2、3、4、5}に改造されます。これらの初期毛細血管は、プロエピカルジウム、静脈内静脈(SV)、および内心内膜(遠心内膜)組織^{1、6、7、8}に見られる内皮前駆細胞から構築される。SVは胚性心臓の流入器官であり、心内腔の内層である。SVおよびEndoに見られる内皮前駆細胞は冠動脈脈管系の大部分を構築し、一方、プロエピカルジウムはその比較的小さな部分に寄与する^2。冠状血管の毛細血管ネットワークが心臓に存在する前駆細胞から成長する過程を冠状血管新生と呼びます。冠動脈疾患は、世界的に主要な死因の1つであり、まだこの疾患に対する効果的な治療法は欠けている。冠状動脈形成の詳細な細胞および分子メカニズムを理解することは、損傷した冠状動脈を修復し再生するための新しい効果的な治療法を設計するのに役立ちます。

最近、新しいツールや技術の開発を通じて、冠状血管がどのように発達していくのか、私たちの理解が急増しています。特に、生体内系統標識および高度なイメージング技術は、冠状血管^{9、10、11、12}の細胞起源および分化経路を明らかにする上で非常に有用であった。これらの in vivo ツールの利点にもかかわらず、速度、柔軟性、およびアクセシビリティの点では制限があります。したがって、堅牢なin vitroモデルシステムは、高スループットの方法で冠状血管新生の細胞および分子機構を解明するために生体内システムを補完することができる。

ここでは冠状血管新生のインビトロモデルについて述べる。SVと遠島の2つの前駆体組織から冠状血管を成長させるインビトロ外植培養システムを開発しました。このモデルを用いて、インビトロ組織外植培養物が成長培地によって刺激されると冠状血管芽を増殖することを示す。さらに、外植培養物は、血管内皮増殖因子A(VEGF-A)によって刺激された制御に比べて急速に成長し、非常に強力な血管新生タンパク質である。さらに、SV培養物からの血管新生芽は静脈脱分化(COUP-TFII発現の喪失)を受け^、生体内のSV血管新生と同様のメカニズムであることがわかった。これらのデータは、インビトロ外植物培養システムが生体内で起こる血管新生事象を忠実に復活させることを示唆している。総称して、ここで説明する血管新生のインビトロモデルは、高スループットでアクセス可能な方法で冠状血管新生の細胞および分子機構を探査するのに理想的である。

プロトコル

このプロトコルですべての動物の使用は、ボール州立大学の施設動物のケアと使用委員会(IACUC)ガイドラインに従いました。

1. マウスブリーダーの確立と、時を取った妊娠のための膣プラグの検出

1. 野生型の雄と雌のマウスでマウスの繁殖ケージを設定します。飼育マウスの年齢が6-8週間の間であることを確認してください。ペア(1雄と1メス)またはトリオ(1オスと2メス)として繁殖を設定します。
2. 翌朝、膣プラグを確認してください。斜めの金属プローブを使用して、膣の開口部に挿入して深いプラグを検出します。陽性膣プラグの朝を胚の日0.5(e0.5)に指定する。
   注: 膣プラグは、表面的(図1を参照)または深い(簡単には見えない)のいずれかです。深いプラグの存在は、プローブの完全な挿入をブロックしますが、プラグの欠如は抵抗なしで完全に挿入することができます。
3. 胚が収穫されるe11.5に達するまで、時限妊娠を維持する。胚を収穫する前に妊娠を確認するには、e7.5とe11.5の間の雌マウスの体重を記録する。
   注:母親の体重の毎日の増加は、成功した妊娠を示しますが、体重の変化は妊娠の失敗を示しません。

2. 妊娠中マウスからの胚の収穫

注:始める前に、次の装置および試薬を持っていることを確認してください:CO₂安楽死室、70%エタノール、ペーパータオル、通常の鉗子、細かい鉗子、はさみ、1x無菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、10センチの無菌ペトリ皿、氷付き容器、穿刺スプーン、解剖ステレオ顕微鏡。

