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要約

昆虫組織におけるベゴモウイルスの局在化および定量化のための免疫蛍光法および定量PCR法について述べている。免疫蛍光プロトコルは、ウイルスタンパク質とベクタータンパク質を共局化するために使用することができる。定量PCRプロトコルを拡張して、ホワイトフライ体全体やウイルス感染植物のウイルスを定量化することができます。

要約

ベゴモウイルス(属ベゴモウイルス、ファミリーゲミニビリダ)は、ベミシアタバチ複合体の白飛によって永続的な循環的な方法で伝染する。世界中で生産されるベゴモウイルスによる大規模な被害を考慮すると、ベゴモウイルスとそのホワイトフライベクターとの相互作用を理解することが不可欠です。そのためには、ベクター組織におけるウイルスの局在化および定量化が重要である。ここでは、例としてトマト黄色葉カールウイルス(TYLCV)を用い、免疫蛍光法によるホワイトフライ中腸、一次唾液腺、および卵巣中のベゴモウイルスを局ース化するための詳細なプロトコルを記載する。この方法は、ウイルス被覆タンパク質、色素標識二次抗体、および共焦点顕微鏡に対する特異的抗体の使用に基づいている。このプロトコルは、ベゴモウイルスタンパク質とホワイトフライタンパク質の共局性化にも使用できます。さらに、定量PCR(qPCR)によるホワイトフライ中腸、一次唾液腺、ヘモリフ、卵巣におけるTYLCVの定量に関するプロトコルについて説明します。TYLCV用に特別に設計されたプライマーを使用して、定量のためのプロトコルは、ホワイトフライの異なる組織におけるTYLCVの量の比較を可能にする。記載されたプロトコルは、ホワイトフライおよびウイルス感染植物の体内におけるベゴモウイルスの定量化に有用である可能性がある。これらのプロトコルは、ホワイトフライ中のベゴモウイルスの循環経路を分析したり、ホワイトフライとベゴモウイルスの相互作用を研究する他の方法を補完するものとして使用することができる。

概要

過去数十年で、ベゴモウイルス(属ベゴモウイルス、ファミリージェミニビリダ)は、世界中の多くの野菜、繊維、および観賞用作物の生産に深刻な損害を与えました1.ベゴモウイルスは、35以上の不可解な種2、3を含む複雑な種である白飛ベミシアタバチ(ヘミプテラ:アレイロジダエ)によって永続的に伝えられる。ベゴモウイルスは、直接的または間接的に、フェクンディティ4、長寿4、および宿主の好み5、6などのホワイトフライの生理学および行動に影響を及ぼし得る。さらに、与えられたベゴモウイルス種/株の伝達効率は、同じ実験条件の下でも異なるホワイトフライの不可解種に対して異なり、7,8,9,10であり、ベゴモウイルスとホワイエとの間に複雑な相互作用があることを示す。ホワイトフライとベゴモウイルスの相互作用の根底にあるメカニズムをよりよく理解するためには、ホワイトフライ組織におけるウイルスの局在化および定量化が不可欠です。

トマト黄色葉カールウイルス(TYLCV)はイスラエルで最初に報告されたベゴモウイルスですが、今日では世界的にトマト生産に深刻な被害を引き起こします11,12.経済的に重要なため、最もよく研究されているベゴモウイルス13の1つです。他のモノアルタイ人ベゴモウイルスと同様に、TYLCVは、14の約2,800ヌクレオチドのゲノムサイズを有する一本鎖環状DNAウイルスである。まだ議論中ですが、いくつかの証拠行は、ホワイトフライ15、16、17でTYLCVの複製をサポートしています。また、TYLCV粒子とホワイトフライタンパク質との相互作用は6,18,19,20と報告されている。ウイルス感染の場合、シロナフライはウイルス感染植物に餌を与えてTYLCVを獲得し、ニビオンは食道に沿って食道に到達し、中腸壁を貫通してヘモリンフに到達し、次に一次唾液腺(PSG)に移動する。最後に、ビリオンは唾液管に沿って唾液を植物フロム21に沿って唾液で排出される。さらに、いくつかの研究は、TYLCVが雌の白いハエからその子孫22、23にトランスボリーで伝染することができることを示している。言い換えれば、生産的な伝染を達成するために、ウイルスはホワイトフライ内の細胞障壁を克服し、ある組織から別の組織に移動しなければならない。これらの障壁の交差中に、ホワイトフライとウイルスタンパク質の相互作用が起こりやすく、おそらくウイルスが伝染する効率を決定する。

