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要約

転写因子の新しい調節因子を同定するために、我々は、二重ルシメラーゼベースの転写レポーターアッセイを用いて、配列レンチウイルスまたはレトロウイルスRNAiライブラリをスクリーニングするアプローチを開発した。このアプローチは、1回の実験で数百人の候補者をスクリーニングするための迅速かつ比較的安価な方法を提供します。

要約

転写因子は、さまざまな下流プロセスに影響を与える多数の標的遺伝子の発現を変化させ、抗癌療法の良い標的となる可能性があります。しかし、転写因子を直接標的化することはしばしば困難であり、転写因子が1つ以上の成人組織で必要な場合には副作用を引き起こす可能性がある。がん細胞の転写因子を異常に活性化する上流の調節因子を特定することは、特にこれらのタンパク質が薬物に対して容易である場合、より実現可能な代替手段を提供する。ここでは、配列中規模レンチウイルスライブラリーと、がん細胞における転写因子の新しい調節因子を同定するための二重ルシファーゼベースの転写レポーターアッセイを組み合わせることができるプロトコルについて説明する。当社のアプローチは、1回の実験で何百もの遺伝子をテストするための迅速で簡単で安価な方法を提供します。このアプローチの使用を実証するために、カバ経路の下流のエフェクターである2つの転写共活性化剤であるYes-関連タンパク質(YAP)およびPDZ結合モチーフ(TAZ)と転写共活性化剤のいくつかの調節因子を含む配列レンチウイルスRNAiライブラリのスクリーンを行った。しかし、このアプローチは、実質的に任意の転写因子または共因子のレギュレータをスクリーニングするように変更することができ、CRISPR /CAS9、cDNA、またはORFライブラリをスクリーニングするためにも使用できます。

概要

このアッセイの目的は、ウイルスライブラリーを使用して、比較的迅速かつ安価な方法で転写因子の調節因子を同定することにある。異常な転写活性は癌と,転移1、2、3、4、5、62,3に関連しているので、癌細胞における転写因子を標的化することは有望な治療アプローチである。1,4,56しかし、転写因子は、多くの場合、薬理学的に標的化することは困難である7、多くは、成体組織8、9、109,10の正常な細胞機能に必要とされる。8異常に転写因子を活性化して病気を引き起こす癌関連経路を標的にすることは、より重篤な副作用を有する可能性を有するより実現可能なアプローチである。配列レンチウイルスおよびレトロウイルスRNAi、CRISPR/CAS9、cDNA、またはORFライブラリの商業的利用により、研究者は単一の実験で多数の遺伝子の重要性をテストすることができます。しかし、転写活性の変化に対する信頼性の高い読み出しが必要です。

ここでは、がん細胞の転写因子を調節するタンパク質を同定するための、二重ルシメラーゼベースの転写レポーターアッセイおよびアレイ化レンチウイルスライブラリーの使用について述べた。本アッセイでは、がん関連遺伝子を標的とするshRNAがレンチウイルス導入を介して哺乳動物癌細胞に送達され、細胞はプロマイシンを用いて安定な集積のために選択される。細胞は、次に、調査中の転写因子に特異的なプロモーターによって駆動されるホタルルシメラーゼを発現するレポーター構築物と、調査中の転写因子に反応しない構成的に活性なプロモーターからレニラルシメラーゼを発現する対照構造を発現させるレポーター構築物にトランスフェクトされる。我々は、YAPおよびTAZの調節因子,、カバ経路8、10、1110の重要な下流エフェクターのための概8念実証画面でこのアプローチを実証する。11YAPおよびTAZの異常な活性は、転移性カスケード11のいくつかのステップを促進し、多くの癌11、12、1312,13で観察される。11しかし、いくつかの癌細胞においてYAPおよびTAZがどのように異常に活性化されるのかはまだ完全には理解されていない。YAPとTAZはDNAを結合せず、代わりに他の転写因子によってプロモーターにリクルートされる。転写因子のTEAドメイン(TEAD)ファミリーのメンバーは、YAPおよびTAZの主要な結合パートナーであり、ほとんどのYAPおよびTAZ依存的な機能にとって重要である。我々のレポーター構築物は、YAP/TAZ-TEAD応答性プロモーターからのホタルルシメラーゼを発現しており、以前の研究では、YAP-TEADおよびTAZ-TEAD転写活性22、14、1514,15の変化を忠実に検出することを実証した。