1. e11.5妊娠中のマウスを清潔なCO₂安楽死室に入れ、犠牲にします。チャンバーの蓋を閉じて、マウスが逃げるのを防ぎます。
2. 安楽死室でマウスを固定した後_、CO2をオンにします。IACUC の推奨値当たりの CO₂の流量を必ず調整してください (つまり、1 分間に 10 ~ 30% の変位)。マウスが完全に安楽死した後、子宮頸部脱臼を行い、死亡を確実にする。
3. 70%エタノールでマウスをスプレーします。鉗子を使用して腹の上に皮膚を持ち上げ、はさみを使用して小さな切開を行い、切開を横方向に伸ばします。切開を横隔膜まで前に拡大し、胚を含む子宮角を露出する(図2)。
4. 子宮をつかんで自由に切断することによって、胚の文字列(子宮ホーン+胚)を引き出します。胚のひもを氷冷無菌1x PBSに入れる。
5. 子宮筋、黄身嚢、羊膜を1つずつ剥離して子宮角から個々の胚を解剖する(図3A-F)を実体顕微鏡で行う。穿穿なるスプーンを使用して洗浄された胚を氷の上に滅菌1x PBSを含むペトリ皿に移します。胚を冷たく保つようにしてください。

3. e11.5胚からの心臓の分離

注:始める前に、次の機器と試薬を持っていることを確認してください:通常の鉗子、細かい鉗子、1x滅菌PBS、10センチ滅菌ペトリ皿、6センチ滅菌ペトリ皿、氷入りの容器、穿刺スプーン、解剖ステレオ顕微鏡。

1. 氷冷無菌1x PBSを実体顕微鏡で新しいペトリ皿に設置します。ステップ2.5からペトリ皿に胚を移して心臓を解剖する。
2. 鉗子を使用して胚の頭部を取り除く。まず、片手で鉗子の間のヘッドを絞り、閉じた鉗子を使ってもう一方の手で削り取って頭を取り除きます(図4A-C)。
3. 頭部を取り外した後、片方の手で腹に鉗子を持って胚を保持することによって、その腹側を上にして胚を向けます(図4D)。
4. 一方、まず、細かい鉗子を用いて横隔膜の少し上に胸部に小さな切開を行うことによって、胚の胸壁を開く。次に、閉じた鉗子を挿入し、鉗子を開くことによって胸壁を引き裂くことによって、切開を非常に慎重に拡大する。心臓に損傷を与える可能性があり、あまりにも深く突っ込まないようにしてください。鉗子の助けを借りて、胸壁を大きく開けて胸腔の心臓と肺を露出させる(図4E)。
5. 細かい鉗子を使って、心臓を前に静かに動かして(90°)、後部大オルタ/静脈を露出させる。心臓の基部にある背部大静脈を捕捉して心臓/肺を前に引き出す(図4F-H)。
   注:心臓の後側に位置するSVの引き裂きを避けるために、心臓/肺を引き出しながら優しくしてください。
6. 血液細胞を除去するために冷たい1x PBSで心臓/肺をすすいでください。
7. ステップ 3.1 ~ 3.6 を繰り返して、残りの胚から心臓/肺を取り除きます。孤立した心臓/肺を氷の上に置くようにしてください。

4. e11.5胚性マウスハーツからのSVと心室の分離

1. ステップ3.7の心臓/肺を持つペトリ皿を実体顕微鏡で置き、SUVと心室全体を分離します。細かい鉗子を使って根から肺の取り付けられたローブを1つずつ剥がします。
2. 心臓を後側に向け、心房とSVを引き裂くことなくSVを取り囲む隣接組織を取り除きます。心臓の基部を保持し、細かい鉗子を使用して掻き取ることによって、心臓から左右の心房を取り除く(図5B)。同様の手法を用いてSVを取り囲む隣接組織を取り除く(図5C)。
   注:右の心房はSVに取り付けられているので、心房を取り除くように注意してください。
3. SVを分離するには、まず後ろ側を上に向けて心臓を向け(SVが後側にあるため)、心臓を鉗子で心室にそっと保持することによって心臓をこの位置に保ちます。
   注:SVは、心臓の後側の心房の間にある胚性心臓の流入器官です。
4. SVを取り外す場合は、取り付けられている心臓を慎重に剥がすか、SVを細かい鉗子で付着部の基部に保持し、閉じた鉗子で掻き取ります(図5D,E)。
5. 滅菌移管ピペットを使用して氷の上に氷冷滅菌1x PBSで新しい6 cmペトリ皿に孤立したSVを移し、SVとしてペトリ皿にラベルを付けます。
6. 心室全体を隔離するには、SVが取り除かれた後に心臓から流出管(大動脈および肺幹)を取り除く(図5F,G)。
7. 滅菌移管ピペットを使用して氷上の滅菌1x PBSを含む新しい6 cmペトリ皿に心室全体を移し、ペトリ皿を心室としてラベル付けします。孤立したSVと心室を氷の上に置いてください。
8. ステップ 4.1 ~ 4.7 を繰り返して、残りの心臓から SV と心室を分離します。