免疫蛍光はタンパク質分布解析に一般的に使用される手法です。抗体の抗原への結合の特異性は、免疫蛍光の基礎を形成する。TYLCVの経済的意義のために、TYLCVコートタンパク質に対するモノクローナル抗体が開発されており、ウイルス24を局所化する非常に敏感な方法を提供している。定量 PCR (qPCR) は、核酸の感度と特異的な定量を可能にします。この技術は、加水分解プローブ(例えば、TaqMan)または蛍光色素(例えば、SYBR Green)検出の使用に最も頻繁に基づく。加水分解プローブベースのqPCRでは、特定のプローブが必要となり、その結果、コストが増加します。蛍光色素ベースのqPCRは、標識アンプリコン特異的ハイブリダイゼーションプローブが25を必要としないため、より簡単でコスト効率が高い。これまでに、いくつかの研究では、複雑なベゴモウイルスとホワイトフライの相互作用を調査するために、他の方法と共に免疫蛍光およびqPCRを使用してきました。例えば、Pan et al. ホワイトフライ組織におけるウイルスのqPCRおよび免疫蛍光分析を行い、シロナリ種のアジアII1と中東アジアマイナー1(MEAM1)の間でタバコ巻き毛シュートウイルス(TbCSV)を送信する能力の違いは、ウイルスがアジアII1の中腸壁を効率的に横断できることによるものであることがわかった。同様に、地中海(MED)ホワイエはTYLCVを容易に伝播できるが、トマト黄色葉カール中国ウイルス(TYLCCNV)を伝播することができない。選択的伝達は、PSGにおけるウイルスの免疫蛍光検出を用いて調査されたが、これはTYLCCNVがMEDホワイトホエ26のPSGを容易に横断しないことを示した。ホワイトフライ中腸におけるTYLCV CPとオートファジーマーカータンパク質ATG8-IIの免疫蛍光共局在化は、オートファジーがホワイトフライ27におけるTYLCVの感染を抑える上で重要な役割を果たしていることを示している。

ここで、TYLCVを例に用いて、免疫蛍光技術によるホワイトフライ中腸、PSG、卵巣におけるベゴモウイルスの局在化に関するプロトコルを説明する。この技術は、一次抗体および色素標識二次抗体による解剖、固定、およびインキュベーションを含む。ホワイトフライ組織中のウイルスタンパク質の位置を示す蛍光シグナルは、共焦点顕微鏡下で検出できます。さらに重要なことに、このプロトコルは、ベゴモウイルスおよびホワイトフライタンパク質を共局化するために使用することができる。さらに、ホワイトフライ中腸、PSG、ヘモリオン、卵巣におけるSYBRグリーンベースのqPCRを用いたTYLCVの定量のプロトコルについて説明し、異なるホワイトフライ組織サンプル中のウイルス量を比較するために使用することができます。