当社のアプローチは、高速で中規模のスループットであり、スクリーニング施設、自動ロボット、またはプールされたライブラリの深いシーケンスを必要としません。コストは比較的低く、選択する多くの市販のライブラリがあります。必要な装置および試薬はほとんどの実験室で比較的標準的である。ルシファーゼベースのレポーターが存在するか、生成された場合、事実上任意の転写因子の調節因子をスクリーニングするために使用することができます。このアプローチを使用してがん細胞のshRNAをスクリーニングしますが、合理的な効率でトランスフェクトできる細胞株は、あらゆるタイプのアレイ化されたライブラリで使用できます。

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プロトコル

注 : このプロトコルの概略的な概要を図 1に示します。

1. レンチウイルスベクターライブラリー調製

注:実証済みの画面では、96ウェルプレートでグリセロールストックとして購入した配列付きshRNAライブラリを使用していましたが、ライブラリは候補のリストに基づいて手動で組み立てることもできます。適切なコントロールを考慮し、ライブラリに含める必要があります。これには、非標的対照shRNA(shNTC)、調査中の転写因子を標的とするコントロールshRNA、および可能であれば、ホタルルシファーゼを標的とするshRNAが含まれる。

  1. 100 μg/mL のアンピシリンを含むルリアブロス(LB)(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エキス、1%NaCl、pH 7.5)を96ウェル深いウェルプレートの各ウェルに加えます。グリセロールストック2 μLで各ウェルウェルを接種し、225 rpmで一定の撹拌で一晩37°Cで成長させます。
  2. 各細菌培養物を1.5mL遠心分離チューブに移し、4°Cで21,000xgで10分間遠g心分離して細菌をペレット化します。
  3. メーカーのプロトコルに従って、細菌のミニプレップキットを使用して各ベクターを精製します。
  4. 分光光度計を用いて各ベクターの濃度を決定する。
  5. プラスミドは-20°Cで保管してください。
    注: プロトコルはここで一時停止することができます。

