マウスの後肢における二次リンパ浮腫を誘導する改訂方法

要約

この動物モデルは、研究者がマウスの後肢で統計的に有意な二次リンパ浮腫を誘導することを可能にし、少なくとも8週間持続する。モデルはリンパ浮腫の病態生理学を研究し、新しい処置の選択を調査するために使用することができる。

要約

動物モデルは、病気の病態生理学を理解するだけでなく、潜在的な治療オプションを探求するためにリンパ浮腫の研究において最も重要である。このマウスモデルは、研究者が少なくとも8週間持続する有意なリンパ浮腫を誘発することを可能にする。リンパ浮腫は、分画放射線療法とリンパ薬の外科的アブレーションの組み合わせを使用して誘導される。このモデルは、マウスが手術の前後に10グレー(Gy)放射線の用量を得ることを必要とします。モデルの外科的部分は、3つのリンパ管の結び合合とマウス後肢からの2つのリンパ節の抽出を含む。マウスの小さな解剖学的構造のために、マイクロ外科ツールと顕微鏡へのアクセスが不可欠です。このモデルの利点は、統計的に有意なリンパ浮腫をもたらし、異なる治療オプションを評価するための良好な基礎を提供することです。それはまたマイクロ外科の訓練のための大きく、容易に利用できる選択である。このモデルの制限は、特に事前に練習していない場合、手順に時間がかかる可能性が高いということです。このモデルは、重篤な罹患率を引き起こすことなく、マウスにおいて客観的に定量可能なリンパ浮腫をもたらし、3つの別々のプロジェクトで試験されている。

概要

リンパ浮腫は、局所的な組織腫脹につながるリンパ液の蓄積を特徴とし、これは主にリンパ^管1におけるリンパ液の流れの障害または破壊によって生じる。リンパ^系2における感染、閉塞、傷害または先天性欠陥によってリンパ流が損なわれたり、破壊されたりする。これらの病因は、炎症の慢性状態につながるリンパ液の蓄積をもたらし、その後の線維化、ならびに脂肪^組織3の沈着をもたらす。リンパ浮腫は、原発性または二次リンパ浮腫として分類することができる。原発性リンパ浮腫は、発達異常または遺伝子変異によって引き起^{こされる2、4。}二次リンパ浮腫は、基礎的な全身性疾患、手術または^外傷2、4のために生じる。二次リンパ浮腫は、世界で最も一般的なリンパ浮腫の形態^{である 2}.先進国では、二次リンパ浮腫の最も一般的な原因は、アジュバント放射線療法やリンパ^節解離5などのオンコロジー療法である。リンパ浮腫は乳癌患者の間で最も頻繁であるが、婦人科、黒色腫、泌尿生殖器または頸部^癌6の患者においても発症し得る。乳がんと診断されたすべての女性のうち、21%がリンパ浮^腫7を発症することが示唆されている。

リンパ浮腫は、身体的にも心理的にも患者にストレスを与える可能性があります。リンパ浮腫の患者は、感染のリスクが高い^5,8,9, 生活の質が悪く、社会不安やうつ病 10 の症状を発症する可能性^{があります。}慢性リンパ浮腫の合併症は、高いケアコストと増加した疾患^負担9、11につながります。所見はまた、リンパ浮腫が乳癌^治療12後の死亡リスクの増加に関連している可能性を示唆している。患部の圧縮、手動リンパドレナージ、一般的なスキンケアなどの保守的な管理は、最初のラインアプローチのままです。現在、治癒治療はありません⁶.外科・医療の分野では進歩を遂げていますが、まだ改善の余地があります。より多くの研究は、疾患の病態生理学および進行に関する洞察を提供し、臨床医^が患者に対してより良い治療オプションを提供することを可能にするために必要である5。

動物モデルは、疾患の病態生理学を理解し、潜在的な治療オプションを開発するために、前臨床研究で使用されています。いくつかの異なるリンパ浮腫動物モデルは、イ^{ヌ13、14、ウサギ15、羊16、豚17、18}とげっ歯^類19、20で確立されています。 ^{21、22、23、24}.げっ歯類モデルは、リンパ機能の再構築を調査する際に、げっ歯類が容易にアクセスでき、比較的低価格^の25に起因する、最も費用対効果の高いモデルのようです。マウスモデルの大半は、^{マウス21、22、23}の尾部にリンパ浮腫を誘導することに焦点を当てている。尾部モデルは非常に信頼できるが、リンパ浮腫を誘発するための正確な外科技術は以前に出版された材料で有意に異なる。これは、既知のゴミ捨て^場25に提示される発達リンパ浮腫の持続時間および堅牢性の変動をもたらす。後肢モデルでリンパ浮腫を誘導するために異なる技術が使用されており、それらはまた様々な結果をもたらすが、後肢モデルは翻訳の観点から理解しやすいかもしれない。以前のリンパ浮腫モデルは自発的リンパ浮腫分解能によって妨げられているので、再現性と永久的なリンパ浮腫モデルが必要です^25.研究者は以前、自発的なリンパ浮腫の分解能を防ぐために放射線の線量を増やそうとしましたが、これはしばしばその後の重度の罹患^率25につながっています。

