JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

この記事では、遅延バースト放出を可能にするために新しいワクチンデリバリープラットフォーム「ポリバブル」を製造するために使用されるプロトコルについて説明します。ポリバブルを形成するためにポリ(乳酸コグリコール酸)やポリカプロラクチンを含むポリエステルを用い、小分子と抗原を貨物として使用した。

要約

新しいリリースプロファイルを可能にしながら、有機溶媒への貨物の暴露を制限することができるワクチンの配達戦略は、世界中の予防接種カバレッジを改善するために重要です。ここでは、ポリバブルと呼ばれる新規注射可能な、紫外線硬化性および遅延バースト放出を可能にするワクチン送達プラットフォームが導入される。貨物は、10%カルボキシメチセルロース系水溶液で形成されたポリエステル系ポリバブルに注入された。本論文には、ポリバブルの球形を維持し、貨物の配置と保持を最適化して、ポリバブル内の貨物の量を最大化するためのプロトコルが含まれています。安全性を確保するため、ポリバブル内の塩素系溶媒含有量を中性子活性化解析を用いて分析した。放出試験は、遅延バースト放出を確認するために、ポリバブル内の貨物として低分子で行われた。さらに、貨物のオンデマンド配信の可能性を示すために、金ナノロッドをポリマーシェル内に混合し、近赤外レーザー活性化を可能にした。

概要

限定的な予防接種の適用範囲は、ワクチン予防可能な疾患によって特に引き起こされる300万人の死亡をもたらす1.不十分な保管および輸送条件は、機能性ワクチンの浪費につながり、したがって、世界的な予防接種の減少に貢献する。さらに、必要なワクチンスケジュールに従わないための不完全なワクチン接種も、特に発展途上国ではワクチンの適用範囲が限られている。ブースターショットを受けるには、推奨期間内に医療従事者への複数回の訪問が必要であり、完全なワクチン接種を伴う人口の割合を制限します。したがって、これらの課題を回避するために、制御されたワクチンの送達のための新しい戦略を開発する必要があります。

ワクチンデリバリー技術の開発に向けた現在の取り組みとしては、エマルジョン系ポリマー系33,44が挙げられる。しかし、貨物は、多くの場合、凝集や変性を引き起こす可能性のある有機溶媒の量が多く、特にタンパク質ベースの貨物55,66の文脈で。我々は、溶媒7にさらされる貨物の量を最小限に抑えながら、潜在的に複数の貨物室を収容することができる新しいワクチンデリバリープラットフォーム「ポリバブル」を開発しました。例えば、当社のポリバブルコアシェルプラットフォームでは、直径0.38mm(SEM)の1つの貨物ポケットが1mmポリバブルの中央に注入されます。この場合、有機溶剤に曝露される貨物の表面積は約0.453mm22となる。球体(貨物庫)内の球体(微粒子)の充填密度を考慮した結果、デポに収まる可能性のある実際の微粒子(直径10μm)は0.17mm3です3。1個の微粒子の体積は5.24x10-8mm3であり、したがって、デポに収まる粒子の微粒子の数は〜3.2x106粒子である。-8 3 6各微粒子に直径0.25μmの20個のカーゴポケット(ダブルエマルジョンの結果)がある場合、有機溶媒に曝露される貨物の表面積は1274mm2である。2したがって、ポリバブル内の貨物庫は、微粒子中の有機溶剤暴露貨物と比較して、有機溶媒にさらされた表面積が約2800倍少なくなります。当社のポリエステルベースのプラットフォームは、有機溶剤にさらされた貨物の量を減らす可能性があり、そうでなければ貨物の集約や不安定性を引き起こす可能性があります。