2. 配列レンチウイルスライブラリのパッケージング

注:レンチウイルスに関するすべての作業は、感染細胞の包装、感染、およびその後の培養を含め、制度上のバイオセーフティ規則および規制に厳密に従う必要があります。

  1. 完全な成長培地(ダルベックの改変イーグル培地(DMEM)4 mM L-グルタミン、4,500mg/Lグルコース、ピルビン酸ナトリウム、10%のウシ胎児血清(FBS)、100μg/mLペニシリン、100 μg/mLストレピシン、LM.抗生物質を含む293FT細胞を拡大します。
  2. ステップ 1.4 からライブラリ内の各ベクターに対して、1 x 105 293FT セルを 1 つの 24 ウェルにシードします。
    注:コントロールウイルスベクターのいくつかの余分な井戸をパッケージ化し、ステップ3に進む前にウイルスのタイターをテストするために使用することをお勧めします(下記参照)。
  3. 37°Cで細胞を5%CO2で242時間インキュベートする。
    注:14の前に説明したレンチウイルスをパッケージ化するための一般的なプロトコルは、このプロトコルの 24 ウェルに縮小されました。レンチウイルス包装にはpsPAX2を、コートタンパク質としてVSVGを使用します。エトロピックウイルスが望ましい場合は、VSVGの代わりにEcoを送達するベクターを使用することができます。このプロトコルは、標的細胞の30%〜70%の感染効率を与えるウイルス力を達成するために最適化されることを強くお勧めします(議論参照)。使用されるすべてのベクトルのリストについては、補足表 1を参照してください。
  4. 以下に説明するステップ1.4から各ウイルスベクターにトランスフェクション混合物を設定する。各トランスフェクションには、250 ngのウイルスベクター、125 ngのpsPAX2、125 ngのVSVG、1.25 μLのトランスフェクション試薬1、および23.75 μLのトランスフェクションバッファーが含まれている必要があります(材料表を参照)。
    1. レンチウイルスベクターをヌクレアーゼを含まない水で50 ng/μLに希釈し、5 μL(250 ng)を96ウェルPCRプレートのウェルに移します。
    2. トランスフェクション試薬1と23.75 μLのトランスフェクション試薬1と23.75 μL*Xを混合してトランスフェクションスーパーミックスを行い、そこで「X」はトランスフェクションの総数とピペット処理中の体積損失を考慮する追加のトランスフェクション数です。
    3. トランスフェクションスーパーミックスを室温で5分間インキュベートします。
    4. ステップ2.4.3からトランスフェクションスーパーミックスのチューブにpsPAX2と125 ng * XのpsPAX2と125 ng * Xを追加し、ミックスするために上下に穏やかにピペット。ステップ 2.4.5 に迅速に進みます。
    5. 直ちにステップ2.4.4からPCRストリップの各チューブに混合物をアリコートし、マルチチャンネルピペットを使用して、ステップ2.4.1からウイルスベクターを含む各ウェルに25μLの混合物を転送します。
    6. 室温で20分間インキュベートします。
    7. ステップ2.4.6の各96ウェルから、ステップ2.3から293 FTセルを含む293個のウェルのウェルに30μLすべてを転送します。
  5. 37°Cで24時間5%CO2で細胞2をインキュベートし、24ウェルプレートのすべてのウェルの培地を500μLの新鮮な完全成長培地に置き換えます。37°Cで細胞を5%CO2でインキュ2ベートし、さらに24時間培養します。
  6. マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルとアリコート220 μL(ステップ3の1感染と余分な体積に十分)からウイルス上清を2つの96ウェルに集めます。これらは配列されたウイルス上清の版である。
  7. 配列されたウイルス上清プレートを-80°Cに保存してください。
    注: プロトコルはここで一時停止することができます。また、ステップ 3 に進む前に、感染する細胞にパッケージ化されたコントロール ウイルス (上記を参照) の一部をテストすることをお勧めします。これは、力価が少なくとも30%の感染効率を達成するのに十分であることを保証するためである。

3. 画面の細胞の感染

注:ヒト黒色腫細胞(A375)は、このアプローチを実証するために使用されましたが、この方法はレンチウイルスに感染する任意の付着細胞に適用することができます。ただし、細胞培養とめっき条件は、細胞株ごとに最適化する必要があります(説明を参照)。