プロトコル

1. ホワイトフライ、ウイルス、植物、ウイルスの獲得

  1. 綿の後部白身フライ(MEAM1)(Gosypiumhirsutum cv.Zhemian 1793)は、14:10の光:暗いサイクルと60±10%の相対湿度で26±1 °Cの温室の防虫ケージに入れた。
  2. ホワイトフライミトコンドリアシトクロムオキシダーゼI遺伝子に基づく従来のPCRを行い、ホワイトフライ集団の純度を決定する。
    1. 20個の成体白いハエを集め、30 μLのリシスバッファー(10 mMトリス、pH = 8.4、50 mM KCl、0.45%[wt/vol]Tween-20、0.2%[wt/vol]ゼラチン、0.45%[vol/vol]ノンイデトP0、60/gL)を含むPCRチューブに個別に移します。
    2. 各 PCR チューブに 5 ~7 個のセラミックビーズ(直径 2 mm)を加え、サンプルを粉砕して組織のリシスを行います。
    3. 65 °Cで1時間、100°Cで10分、遠心分離器を短時間インキュベートします。PCR 増幅のテンプレートとしてこの上清を使用します。
      注:65°Cでのインキュベーション時間は、必要に応じて増加させることができます。
    4. PCR反応を、Taq DNAポリメラーゼの1U、10xバッファーの2μL(Mg 2+)、1.6μLのdNTP混合物(2.5mM)、各プライマーの0.5μL(各プライマー(それぞれ10μM)、2μLのホワイトフライ組織ライセート過多、二重蒸留水を総体積20μLに調製する。フォワードプライマー配列は5'-TTTTTGTCCAGAAGT-3'であり、逆プライマー配列は5'-TAATGGATATTGCATGGA-3'である。
      注:DNAをヌクレアーゼフリー水に置換する陰性コントロールと、以前に検証されたMEAM1ホワイトフライDNAを用いた陽性対照を含める必要があります。
    5. 3分間95°Cでの初回変性、30sの95°Cでの変性の35サイクル、30sの50~55°Cでの焼鈍、72°Cでの1分間の延長、10分間の72°Cの延長を行います。
    6. 制限酵素Taq Iで増幅産物を消化する。そのためには、酵素1μL(1U)、1μLの1μLの1μLの10μL、BSAの1μL、増幅産物5μL、およびダブル蒸留水を総体積10μLに調製します。サーモサイクラーで65°Cで1時間インキュベートします。
    7. 各消化産物の5~7μL、DNAラダー(100~2,000 bp)を1%アガロースゲルのウェルに積み込むことにより、サンプルのアガロースゲル電気泳動を行います。次に、UV光を用いたゲルドキュメンテーション機でゲルレッド染色によりDNAバンドサイズを観察する。消化された製品のバンドサイズを正の対照と比較して、ホワイトフライ集団の純度を決定します。
  3. 農業はTYLCV(GenBank加盟番号AM282874.1)(pBINPLUS-SH2-1.4A)の感染性クローンを3-4真葉段階のトマト植物(ソラナム・リコパーシカムL.cv Hezuo 903)に接種する。
    1. カナマイシン(50 μg/mL)とリパンピシン(50 μg/mL)を単一コロニーで含有するルリア・ベルタニ(LB)培地を10mL接種した。OD600が〜1.5に達するまで200rpmで振とうとともに28°Cでインキュベートする。
    2. 4,000 x gで10分間遠心分離して農生細菌を収穫する。
    3. 200 μMアセトシリンゲ、10 mM 2-(N-モルフォリーノ)エタンスルホン酸(MES)、および10 mM MgCl2からなる10 mLの浸潤バッファーにペレットを再懸濁します。室温(RT)で1〜2時間インキュベートします。
    4. ステップ 1.3.3 の混合物を 1 mL の針なしシリンジで使用して、2 ~3 個の植物葉に浸潤します。温室で26±1 °Cで植物を維持する。
  4. 約1ヶ月後、目視検査を行い、黄色のカール葉とスタント症状を示す植物を選択します。
  5. ウイルスの取得のために48時間のためにTYLCV感染トマト植物に非ウイルスフルホワイトフライの成人を転送します。