ポリバブルは、有機相のポリエステルを水溶液に注入して球状の気泡を生じる相分離原理に基づいて形成される。水相の貨物は、ポリバブルの中心に注入することができます。別の貨物室は、ポリマーシェルと異なる貨物を混合することによって、ポリバブル内で達成される可能性があります。この段階でのポリバブルは可鍛性になり、その後、真ん中に貨物を持つ固体ポリバブル構造をもたらすように硬化されます。球状のポリバブルは、ポリバブルの全体的なサイズを最小限に抑えながら、ポリバブル内の貨物容量を増加させるために、他の幾何学的形状よりも選択されました。中央に貨物を持つポリバブルは、遅延バーストリリースを実証するために選択されました。ポリバブルはまた、近赤外(NIR)-感受性(すなわち、熱刺激性有効)剤、すなわち金ナノロッド(AuNR)と組み込まれ、ポリバブルの温度上昇を引き起こす。この効果は、より速い劣化を促進する可能性があり、将来のアプリケーションでキネティクスを制御するために使用される可能性があります。本論文では、ポリバブルを形成し、特徴づけ、ポリバブルからの遅延バースト放出を達成し、ポリバブル内にAuNRを組み込んでNIR活性化を引き起こすアプローチについて述べた。

プロトコル

1. ポリカプロラシロントリアクリル(PCLTA)合成

  1. 400ダポリカプロラシロン(PCL)の3.2mLを、オープン200mLラウンドボトムフラスコで50°Cで一晩乾燥し、90°CのガラスバイアルでK2CO3を乾燥させた。
  2. トリオールをジクロロメタン(DCM)6.4 mL、炭酸カリウム4.246g(K2CO3)をアル2ゴン下で混ぜます。
  3. 27.2 mLのDCMに2.72mLの塩化アクリルを混ぜ、5分以上フラスコ中の反応混合物に滴下します。
  4. 反応混合物をアルミホイルで覆い、アルゴンの下で24時間室温で乱さないままにしておきます。
  5. 24時間後、真空下でブフナー漏斗上のフィルターペーパーを用いて反応混合物を濾過し、過剰な試薬を廃棄する。
  6. ジエチルエーテルの末端ポリマーを1:3(vol/vol)に含むステップ1.5からの濾液を沈殿させ、30°Cでロトバペを除去し、ジエチルエーテルを除去した。

2. ポリバブルの形成

注:脱イオン(DI)水にポリマーを注入すると、ポリバブルがバイアルの底に移動し、底部が平坦化されます。ポリバブルの平坦化を避けるために、代わりに10%(wt/vol)カルボキシメチルセルロース(CMC)を使用してガラスバイアルを充填してください。

  1. DI水に10%(重量/体積)CMC溶液を調製します。
  2. 1 mL のトランスファーパイプを使用して 0.8 mL の 10% CMC で 0.92 mL ガラスバイアルを充填します。
  3. 1000 mg/mLの14 kDa PCLをDCMに混合し、PCLTAを1:3(vol/vol)で合成して全容量2000μLで5kDaポリ(乳酸コグリコール酸)の2000mg/mLを調製し、クロホルムでジウリル(PLGADA)を調製します。
  4. 2-ヒドロキシ-4'(2-ヒドロキシエトキシ)-2-メチルプロピオフェノン(光基質刺激体)を0.005:1(vol/vol)のポリマー(PLGADAまたはPCL/PCLTA)混合物と混ぜます。
  5. 200 μL のポリマー混合物を、内径 0.016 インチの分配ステンレス鋼管に接続されたシリンジポンプに取り付けられた 1 mL ガラスシリンジに積み込みます。
  6. マイクロモーターを使用してポリマーチューブの前進と後方の動きを制御し、ポリマーをガラスバイアル内の10%CMCに注入してポリバブルを形成します。
  7. 2 W/cm 2で60 sの254 nm波長で紫外線(UV)下で2ポリバブルを治す。
  8. フラッシュは液体窒素中のポリバブルを凍結し、0.010 mBar真空で-85 °Cで一晩凍結乾燥します。
  9. ポリバブルを鉗子で乾燥したCMCから分離し、残留CMCを除去するためにDI水でポリバブルを洗浄する。なお、他のポリマーは、放出動態を改変する改変を伴って使用される可能性が高い。