  1. 完全な増殖培地で感染する細胞を展開します。
  2. 1 x 10 5細胞を1x105細胞でシード24ウェルプレートに0.5 mlの完全な成長培地で使用します。シード1は、各ウイルスベクター(コントロールを含む)をテストし、ステップ3.7で薬物選択のための制御として機能する感染しない余分な井戸を含む。
  3. 37°Cで細胞を5%CO2で242時間インキュベートする。
  4. ステップ3.2の各ウェルに、凍結配列されたレンチウイルス上清とは異なるウイルス上清を次のように感染させる。
    1. 20 μg/mL ポリブレンを含む完全な成長培地を準備します。
    2. ステップ2.7から室温まで配列レンチウイルスライブラリー上清を解凍します。
    3. ステップ3.2から24ウェルプレートから成長培地を吸引し、すぐに各ウェルに200μLのポリブレン含有成長培地を加えます。
    4. マルチチャンネルピペットを使用して、ステップ3.4.2からステップ3.4.3から24ウェルに各96ウェルからウイルス上清の200 μLを移します。
  5. 24〜48時間の5%CO2で37°Cで細胞をインキュベートする。
    注:一部の細胞株は、shRNAを発現し、ピューロマイシン耐性になるために24時間より長く必要な場合があります。ここで使用されるウイルスベクターは、3'UTRのmiR30ベースのshRNAを持つターボGFP-IRES-puroRを提供する(図1)。プロマイシン耐性遺伝子及びshRNAの感染効率及び発現を緑色蛍光タンパク質によりモニタリングした。
  6. 2.5 μg/mL のピューロマイシンを含む完全な成長培地を準備します。
    注:ピューロマイシンの選択濃度は細胞株によって異なります。スクリーンの前にアッセイされる細胞株ごとに抗生物質殺し曲線を実行することが推奨される。
  7. 各ウェルから培地を吸引し、500 μLのピューロマイシン含有完全成長培地に交換します。
    注:また、ピューロマイシンの選択が完了したことを確認するために、後続の手順で使用することができるコントロール非感染井戸にピューロマイシンを追加してください。
  8. 37°Cで細胞を5%CO2で482時間インキュベートする。
    注:48時間選択するのが最善なので、細胞が48時間より前に過剰にコンペラしないように、メッキ密度とウイルス性の強化剤を最適化する必要があります。
  9. 感染した細胞が蛍光顕微鏡下で緑色であり、プロロマイシンで処理されたコントロール上の細胞がすべて死んでいることを確認してから、ステップ4に進みます。

4. 二重ルシファーゼレポータートランスフェクション用の細胞の播種

注: テストトランスフェクションは、各新しいセルラインの最適な播種密度を決定するために行う必要があります。

  1. ステップ3.9から各ウェルをトリプシン化し、次のように新しい24ウェルプレート上の対応する位置でウェルに約1 x 105細胞を転送します。
    注: このプロトコルは、数百の shRNA を持つライブラリのスクリーニング用に設計されているので、感染した細胞のすべてのウェルをカウントすることは不可能です。したがって、以下のステップを使用して、各ウェルのセル数を推定し、ほぼ等しいめっき密度を確保しました。
    1. ステップ3.9から3-4グループにウェルをグループ化し、グループ内のすべてのウェルが同様の細胞密度を有する。
    2. トリプシンEDTAの200 μL(1x PBSは0.5 mM EDTAと0.1%トリプシンで補う)を37°Cで5分間、各グループから1代表ウェルにトリプシンします。その後、完全な成長培地を含む400 μLのピューロマイシンを添加してトリプシン-EDTAを中和します。
    3. 各代表ウェルをカウントして総細胞数を決定し、完全な増殖培地を使用して各代表ウェルから細胞懸濁液を2 x 105細胞/mLに希釈します。
    4. ステップ4.1.3から新しい24ウェルプレートの対応する位置に各ウェルの各ウェルのシード0.5 mL(1 x 105細胞)を新しい24ウェルプレートの対応する位置に、この新しい24ウェルプレートを37°Cで24時間5%CO2でインキュベートします。2
    5. ステップ 4.1.1 のグループごとに、ステップ 4.1.3 で決定した合計セル数を使用してトリプシン EDTA の量を計算し、結果として得られるセル懸濁液が 1 x 106セル/mL になるように各ウェルに加算します。
    6. 各ウェルに適切な量のトリプシン-EDTAを加え、37°Cで5分間インキュベートします。
      注:大きな画面では、細胞の生存率を確保するために、24ウェルプレートをトリプシン化し、一度にではなくグループに再入れすることをお勧めします。
    7. 上記のインキュベーション中に、マルチチャンネルピペットを使用して、400 μLのピューロマイシン含有完全成長培地を、新しい24ウェルプレートの対応するウェルに添加します。
    8. ステップ4.1.7で調製した新しい24ウェルプレート上の対応する位置に、各ウェルから100 μLの細胞懸濁液(約1 x 105細胞)を移します。
    9. ステップ 4.1.1.1 からグループ化されたウェルのすべてのプレートに対して、ステップ 4.1.6 ~ 4.1.8 を繰り返します(一度に 1 つのプレート)。
  2. 37°Cで細胞を5%CO2で242時間インキュベートする。