2. 中腸の解剖とコレクション, 原発唾液腺 (PSG), 卵巣, 雌白飛びのヘモリフ

  1. 願望を使って白いハエを集め、氷の上に置いて昏睡状態にします。1x PBS(リン酸緩衝生理食塩)バッファーを顕微鏡スライドに加え、ステレオ顕微鏡下で解剖用の1x PBSバッファーにホワイトフライを入れます。
    1. 中腸の解剖のために、ホワイトフライの腹部を切断し、細かい鍼針(直径0.25ミリメートル)を使用して中腸を引き出します。中腸を洗浄するために1x PBSを転送します。
    2. PSG解剖の場合、頭の近くの胸郭のホワイトフライの体を後側から壊します。次に、胸郭に針を挿入してホワイトフライを固定し、2つの唾液腺が体から分離されるまで別の針を使用してホワイトフライを振ります。次に、PSG を 1x PBS のクリーニングに転送します。
    3. 卵巣解剖のために、完全にホワイトフライの腹部を切断し、他の組織から卵巣を分離するために針を使用します。次いで、ピペッティングによって余分な組織を除去する。
    4. 溶溶性リンパ採取では、10 μLの10μLのPBSバッファーを顕微鏡のスライドに加え、その後、バッファにホワイトフライを入れます。このヘモリンフを得るためには、細かい鍼針を用いて腹部に軽く穴を開け、腹部を少し押してヘモリフを緩衝液に放出する。ヘモリフサンプルとして8μLの液体を集める。

3. ホワイトフライ中腸、原発性唾液腺、および卵巣におけるTYLCVの免疫蛍光による局在

注: 中間腸内の TYLCV のローカライズの手順は、例として示されています。この方法は、PSGおよび卵巣に使用することができる。

  1. TBSバッファー(10mMトリス-HCl、150mM塩化ナトリウム、pH=7.5)で中間腸を分化します(ステップ2.2.1で説明したとおり)。15~20個のホワイトフライのミガットを集め、ガラスのペトリ皿(直径3.5cm)に移し、余分なTBSバッファーを取り除きます。
  2. 4%パラホルムアルデヒドの1 mLを加え、室温で2時間の中間腸を固定し、固定液を取り除きます。ピペットは、TBSの中腸3倍をそれぞれ2分間ゆっくりと洗います。
  3. 中腸を0.5%トリトンX-100の1 mLで30分間インキュベートし、透過性化する。次いで、透過性化溶液を取り出し、ステップ3.2で説明したように、TBST(0.05%Tween 20の1x TBS)で中間腸3xを洗浄します。
  4. 1%BSA(TBSTで調製したウシ血清アルブミン)の1mLを加えて中腸を遮断する。RTで2時間のブロッキングステップを実行し、ブロッキング溶液を取り除き、TBSTで中腸3xを洗浄します。
  5. TBST24で1:400で一次抗体(TYLCVコートタンパク質に対するMAb1C4)を希釈し、溶液をペトリ皿に加えて中腸を浸します。暗闇の中で一晩4°Cでインキュベートする。一次抗体溶液を廃棄し、TBSTで3倍洗浄する。
  6. TBSTで2次抗体(抗マウス)を1:400に希釈し、溶液をペトリ皿に加えて中腸を浸します。暗闇の中でRTで2時間の料理をインキュベートします。二次抗体溶液を廃棄し、TBSTで中腸3倍を洗浄する。
  7. 中腸を透明な顕微鏡スライドに移します。できるだけ多くのTBSTをスライドから吸引します。核を染色するためにDAPI(4'、6-ジアミジノ-2-フェニリンドール、ジヒドロクロライド)を1滴加え、カバースリップを配置し、マニキュアでシールします。共焦点顕微鏡で調べる。