3. ポリバブル径の変調

  1. 1 mL のトランスファーパイプを使用して、0.92 mL ガラスバイアルに 10% CMC を充填します。
  2. PCL/PCLTAを1:3(vol/vol)に1000mg/mL 14kDa PCLと混ぜ合わせ、PCLTAを合成します。0.005:1 (vol/vol) で重合体混合物とフォトイチエーターを混合します。
  3. ポリマー混合物を、0.016インチの内径の分配ステンレス鋼管に接続されたシリンジポンプに取り付けられた1mLガラスシリンジにロードします。
  4. マイクロモーターを使用してポリマーチューブの前進と後方の動きを制御し、ポリマーをガラスバイアル内の10%CMCに注入してポリバブルを形成します。
  5. さまざまな直径のポリバブルを得るためには、0.0005から1 μL/sの範囲の分配率を変える。
  6. 様々な直径を持つポリバブルとバイアルの画像を撮ります。
  7. ImageJ を使用してポリバブルの直径を定量化し、バイアルのサイズをスケールとして使用します。

4. ポリバブル内の貨物をセンタリング

  1. K2CO3を用いたPCL/PCLTA粘度の変調:
    注:PLGADAの粘度は、1000 mg/mLで5 kDa PLAGDAの粘度が貨物をセンタリングするのに十分であるため、K2CO3を使用して変更する必要はありません。
    1. 0 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL、40 mg/mL、および60 mg/mLを含む様々な濃度で、PCLTAにK2CO3(PCLTA反応後に単離された)を加えます。
    2. レオメトリーを使用してせん断速度を0から1000 1/sに変更して、溶液の動的粘度を測定します。
    3. K2CO3の異なる濃度のPCL/PCLTA溶液を使用して形成されたポリバブルの途中で貨物を手動で注入します(ステップ4.1.1)。ステップ4.1.1からどの溶液が貨物の中央に保持をもたらすかを観察することによって、K2CO3の最適な濃度を決定する。
  2. CMCを使用した貨物の中心(既に小分子での実現可能性を示している)
    1. 貨物の粘度を上げるために、一晩、回転器で5%(wt/vol)CMCと貨物を混合します。
    2. 手動でポリバブルに2μLの貨物混合物を注入し、2 W/cm2で60 sの254 nm波長でUV硬化を進めます。
    3. フラッシュは、液体窒素中のポリバブルを30sのために凍結し、0.010 mBar真空で-85°Cで一晩凍結乾燥します。
    4. ポリバブルを鉗子で乾燥したCMCから分離し、任意の残留CMCを除去するためにDI水で洗浄する。
    5. ポリバブルを半分に切り、コンフォーカル顕微鏡を使用して半分を画像化して貨物が中央に配置されるようにします(励起波長と発光波長を使用する場合はステップ6を参照)。

5. 貨物製剤

注:ポリバブル製剤は、小分子、タンパク質、核酸を含む様々な貨物タイプを収容することができます。

  1. これまでの研究に基づき、タンパク質貨物の場合、ポリエチレングリコール(PEG)6、ポリビニルピ6ロリドン(PVP)、および糖ポリマー6を含む賦形剤を使用して、ポリバブル製剤中のタンパク質の安定性を向上させる。
  2. ステップ 2 のプロトコルに基づいてポリバブルを形成します。
  3. 17.11 gのトレハロースを625 μLのHIV gp120/41抗原に添加して、抗原溶液を調製します。
  4. ポリバブルの中央に1μLの抗原溶液を手動で注入します。
  5. 0日目、7日目、14日目、21日目にポリバブルを開き、励起波長と発光波長497nm、520nmの抗原の蛍光をそれぞれ記録する。
  6. 酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いて抗原の機能を決定し、5%ノンファットミルクをブロッキングバッファーとして使用します。