5. 二重ルシファーゼレポーターのトランスフェクション

  1. ステップ4.2から各井戸を、次のようにデュアルルシファーゼレポーターを構築してトランスフェクトします。
    注:レニラルシファーゼベクターを制御するホタルルシファーゼレポーターベクターのDNAの総量と最適比は、このアッセイを開始する前に決定する必要があります。ここでは、20部ホタルルシファーゼレポーターと1部制御レニラルシメラーゼを含むDNA混合物の400ngが使用された。
    1. トランスフェクション希釈混合物(チューブA)とレポーター希釈混合物(チューブB)を各試薬の示された量(表1)にトランスフェクションの総数(プラス数個)を掛けたものにして作ります。
      注: このプロトコルはトランスフェクション試薬 2 用に最適化されています(資料表を参照)。別のトランスフェクション試薬を使用する場合、トランスフェクションは、このステップの前に最適化する必要があります。
    2. トランスフェクション希釈混合物(チューブA)をレポーター希釈混合物(チューブB)と混合し、室温で15分間インキュベートしてトランスフェクション混合物を製造する。
    3. 上記のインキュベーション中に、ステップ4.2の各24ウェルを0.25 mLのリン酸緩衝塩(PBS)でリンスし、各ウェルに447μLの完全な成長培地を加えます。
    4. 15分インキュベーションの後、マルチチャンネルピペットを使用して、24ウェルプレートの各ウェルに53 μLのトランスフェクションミックスを分配します。
  2. 37°Cで細胞を5%CO2で242時間インキュベートする。

6. 二重ルシファーゼ活性の定量化

  1. プレートリーダーと、以下に説明するデュアルルシファーゼレポーターアッセイキットを用いてルシファーゼ活性を測定します。
    注:このプロトコルは、示されたレポーターアッセイキット(資料表を参照)に最適化されており、メーカーの推奨プロトコルに従います。
    1. 5x受動溶菌バッファー(キットに用意)1~5を脱イオン水で希釈して、すべてのウェルに加えていくつかの余分な(ウェルあたり75 μLが必要)十分な1x受動溶精バッファーを準備します。また、試薬Aおよび試薬Bバッファ(キットに設けられており、各ウェルにそれぞれ100μLずつ必要です)。
    2. ステップ5.2から24ウェルプレートの各ウェルから培地を吸引する。
    3. 1x受動リシスバッファーの 75 μL を各ウェルに加え、時折揺れで 30 分間室温でインキュベートします。
    4. 50x試薬B基板(キットに設けられている)を解凍した試薬Bバッファーで1:50希釈して試薬Bを調製した。
    5. 1x受動リシスバッファーの 30 μL をブランキング用の 4 ウェルに追加します (補足表 2を参照)。
    6. ステップ6.1.3から30 μLのライセートを96ウェルの平底白色アッセイプレートの重複ウェルに移します。
    7. マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに50 μLの試薬Aを加え、プレートリーダーでホタルルシファーゼ信号を読み取ります。
    8. マルチチャンネルピペットを使用して、ステップ6.1.4から50μLの試薬Bを各ウェルに加え、プレートリーダーでレニラルシファーゼ信号を読み取ります。
  2. 生データを次のように処理します (詳細については補足表2を参照)。
    1. 低い値として非常に低いレニラルシファーゼシグナルを有するサンプルを除外するウイルス構築物が有毒であったか、またはあまりにも少数のトランスフェクト細胞がアッセイされたことを示す。
      注:議論で説明したように、大幅に「低い」レニラルシファーゼ信号は異常な結果をもたらすことができます。ここで、レニラルシファーゼシグナルが平均より1標準偏差を超えていたウェルは除外した(補足表2参照)。これは、これらの細胞14においてこのレポーターシステムを用いて行われた以前の研究に基づいていたが、他の細胞株では異なる場合がある。
    2. 各ウェルの生ホタルルシファーゼ値を同じウェルの生のレニラルシファーゼ値に正規化し、ホタル/レニラ比を得る。
    3. すべての複製制御井戸のホタル/レニラ比を平均し、その後、折り目の変化を得るために、その他のすべてのウェルのホタル/レニラ比を除算します。
    4. コントロールサンプルを割り当て、ホタル/レニラ比の値を1に設定します。
    5. 重複する井戸のホタル/レニラ比を平均し、標準偏差でプロットします。
      注: 標準偏差は統計分析には使用されず、複製が大きく異なるウェルを識別する手段として使用されます。