このモデルは、微小手術と放射線を組み合わせることにより、重度の罹患率を引き起こすことなく、統計的に有意なリンパ浮腫をもたらす。モデルは、重篤な罹患^率26を引き起こすことなく、リンパ浮腫を誘発する照射の用量を追加することによって、以前の外科モデルから改訂された。また、マイクロサージカルトレーニングの絶好の機会です。マウスの小さな解剖学的構造のために、マイクロサージカル装置と顕微鏡へのアクセスが必要です。外科的処置は、ユーザーがマイクロ手術器具で縫合するなど、基本的な微小外科技術を教えられたときに行うことができる。この手順を実行したオペレータは、すべてマイクロサージカルスキル(1981)と基本的なマイクロ縫合技術(1985)の前提条件に関するAclandによるチュートリアルビデオを見ました。研究に使用する前に、8-10回の手術を行うお勧めします。手順を練習すると、ミスが少なくなり、手順をより効率的に実行できます。マスターすると、外科的処置は45分で行うことができる。

プロトコル

動物は、機関のガイドラインに従って、南デンマーク大学動物介護施設に収容されました.動物の被験者に関するすべての手順は、デンマーク環境・食品省動物実験検査所によって承認されています。

1. 手術前照射

注:手術前照射は手術の7日前に行われます。

1. 麻酔を誘発する。
   1. 誘導ボックスにマウスを入れ、気化器を酸素流量0.8−1.2 L/minの3%アイソフルランに設定し、吸入麻酔を誘発します。
      注:あるいは、注射麻酔薬を使用できるが、吸入麻酔を誘発する照射の短期間で十分であった。本稿で提示した結果を得るために、9週齢の雌C57BL6マウスを用いた。
   2. マウスがテールまたはポーピンチテストによって完全に麻酔されていることを確認します。
2. マウスを照射用に配置します。
   1. 完全に鎮静した場合は、誘導ボックスからマウスを移動し、放射線源の下に配置し、後肢をテープでゆっくりと固定します。
      メモ:マウスは放射線の短い間鎮静されたままになります。
   2. 1.5 mm の厚さのリード パッドを配置して、手術を受ける領域 (膝の周りに直径 25 mm の円形領域) のみが照射されるようにします。
3. 5.11 Gy/min(100 kVp、10 mA)の線量で10 Gy放射線の用量を投与する。
   注意: 放射線を使用する場合は、安全上の注意が必要です。この実験では、すべての照射が放射線絶縁室で行われ、放射線源は全ての人員が部屋を出て密閉した時にのみオンになりました。
4. マウスをケージに戻します。

2. 機器の設定

注:手術は外科的処置専用の部屋で行われるべきである。手術面は無菌でなければならない。

1. 70%エタノールですべての手術面を徹底的に洗浄します。ヘアネットとカバーオールを着用してください。無菌手術器具と滅菌手袋を使用してください。
2. 麻酔を準備します。
   1. フェンタニル1mL(0.315 mg/mL)、ミダゾラム1mL(5mg/mL)、滅菌水2mLを引き上げます。コンポーネントごとに異なる注射器と針を使用します。
   2. シリンジを無菌ガラスチューブにゆっくりと空にして、フェンタニルと滅菌水を混ぜます。混合した場合は、ミダゾラムを加えた作業液を完成させる。
3. 鎮痛を準備します。
   1. ブプレノルフィン(0.3 mg/mL)の0.2 mLと生理食リンの2 mLを描きます。
   2. シリンジを無菌ガラス管にゆっくりと空にして、加工液を完成させ、ボリュームを混ぜます。
4. 顕微鏡の電源を入れ、照明が十分であり、顕微鏡がオペレータの目に合わせて十分に調整されていることを確認します。
   メモ:すべての外科的処置は操作顕微鏡の下で行われるべきである。4x-25xの倍率の範囲で十分です。