5. インサートと細胞外マトリックスコーティングを用いて組織培養プレートを設定する

注:開始する前に、以下の装置および試薬を持っていることを確認してください:市販の細胞外マトリックス溶液(ECM;例えば、マトリゲル)、8.0 μMポリエチレンテレフタレート(PET)培養インサー、24ウェルプレート、37°C、5%CO2インキュベーター。

1. ECM溶液を氷の上で解凍します。固化を避けるために、ECM溶液を氷の上に置いてください。
2. PET膜培養インサート(細孔径=8.0μm、濾過面積=0.3cm2、フィルター径=6.5mm)を24ウェルプレートで処理した非組織培養のウェルに入れる。プレートにそれぞれSVまたは心室のSVまたは心室のラベルを付けます。
   注: 両方のカルチャを同時に実行する場合は、SV と心室用の別のプレートに挿入を設定します。すべての実験サンプルとコントロールに十分な井戸を用意してください。
3. ECM溶液が解凍された後、すぐにECM 1:2を予冷した基底媒体(すなわち、EBM-2基底媒体、材料表)に十分な容積(100 μL/挿入x挿入数)に希釈する。
   注:例えば、6つの挿入がある場合、総体積は100 μL x 6 = 600 μLになります。
4. 100 μLの希釈したての ECM を膜の上に直接加えて、挿入物にコーティングします。37°Cでプレートを30分以上インキュベートし、ECMを固化させます。
   注:これは、汚染を避けるために、層流組織培養フードの下で行う必要があります。

6. SVと全室の文化

注:始める前に、次の装置および試薬を持っていることを確認してください:70%エタノール、移写ピペット、実体顕微鏡、鉗子、層流組織培養フード、微小血管内皮細胞サプリメントキット(材料表)、基底培地、1x滅菌PBS。図6は、SVおよび心室培養のワークフローを示しています。

1. 氷の上にサプリメントキットの内容物を解凍します。認定された層流組織培養フードの下に500 mLの基底培地にサプリメントキットのすべての内容物を加えることによって完全な培地を準備します。ミディアムをよく混ぜて50mLのアリコートに分配します。
2. 70%エタノールで実体顕微鏡および周囲の作業域の基部を殺菌する。
3. ステップ5.4から組織培養プレートを得る。移管ピペットの助けを借りて、慎重に挿入膜の上にステップ4.7から外植を移します。実体顕微鏡の下で、きれいな鉗子の助けを借りて、外植体を挿入物の中央に置いて、挿入物の隅にくっついたり、側壁に取り付けたりしないようにします。
4. 外植を配置し、挿入物の中心に配置した後、慎重に挿入物から余分なPBSを除去し、プレートの蓋を閉じます。
5. 層流組織培養フードの下に、挿入物の上に100 μLのプリウォームされた完全な媒体を加え、200 μLをウェルに加えて、空気液体界面で外植体を培養し、挿入物の基底面が媒体と接触するようにするが、上面は空気にさらされています。
   注:異なるサイズのインサート/ウェルプレートを使用する場合は、必ず空気と液体のインターフェースを得るためにボリュームを調整してください。
6. 24ウェルプレートの未使用の井戸に300 μLのPBSを加え、蓋をします。プレートを37°C、5%CO2インキュベーターでインキュベートし、培養物を5日間培養した。
7. 次の日に、転光顕微鏡下で培養物を日常的に観察し、外植培養の状況を評価する。外植木が収縮性の拍動を示し、すべての外植物がECMに埋め込まれた膜の底に取り付けられていることを確認してください。浮遊する外植に注意してください。
   注: 外植の周期的な収縮は、それらが生きていることを示します。浮動外植は分析から除外する必要があります。
8. 培養状況を評価した後、培養プレートをインキュベーターに戻し、培養を最大5日間成長させ続ける。

7. VEGF-A(ポジティブコントロール)による文化の治療

注:始める前に、次の装置および試薬を持っていることを確認してください:層流組織培養フード、1x PBS、基底培地+1%牛血清(FBS)、基底培地+VEGF-A、ピペット、ピペットチップ。