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結果

当社のYAP/TAZ-TEADレポーターコンストラクト(pGL3-5xMCAT(SV)-492,14,15)14,15には、ホタルルシファラーゼ遺伝子を駆動する正規TEAD結合元素(MCAT)15の5つの反復を伴う最小SV-49プロモーターが含まれています(215図1)。PRL-TK制御ベクター(プロメガ)と共に細胞に共入反応さ?...

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ディスカッション

本研究では、転写因子の新規調節因子を同定し、試験するために使用できるデュアルルシファーゼベースの転写レポーターアッセイと組み合わせて、アレイドウイルスライブラリの中スループットスクリーニングのアプローチを実証する。どの画面の前にも、各セル行に対してレポーター システムを特徴付けて最適化することが重要です。調査対象の転写因子の活動の変化にレポーターが反...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

エミリー・ノートンとミカエラン・クッチャレ・ストゥリグロスがshRNAベクターの調製を支援してくれたことに感謝します。この作品の一部は、J.M.L.(#CCR17477184)に授与されたスーザン・G・コーメンキャリア触媒助成金によって支えられました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
2.0 ml 96-well deep well polypropylene plateUSA Scientific1896-2000For bacterial mini-prep
Trypsin - 2.50%Gibco15090-046Component of trypsin-EDTA
96 well flat bottom white assay plateCorning3922For dual-luciferase assay
Ampicillin - 100 mg/mlSigma-Aldrich45-10835242001-EAFor bacterial mini-prep
Bacto-tryptone - powderSigma-Aldrich95039Component of LB broth
Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop & Glo substrate (reagent B substrate) and Stop & Glo buffer (reagent B buffer) - KitPromegaE1960For dual-luciferase assay
Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red - 9.6 g/LHimediaTS1006For PBS
EDTA - 0.5 MVWR97061-406Component of trypsin-EDTA
Ethanol - 100%Pharmco-AAPER111000200For bacterial mini-prep
Foetal Bovine Serum - 100%VWR97068-085Component of complete growth media
Hexadimethrine bromide (Polybrene) - 8 mg/mlSigma-Aldrich45-H9268For virus infection
HyClone DMEM/High glucose - 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvateGE Healthcare life sciencesSH30243.01Component of complete growth media
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EAMolecular devicesFor dual-luciferase assay
L-Glutamine - 200 mMGibco25030-081Component of complete growth media
Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) - 100%Life technologiesL3000008For transfections
Molecular Biology Water - 100%VWR02-0201-0500For dilution of shRNA vector for virus packaging
NaCl - powderBDHBDH9286Component of LB broth
NanoDrop One Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo scientificFor measuring vector DNA concentration
Opti-MEM (Transfection Buffer) - 100%Gibco31985-062For transfections
Penicillin Streptomycin - 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 µg/ml (Streptomycin)Gibco15140-122Component of complete growth media
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - KitThermo Fisher ScientificK210010For bacterial mini-prep
Puromycin - 2.5 mg/mlSigma-Aldrich45-P7255For antibiotic selection after infection
TC20 automated cell counterBio-RadFor cell counting
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) - 100%Roche6365787001For virus packaging
Yeast extract - powderVWRJ850Component of LB broth
P3000 (Transfection Reagent 3) - 100%Life technologiesL3000008For transfections

参考文献

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