3. 準備

1. クリアされたスケールで空の容器にマウスを置くことによって、マウスの前手術の重量を量ります。
2. 麻酔薬を投与する。
   1. マウスの体重10gあたり麻酔薬の0.1 mLを描きます。ボーラス注射として麻酔薬を皮下注射する。
   2. 十分な寝具と避難所を備えたケージで、完全に鎮静するまで約10分間、マウスを休ませます。筋肉の弛緩を評価することによって麻酔の深さを調べ、足または尾のピンチテストを行う。
3. 完全に鎮静したら、電気バリカンを使用して手順のために選択した後肢を剃ります。余分な髪を拭くようにしてください。
4. 暖房パッドなどの加熱装置をオンにし、手術用の布で覆います。
5. 酸素の流れを0.8 L/minに設定し、ノセコンで接続します。100%酸素を使用してください。
   メモ:ノセコーンは酸素供給のためだけであり、麻酔ではありません。
6. 眼科軟膏を塗布し、皮下に0.5mLの生理食リンを注射し、好ましくはマウスの擦り傷で、手術中の低血圧を予防する。
7. 手術のためにマウスを置きます。
   1. 手術用の布の上にマウスを置きます。ノセコーンをスヌートの上に置きます。
   2. 手術中にマウスがずれるのを防ぐために、後肢の端をテープでゆっくりと固定します。
   3. アルコール/クロルヘキシジンまたはアルコール/ポビドネヨウ素を使用して皮膚を殺菌します。

4. 手術

注: この例では、左の後肢(マウスが配置位置で表示されている場合)が手順に対して選択されています。

1. 円形の切開を行います。
   1. 滑らかな鉗子で皮膚を持ち上げ、ポピュライトフォッサに約5mm近似する小さな開口部をクリップします。
   2. 鋭いはさみを開口部にスライドさせ、膝のすぐ上に切り傷が終わるように膝に向かってクリップします。クリッピング中に鉗子で皮膚を持ち上げて、下にある血管を穿刺しないようにしてください。
   3. マウスを動かしやすく、円周切開が完了するまで、膝からポプリタルフォッサに向かってクリップを続けます。
2. 膝の下の皮膚を解剖します。
   1. 膝の下の部分を足首の上の数ミリメートルにゆっくりと解剖し、鉗子で皮膚を持ち上げながらマイクロシブをゆっくりと開閉します。
   2. マイクロハサミを使用して、慎重に残りの目に見える癒着を切り取ります。滅菌生理食塩分を定期的に使用して、手順全体で組織を湿らせておきます。
3. 円周切開部の近位縁で皮膚を解剖し、弾性リトラクタで後退できるようにします。
   注:レトラクターはオペレータが近位リンパ管のよりよい眺めを可能にし、外科の間に近位の縁がずれるのを防ぐ。
4. まだ傾向のある位置にいる間に、後肢を穏やかに回転させ、テープで固定して、露出した領域の最も近位の点から最も遠位点まで、傾斜静脈が見えるようにします。
5. 30 G針で0.5 mLの注射器を使用して、2番目と3番目のつま先の間に約0.01 mLのパテントブルーVを皮下注射します。足を数回軽く押して、特許ブルーVを顕微鏡で視覚化し、特許ブルーVがリンパ管を満たすようにします。
   注:リンパ管の青色が処置中に薄れた場合、取り込みを促進するために足を穏やかにマッサージし、より多くの特許ブルーVを注入するのではなく、特許ブルーVの過剰使用は、リンパ管を取り巻く組織の漏れおよび着色につながる可能性があります。手順を損なう。
6. 重要な構造を見つける:ポプリタルリンパ節(PLN)、リンパ節(DLV1およびDLV2)に遠位の2つのリンパ管、およびリンパ節(PLV)に近位の1つのリンパ管。
   注:すべてのリンパ管は、イスキア様静脈に隣接して見つけることができます。近位リンパ管は通常静脈の内側に見られ、2つの遠位リンパ管は静脈の内側および横に見られる。構造の省略形は、付属のビデオで使用されます。
7. PLVを明確に視覚化し、マイクロニードルホルダーとマイクロフォースプを使用して10-0ナイロン縫合でそれをリゲートする拡大。プットを数回押して、特許ブルーVが縫合糸に近接して通過しないようにします。
   注:リンパ管を取り囲む脂肪をトリミングする必要がある場合があります。
8. ステップ4.7を繰り返して、2つの遠位リンパ管をリゲートします。足を数回押して、パテントブルーVが合字に近位を通過しないようにします。リンパ管がうるさかの静脈に近い場合は、さらに遠くまで解剖してみてください。
   注:この例では、合字がリンパの流れを妨げることにより、リンパ管の1つが破裂していることがわかる。リンパ管はしばしば静脈からさらに下に分裂する。
9. ポピュライトリンパ節を取り外します。
   1. ポピュライトリンパ節を見つけ、小さな穴をマイクロシザーでクリップしてアクセスし、マイクロフォースプスとマイクロシザーで取り外します。
      注:リンパ節は、周囲の脂肪組織とは対照的に、滑らかな真珠のような表面を有する。
   2. 除去した組織がリンパ節であるかどうかをテストするには、水で満たされた試験管に入れます。
      注:組織が脂肪で構成されている場合、組織は浮遊します。組織がリンパ節の場合、底部に沈みます。
10. 鼠径脂肪パッドとリンパ節を取り外します。
    1. 鼠径脂肪パッドを取り外す前に、双極性凝固器を使用して、脂肪を通る血管を焼灼します。
    2. マイクロフォースとマイクロシザーを使用して鼠径脂肪パッドを切り離します。脂肪を通って走る焼灼容器をゆっくりとクリップします。その後、鼠径部の脂肪組織を穏やかに切除します。
       注:脂肪に位置するリンパ節は、特許ブルーVによって着色されることはほとんどなく、脂肪との区別が難しい場合があります。脂肪パッドを1枚で取り外すことを、リンパ節が取り外した状態を確認する最善の方法です。
11. 無菌生理食塩水で脚を十分に洗い流し、小さな毛や粒子が外科的領域から完全に取り除かれ、創傷汚染や感染を避けるために顕微鏡を通して確認します。アクティブな出血がないことを確認します。
12. 鉗子と針ホルダーを使用して6-0ナイロン縫合糸で筋肉のファシアに皮膚の縁を縫合し、表面的なリンパの流れを拘束するために2-3 mmのギャップを残します。
    メモ:付属のビデオは、完成した縫合糸の例を示しています。
13. 鎮痛を投与する。マウスの体重30gあたり0.1 mLの鎮痛を描きます。ボーラス注射として皮下に鎮痛を注射する。
14. 比較のために手術後のためにマウスの重量を量ります。
15. 回復のために加熱したキャビネット内のケージにマウスを置きます。