1. 基底培地+1%FBSおよび基底培地+VEGF-Aを準備します。
   1. 基礎培地+ 1%FBSを調製するために、まず必要な制御ウェルの数を決定する。たとえば、3つの制御ウェルがある場合、300 μL/well x 3 = 900 μL が必要な総体積です。基礎培地の891 μLに9μLのFBSを加え、基礎媒体+ 1%FBSを作ります。
   2. 基底培地+VEGF-Aを調製するために、まずVEGF-A培地を必要とするウェルの総数を決定する。ウェルが3つある場合、300 μL/well x 3 = 900 μL は総容積で、50 ng/well x 3 = 150 ng VEGF-A になります。基底培地の900 μLにVEGF-Aの150 ngを加え、基底培地+ VEGF-Aを作ります。
      注: このソリューションを計算量よりも大きなボリュームで組み立て、各実験に十分な数の小さなアリコートを確保します。
2. 2日目に、両方のチャンバー(インサートとウェル)からメディアを取り外します。1x PBSの300 μLで、インサートに100 μL、ウェルに200 μLを加えて培養します。プレートを数回しっかりと旋回し、PBSを取り外します。
3. 300 μL の基底培地 + 1% FBS (インサートに 100 μL、ウェルに 200 μL) を加えて、培養物を 24 時間飢えさせます。
4. 3日目、飢餓後、300μLの基底培地+ 1%FBS (インサートに100 μL、ウェルに200 μL) をコントロールウェルと基底培地 + VEGF-A (50 ng/well) をそれぞれ処理ウェルに加えます。
5. 治療後、培養器内の培養物を成長させ続ける。

8. 固定および免疫染色

注:始める前に、次の装置および試薬を持っていることを確認してください:4%パラホルムアルデヒド(PFA)、1x PBS、一次および二次抗体、シェーカー、PBS(PBT)で0.5%非イオン性界面活性剤。

1. 培養の6日目に、培地を取り出し、室温(RT)で1倍PBSで培養液を洗浄します。
   1. 200 μLの 4% PFA溶液をウェルに、100 μL をインサートに加えて培養を修正します。ロッキングしながら20分間4°Cで培養物を固定します。
   2. 20分固定した後、フュームフードの培養液からPFAを取り除き、200 μLをウェルに、100 μLをインサートに加えて1x PBSで培養液を洗浄します。
   3. ロッキングしながら、それぞれ3倍、10分を繰り返します。その後、免疫染色を行う。
      注:すべての洗浄手順は、RTのベンチトップで行われます。
2. ブロッキング溶液中の希薄な一次抗体(抗VE-カドヘリン、抗ERG 1/2/3)(ロバ血清5%、PBT 0.5%)。300 μL の一次抗体溶液(下部ウェルに 200 μL、インサートに 100 μL)を加えます。一次抗体の培養物を揺らしながら4°Cで一晩培養する。
   注:抗VE-カドヘリンは内皮細胞膜にラベルを付けるために使用され、抗ERG 1/2/3は内皮細胞の血管新生芽を視覚化するために内皮細胞核にラベルを付けるために使用されます。
3. 翌日、培養プレートを10倍のPBTで洗浄して揺らし、10分ごとにPBTを交換します。
4. 二次抗体(ロバアンチラットアレクサFluor 488とロバ抗ウサギアレクサFluor 555)をブロッキング溶液で希釈します。ステップ8.2のように2次抗体の300 μLを加え、ロッキングしながら4°Cで培養を一晩インキュベートします。翌日、2次抗体を10xPBTで洗浄し、10分ごとにPBTを交換する。
   注:最低10倍の洗浄が、より多くの洗浄が良いです。この培養が完了すると、培養物はスライドに取り付けられるまで1x PBSで保存できます。

9. スライド、イメージング、および分析に文化を取り付ける

注:始める前に、次の装置および試薬を持っていることを確認してください:細かい鉗子、スライド、4′、6-ジミディノ-2フェニリンドール(DAPI)、カバーリップ、および共焦点顕微鏡との取り付け媒体。二次抗体染色後、以下の手順を使用して、培養物をスライドに取り付けてイメージングします。