4. ホワイトフライ中腸、原発性唾液腺、ヘモリフ、卵巣のQPCRを用いたTYLCVの定量

  1. 上述のように、1x PBS中の白飛中腸、PSG、ヘモリオン、卵巣を解剖する。
  2. 中腸、PSG、ヘモリム、卵巣のDNAを抽出します。
    1. 解剖後、中腸、PSG、卵巣を清潔に洗浄し、1x PBS緩衝液2〜3xを洗浄する。
    2. 1x PBSの5μLで20個の中腸または20個のPSGを集め、25 μL溶解溶液に移します。各卵巣を1x PBSの5μLで移し、25 μL溶解液に個別に移します。
    3. ステップ1.2.2で説明したように、中腸、PSG、および卵巣サンプルを粉砕する。
    4. 1x PBSで8μLの溶化液をPCRチューブに集め、10 μLの溶解溶液を加えます。よく混ぜます。
  3. 1.2.3に記載されているように、すべてのサンプルからDNAを抽出します。
  4. TYLCVと内部制御(β-アクチン遺伝子)に対して2つの独立したqPCRマスターミックス(それぞれ18μL)を準備する:SYBRグリーンミックスの10 μL、各プライマーの0.8μL(それぞれ10μM)、反応ごとに6.4μLの二重蒸留水。TYLCVの場合、前方プライマー配列は5′-GAAGCGAGGCGATA-3′であり、逆プライマー配列は5′-GGACATCAGGGCTCGATA-3′である。βアクチンの場合、フォワードプライマー配列は5′-TCTTCCCCTTTTTTG-3′であり、逆プライマー配列は5′-CGGTGTTTTCTGCATT-3′である。
  5. マスターミックスの18 μLをqPCRストリップチューブまたは96ウェルプレートのバイアルに塗布します。次に、各バイアルに2μLのDNAサンプルを加える。少なくとも3つの技術的複製および3つの生物学的反復ですべての反応を行う。
    注:ステップ4.5は氷上で実行する必要があります。
  6. qPCRチューブを閉じるか、96ウェルプレートを接着プレートシールでシールします。
  7. 遠心分離機は、qPCRチューブまたは96ウェルプレートの底部に液体を収集する。
  8. リアルタイムサーマルサイクラーにチューブまたはプレートを入れ、qPCRを実行します。
    1. qPCRを行うのは、30sの場合は95°C、続いてプライマーアニーリングおよび伸長の場合は34sで95°C、34sでは60°Cの40サイクル、1サイクルは15°Cで95°C、融解曲線ステップ60°C~95°Cで終了します。15s当たり0.5 °Cの増分。
    2. 蛍光色素としてSYBRを選択し、サンプルタイプとして不明です。
  9. 定量データをスプレッドシート形式にエクスポートし、ウイルスDNAの相対量を2−ΔΔCT法28で分析する。

結果

ここでは、B.タバチ複合体とTYLCVのMEAM1ホワイエを例として、手順を説明するために使用しました。本稿に記載されている免疫蛍光およびウイルス定量手順の概要を図1に示す。図2は、PSG、中腸、および卵巣におけるTYLCVおよびDAPI染色の免疫蛍光検出の代表的な結果を示し、TYLCVがPSGおよび中腸においてより多く蓄積し、卵巣に少ないことを示...

ディスカッション

ここでは、免疫蛍光およびqPCRによるホワイトフライベクターの組織におけるベゴモウイルスの局在化および定量化のためのプロトコルについて説明する。解剖は、ホワイトフライ組織におけるウイルスを局所化し、定量化するための最初のステップを表す。ホワイトフライの体は長さが約1mmで、組織が非常に小さく、解剖することが困難であることを意味します。その上、組織間には強いつ...

開示事項

著者たちは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、国家主要研究開発プログラム(助成金番号:2017YFD0200600)、中国農業研究システム(助成金番号:CARS-23-D07)とビル&メリンダ・ゲイツ財団(投資ID OPP1149777)の目印基金によって支援されました。).TYLCV CP抗体を提供してくれたジャンシャン・ウー教授に感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
4% ParaformaldehydeMultiSciencesF0001
4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)Abcamab104139
Bovine Serum Albumin (BSA)MultiSciencesA3828
CFX Connect Real-Time PCR Detection SystemBio-RAD185-5201
Confocal microscopyZeissLSM800
Dylight 549-goat anti-mouseEarthoxE032310-02Secondary antibody
Monoclonal antibody (MAb 1C4)Primary antibody
Phosphate Buffered Saline (PBS)Sangon BiotechB548119-0500
Stereo microscopeZeissStemi 2000-C
TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus)TaKaRaRR820AqPCR master mix
ThermocyclerThermofisherA41182
TissuelyzerShaghai jingxinTissuelyser-48
Triton-X-100BBI life sciences9002-93-1
Tween 20BBI life sciences9005-64-5

参考文献

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