6. 貨物の解放

注:小分子や抗原は、貨物タイプとして使用することができます

  1. 小分子
    1. 37°Cのリン酸緩衝塩(PBS)の400 μL、PLGADAポリバブルの場合は50°C、PCL/PCLTAポリバブルでは37°C、50°C、70°Cでアクリフラビンを中心としたポリバブルをインキュベートします。
      注: 体温以上のテストを推奨する理由は、pCL および PLGA 内で金ナノロッド (AuNRs) をレーザー加工しながらポリバブルが到達する温度 (50 °C) をシミュレートすることです。そしてb)PCL(50°C、70°C)の分解プロセスを加速する。
    2. 各時点で上清を収集し、400 μLの新鮮なPBSに交換します。
    3. プレートリーダーを使用して、収集した上清の蛍光強度を定量化します。
      注: アクリフラビンには 416 nm/514 nm の ex/em を使用してください。
  2. 抗原
    1. 37°CでPBSの400 μL、PLGADAポリバブルの場合は50°C、PCL/PCLTAポリバブルでは50°Cで、シウシアルブミン血清(BSA)-488を中心としたインキュベートポリバブル。
    2. 各時点で上清を収集し、400 μLの新鮮なPBSに交換してください。
    3. プレートリーダーを使用して、収集した上清の蛍光強度を定量化します。BSA-488 には 497 nm/520 nm の ex/em を使用してください。
      注:PCL/PCLTAポリバブルの70°Cでの放出試験は、極端な温度に抗原を暴露しないように行われるべきではありません。

7. 毒性

  1. 中性子活性化解析(NAA)を用いたポリバブル中の塩素含有量の定量
    1. 0.010 mBar真空および-85°Cでのこの研究のために2、4、6、20、および24時間凍結乾燥したポリバブルを使用してください。
    2. ポリバブルの5〜9mgを測定し、LDPE照射バイアルに置きます。
    3. 国立標準技術研究所(NIST)の追跡可能な校正ソリューションから、1000 g/mLの塩素校正液を準備します。
    4. 1メガワットのトリガ原子炉を使用して、中性子フルエンス率9.1×1012 /cm2·sで600sの中性子蛍光率で各サンプルに中性子照射を行います。
    5. ポリバブルを照射されていないバイアルに移します。
    6. HPGe検出器を使用して、360 sの減衰間隔の後に500 sのガンマ線スペクトルを得る。
    7. データを分析するには、キャンベラインダストリーズのNAAソフトウェアを使用します。
  2. NAAを用いてポリバブルから放出される塩素含有量の定量化
    1. 一晩凍結乾燥させたインキュベートポリバブル(0.010 mBar真空で-85°Cで)、PBSの400 μLで37°Cで。
    2. インキュベーション後の週 1、2、および 3 で上清を収集します。
    3. ステップ7.1で前述と同じ方法を使用してNAAを使用して塩素含有量の上清を分析します。

8. キットラーによるAuNR合成, S., 他.8.

  1. 250 μLの10 mMクロロアウリン酸(HAuCl 4)、7.54mLの100 mMセトリモニウム臭化物(CTAB)、および600 μLの10mM氷冷ナトリウムホウドリド(NaBH4)を混合してオーNRシード液を調製する。
  2. 40 mLの100 mM CTAB、10 mM HAuCl4の1.7 mL、硝酸銀250μL(AgNO3)、17.6mg/mLアスコルビン酸270 μLをチューブに混合して成長液を調製します。
  3. 420 μLのシード溶液を1200 rpmの成長溶液と1分間激しく混合します。その後、混合物を乱さずに16時間反応させたままにしておきます。
  4. 8000×gで10分間遠心して混合物から余分な試薬gを取り除き、上清を捨てます。

9. ソリマンによるAuNRsの疎水化化,M.G.,他9

  1. 1 mM水酸化ナトリウム(NaOH)を使用して、合成されたCTAB安定化AuNRsのpHを10に調整します。
  2. 0.3 mM メチル化 PEG (mPEG) チオールを一晩で 0.1 mL で攪拌します。
  3. PEGylated AuNRsを0.4 Mのドデシルアミン(DDA)とクロロホルムで500rpmで4日間混ぜます。
  4. 疎水化AuNRsを含む上の有機層をパイプアウトし、将来の使用まで4°Cで保存します。