1. 細かい鉗子を使用してインサートから膜を慎重に剥がし、膜側を下に置き、外植培養物を上方に置くことによってスライドに移します。複製サンプルを同じスライドに配置し、スライドにコントロールまたは VEGF-A としてラベルを付けます。DAPIを使用した取り付け媒体を膜に直接追加し、カバースリップでスライドを覆います。
   注:カバーリップを配置する際は、気泡を避けるようにしてください。
2. 明確なマニキュアでスライドの端を密封し、乾燥させます。
   注:スライドは、長期保存のために-20°Cに保存することができます。
3. 共焦点顕微鏡を用いた画像スライド。
4. 血管形成の伸びの長さを測定する分析を行う。心室培養中のERG 1/2/3+細胞の内側境界から、SV培養中のSVエクスプラントの中心から延びた内皮細胞(Ve-Cadherin+/ERG 1/2/3+)の距離を測定することにより、血管新生の伸び長さを定量化します。
   1. フィジー/イメージJを使用して定量化を実行するには、まずフィジーソフトウェアをダウンロードしてください。
   2. フィジーで画像ファイルを開く: ファイルに移動|開く |フォルダ |ファイル名 |を開きます。
   3. 分析に移動|測定の設定 |[ 境界 ]を選択します。
   4. メイン ウィンドウから[直線]ツールを選択します。
   5. ステップ 9.4 で提案されているように、スプラウトの長さに沿って線を引きます。
   6. 分析に移動|測定します。
      メモ:長さの測定値が新しいウィンドウに表示されます。
   7. ランダムに選択された 3 つ以上の視野を表す画像の定量化を実行します。スプラウト長の測定値を平均し、平均値 ±標準偏差として報告します。

結果

生体内のSV血管新生の最も顕著な特徴の1つは、特定の経路に従い、ステレオタイプの時間と位置¹で起こる細胞脱分化および再分化事象を伴うことである。初期SV細胞が心室に成長するにつれて、それらはCOUP-TFIIのような静脈マーカーの産生を停止する(図7)。その後、冠状動脈芽は、心臓の表面または心筋内の深い2つの移動経路...

ディスカッション

SVおよび遠親組織から冠状血管を正常に成長させるための最も重要なステップのいくつかは次のとおりです: 1) SV培養のためのSV組織を正しく同定し、単離する;2)正確な遠心培養のためにe11-11.5の年齢の間の胚からの心室を使用する。3)解剖期間を通じて無菌状態を維持し、常に組織を冷たく保つ;4)培地に浮遊する組織を避けるために、ECM被覆膜に付着した外植体を維持する。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 x 20 MM Tissue Culture Dish	Fisher Scientific	877222	Referred in the protocol as Petri dish
24-well plates	Fisher Scientific	08-772-51
8.0 uM PET membrane culture inserts	Millipore Sigma	MCEP24H48
Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555	Fisher Scientific	A31572	Secondary antibody
Alexa Fluor Donkey anti-rat 488	Fisher Scientific	A21206	Secondary antibody
Angled Metal Probe	Fine science tools	10088-15	Angled 45 degree, used for detecting deep plugs
Anti- ERG 1/2/3 antibody	Abcam	Ab92513	Primary antibody
Anti- VE-Cadherin antibody	Fisher Scientific	BDB550548	Primary antibody, manufacturer BD BioSciences
CO2 gas tank	Various suppliers	N/A
CO2 Incubator	Fisher Scientific	13998223	For 37 °C, 5% CO2 incubation
Dissection stereomicrosope	Leica	S9i	Leica S9i Stereomicroscope
EBM-2 basal media	Lonza	CC-3156	Endothelial cell growth basal media
ECM solution	Corning	354230	Commercially known as Matrigel
EGM-2 MV Singlequots Kit	Lonza	CC-4147	Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	SH3007003IR
FiJi	NIH	NA	Image processing software (https://imagej.net/Fiji/Downloads)
Fine Forceps	Fine science tools	11412-11	Used for embryo dissection
Fisherbrand Straight-Blade operating scissors	Fisher Scientific	13-808-4
Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X)	Fisher Scientific	SH-302-5601LR
Laminar flow tissue culture hood	Fisher Scientific	various models available
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1200	Vectashield with DAPI
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy/Fisher	50-980-494	This is available at 32%; needs to be diluted to 4%
Perforated spoon	Fine science tools	10370-18	Useful in removing embryo/tissues from a solution
Recombinant Murine VEGF-A 165	PeproTech	450-32
Standard forceps, Dumont #5	Fine science tools	11251-30
Sure-Seal Mouse/Rat chamber	Easysysteminc	EZ-1785	Euthanasia chamber