5. 術後ケア

1. 水と食物アドリビタムで手術後に回復するためにマウスに個々のケージを与えます。
2. 鎮痛のために3日間、ブプレノルフィン3xの0.02 mLの皮下用量を投与する。
3. 適切な創傷治癒、痛みおよび感染の徴候のために毎日動物を監視する。感染の徴候がある場合は、抗生物質軟膏を使用してください。

6. 手術後の照射

1. 手術の3日後に、手術前照射の手順を繰り返します(ステップ1.1−1.4)。

結果

この手順は、以前に 3 つの別々の実験で使用されています。すべての実験は、すべてこの記事の共同執筆者である異なるリード研究者によって行われました。3つの実験すべてにおいて、このプロトコルで説明したのと同じ手順に従うように細心の注意を払った。3つの実験すべてにおいて、二次リンパ浮腫は一方の後肢に誘発され、もう一方の後肢はコントロールと?...

ディスカッション

このプロトコルには、いくつかの重要な手順があります。第一に、放射能を扱う際には安全対策を講じることが重要です。第二に、このプロトコルの外科的部分の間に、マウスが麻酔された後に処置を開始し、不必要な休憩なしでそれを終わらせることが重要である。これは、動物の過度に長い手術期間を避け、麻酔が手術中に効果を失うことを防ぐために重要です。麻酔薬の1つのボーラス...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 Nylon suture	S&T	12051-10
6-0 Nylon suture - Dafilon	B Braun	C0933112
Coagulator - ICC 50	ERBE
Cotton tipped applicators	Yibon medical co
Dissecting forceps	Lawton	09-0190
Elastic retractors	Odense University Hospital
Electrical clipper	Aesculap	GT420
Fentanyl 0,315 mg/ml	Matrix
Heating pad - PhysioSuite	Kent Scientific Corp.
Isoflurane 1000mg Attane	Scan Vet
Isoflurane vaporizer - PPV	Penlon
Micro jewler forceps	Lawton	1405-05
Micro Needle holder	Lawton	25679-14
Micro scissors	Lawton	10128-15
Micro tying forceps	Lawton	43953-10
Microfine U-40 syringe 0,5ml	BD	328821
Microlance syringe 25g	BD
Microlance syringe 27g	BD
Midazolam 5 mg/ml (hameln)	Matrix
Needle holder - Circle wood	Lawton	08-0065
Non woven swabs	Selefa
Opmi pico microscope F170	Zeiss
Patent blue V - 25 mg/ml	Guerbet
Scissors - Joseph	BD	RH1630
Siemens INVEON multimodality pre-clinical scanner	Siemens pre-clinical solutions
Source of radiation - D3100	Gulmay
Stata Statistical Software: Release 15	StataCorp LLC
Temgesic - 0,2 mg	Indivior
Vet eye ointment - viscotears	Bausch & Lomb