10. ポリバブルのNIR活性化

  1. ポリマー(PLGADAまたはPCL/PCLTA)溶液を疎水化オーナーと1:9(vol/vol)で混ぜます。
  2. 0.005:1 (vol/vol) でポリマー-AuNR混合物にフォトイチエーターを追加します。
  3. ポリバブルを形成し、ポリマー-AuNR混合物を10%CMC(wt/vol)で0.92 mLガラスバイアルに注入します(ステップ2参照)。
  4. 2 W/cm 2で60 sの254 nm波長で2ポリバブルを治す。
  5. フラッシュは液体窒素中で30sで凍結し、0.010 mBar真空で-85°Cで一晩凍結乾燥します。
  6. 乾燥したポリバブルを鉗子で分離し、任意の残留CMCを除去するためにDI水で洗浄します。
  7. 37°CでPBSの400 μLでポリバブルをインキュベートします。
  8. 毎週月曜日、水曜日、金曜日に8Aで8Aでポリバブルを5分間アクティブにします。
  9. レーザー活性化の前後にポリバブルの前方赤外線(FLIR)画像を撮り、温度値を取得します。
  10. FLIR画像の温度値に基づいて、レーザー活性化前と後の温度差を計算します。

結果

ポリバブルは、SEMおよびNAAを用いて広範囲に特徴付けられていた。貨物は、バーストリリースの遅延を引き起こすために中央に配置されました。ポリバブルもポリバブル内にAuNRsが存在するため、レーザー活性化に成功しました。

ポリバブルの特徴付け
CMCを使用しない水溶液に注入されたポリバブルは、ガ...

ディスカッション

現在の技術と課題
エマルジョンベースのマイクロおよびナノ粒子は、一般的に薬物送達担体として使用されてきました。これらの装置からの貨物の放出動態は広範囲に研究されているが、バースト放出動態の制御は大きな課題であった11.貨物の多様性と機能性は、過剰な水性および有機溶媒への貨物の暴露のためにエマルジョンベースのシステムでも制限さ?...

開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

中性子活性化解析(NAA)を支援したTAMUの化学部門の元素分析ラボに所属するブライアン・E・トムリン博士に感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1-Step Ultra Tetramethylbezidine (TMB)-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Substrate SolutionThermo scientific34028
2-Hydroxy-2-methylpropiophenoneTCI AMERICAH0991
450 nm Stop Solution for TMB SubstrateAbcamab17152
Acryloyl chlorideSigma AldrichA24109-100G
AcriflavineChem-Impex International22916
Anhydrous ethyl etherFisher ChemicalE138-500
Anti-HIV1 gp120 antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRP)
Bovine serum albumin (BSA)Fisher BioReagentsBP9700100
BSA-CF488 dye conjugatesInvitrogenA13100
Bromosalicylic acidAcros OrganicsAC162142500
Carboxymethylcellulose (CMC)Millipore Sigma80502-040
Centrimonium bromide (CTAB)MP BiomedicalsICN19400480
ChloroformFisher ChemicalC2984
Coating bufferAbcamab210899
Dichloromethane (DCM)Sigma Aldrich270997-1L
Diethyl etherFisher ChemicalE1384
Dodeacyl AmineAcros OrganicsAC117665000
Doxorubicin hydrochlorideFisher BioReagentsBP251610
L-ascorbic acidAcros OrganicsA61 100
Legato 100 Syringe PumpKD Scientific14 831 212
mPEG thiolLaysan BioNC0702454
Nonfat dry milkAndwin ScientificNC9022655
Potassium carbonateAcros OrganicsAC424081000
Phosphate saline bufferFisher BioReagentsBP3991
(Poly(caprolactone)Sigma Aldrich440744-250G
(Poly(caprolactone) triolAcros OrganicsAC190730250
Poly (lactic-co-glycolic acid) diacrylateCMTec280050
Potassium carbonateAcros OrganicsAC424081000
Recombinant HIV1 gp120 + gp41 proteinAbcamab49054
Silver nitrateAcros OrganicsS181 25
Sodium borohydrideFisher ChemicalS678 10
Tetrachloroauric acidFisher ChemicalG54 1
TrehaloseAcros OrganicsNC9022655
Triethyl amineAcros OrganicsAC157910010

参考文献

  1. . Global Immunization: Worldwide Disease Incidence Available from: https://www.chop.edu/centers-programs/vaccine-education-center/global-immunization/diseases-and-vaccines-world-view (2018)
  2. Paul, A., Bera, M., Gupta, P., Singh, N. D. P. o-Hydroxycinnamate for sequential photouncaging of two different functional groups and its application in releasing cosmeceuticals. Organic and Biomolecular Chemistry. 17 (33), 7689-7693 (2019).
  3. Kumari, A., Yadav, S. K., Yadav, S. C. Biodegradable polymeric nanoparticles based drug delivery systems. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 75 (1), 1-18 (2010).
  4. Dai, C., Wang, B., Zhao, H. Microencapsulation peptide and protein drugs delivery system. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 41 (2-3), 117-120 (2005).
  5. Souery, W. N., et al. Controlling and quantifying the stability of amino acid-based cargo within polymeric delivery systems. Journal of Control Release. 300, 102-113 (2019).
  6. Wang, W. Advanced protein formulations. Protein Science. 24 (7), 1031-1039 (2015).
  7. Lee, J., et al. An ultraviolet-curable, core-shell vaccine formed via phase separation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. , (2019).
  8. Kittler, S., Hickey, S. G., Wolff, T., Eychmüller, A. Easy and Fast Phase Transfer of CTAB Stabilised Gold Nanoparticles from Water to Organic Phase. Zeitschrift für Physikalische Chemie. 229, 235 (2015).
  9. Soliman, M. G., Pelaz, B., Parak, W. J., del Pino, P. Phase Transfer and Polymer Coating Methods toward Improving the Stability of Metallic Nanoparticles for Biological Applications. Chemistry of Materials. 27 (3), 990-997 (2015).
  10. Arun Kumar, S., Good, J., Hendrix, D., Yoo, E., Kim, D., Deo, K. A., Jhan, Y. Y., Gaharwar, A. K., Bishop, C. J. Nanoengineered Light-Activatable Polybubbles for On?Demand Therapeutic Delivery. Adv. Funct. Mater. , 2003579 (2020).
  11. Wuthrich, P., Ng, S. Y., Fritzinger, B. K., Roskos, K. V., Heller, J. Pulsatile and delayed release of lysozyme from ointment-like poly(ortho esters). Journal of Controlled Release. 21 (1), 191-200 (1992).
  12. Wang, W. Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals. International Journal of Pharmaceutics. 185 (2), 129-188 (1999).
  13. Wong, D. Y., Hollister, S. J., Krebsbach, P. H., Nosrat, C. Poly(epsilon-caprolactone) and poly (L-lactic-co-glycolic acid) degradable polymer sponges attenuate astrocyte response and lesion growth in acute traumatic brain injury. Tissue Engineering. 13 (10), 2515-2523 (2007).
  14. Davoodi, P., et al. Drug delivery systems for programmed and on-demand release. Advanced Drug Delivery Reviews. 132, 104-138 (2018).
  15. Huang, Y. C., Lei, K. F., Liaw, J. W., Tsai, S. W. The influence of laser intensity activated plasmonic gold nanoparticle-generated photothermal effects on cellular morphology and viability: a real-time, long-term tracking and monitoring system. Photochemical and Photobiological Sciences. 18 (6), 1419-1429 (2019).
  16. Link, S., Burda, C., Nikoobakht, B., El-Sayed, M. A. Laser-Induced Shape Changes of Colloidal Gold Nanorods Using Femtosecond and Nanosecond Laser Pulses. The Journal of Physical Chemistry B. 104 (26), 6152-6163 (2000).
  17. . Chlorine Available from: https://www.epa.gov/sites/production/files/2016-09/documents/chlorine.pdf (2000)

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

164 NIR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved