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要約

このレポートでは、視覚GPCR、ロドプシン、およびmini-G oを用いた複合体を調製するための異なる洗剤のスクリーニングについて説明します。精製中の異なる段階での複合体の品質を特徴付け生化学的方法が実証されている。このプロトコルは、将来の構造研究のために他の膜タンパク質複合体に一般化することができる。

要約

膜蛋白質複合体の結晶構造を決定する鍵は、結晶化前の試料の品質です。特に、洗浄剤の選択は、複合体の安定性および単分散性の両方に影響を及ぼすため、極めて重要である。我々は最近、3.1 Å分解能で、操作されたGタンパク質mini-Goに結合したウシロドプシンの活性状態の結晶構造を決定した。ここでは、ロドプシン-mini-G複合体の調製を最適化する手順を詳しく説明します。暗黒状態のロドプシンは、古典的およびネオペンチルグリコール(NPG)洗剤で調製し、続いて光暴露下でmini-Goとの複合体形成を行った。ロドプシンの安定性は、光感受性リガンド、9-シスレチのロドプシンへの再構成を監視する紫外線可視(UV-VIS)分光法によって評価された。自動サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)は、ロドプシンとロドプシン-mini-G複合体の単分散性を特徴付けるために使用されました。SDS-ポリアクリルアミド電気泳動(SDS-PAGE)は、クーマシーブルーでゲルを染色した後、ロドプシンとミニGoの間に1:1モル比を同定することにより、複合体の形成を確認した。この分析データをすべて相互検証した後、不適当な洗剤を排除し、大規模な調製と結晶化のための最良の候補洗剤を継続しました。N-グリコシル化の不均一性から、さらに問題が生じた。異種発現ロドプシンは、SDS-PAGEで2つの異なるN-グリコシル化集団を有することが観察され、これはおそらく結晶発生を妨げているであろう。そこで、異なる脱グリコシル化酵素を試験し、N-グリコシル化の単一種を有するロドプシンを産生したE1(EndoF1)との異なる分解酵素を試験した。タンパク質の品質を特性化するためのこの戦略的パイプラインにより、ロドプシン-mini-Go複合体の調製は、結晶構造を提供するために最適化されました。これは、GPCR-Gタンパク質シグナル伝達複合体の3番目の結晶構造に過ぎなかった。このアプローチは、他の膜タンパク質およびその複合体に対して一般化して、サンプル調製および構造決定を容易にすることができる。

概要

膜タンパク質の結晶構造とその複合体の決定は、十分に拡散する結晶を得ることが困難であるため、常に困難でした。可溶性タンパク質とは対照的に、一体性膜タンパク質は、細胞膜に及ぶ疎水性コアを含む。細胞膜から水溶液バッファーに膜タンパク質を除去するために、洗剤を使用して洗浄剤-タンパク質ミセルを形成し、膜タンパク質の疎水性コアの周りの脂質を置き換える必要があります。膜タンパク質の安定性、活性および完全性は、洗剤1の化学的および構造的特性に直接依存し、洗浄剤の特性もミセルの大きさを決定する。大きな洗剤ミセルは、小さな膜タンパク質の親水性表面を閉塞させ、蒸気拡散法を用いた場合の結晶接触の欠如による結晶化を防止する。小さな洗剤ミセルは結晶学に有利であるが、短鎖洗剤は通常より厳しいので、膜タンパク質の不安定化および凝集をもたらす。したがって、結晶化の前に、追加の洗剤スクリーニング手順が不可欠であり、典型的には、タンパク質の安定性を維持する短い洗剤を標的とする。

Gタンパク質共役受容体(GPCRs)は、7つの膜貫通a-ヘリックスを含む一体性膜タンパク質である。GPDRは、逆アゴニストまたはアンタゴニストによって安定化された不活性状態、またはアゴニストに結合し、Gタンパク質によって安定化された活性状態の2つの主要な状態に存在するが、これら2つの極端な間に多数のサブ状態が存在する可能性が高い。GPCRsの構造決定は、当初、活動状態よりも高い安定性のために逆アゴニストおよびアンタゴニストに結合された非活動状態に焦点を当てた2.GPDRがアゴニスト結合時に活性化されると、受容体は非常に動的であり、裂け目はGタンパク質結合のための受容体の細胞質面上で一過性に形成される。このダイナミズムは、アゴニスト結合型GPCRsが非アクティブ状態よりもしばしば不安定である理由であると考えられている。したがって、研究中の受容体の立体構造状態に適した洗剤をスクリーニングすることが不可欠となり、非活動状態に比べて活性状態を研究するためには、穏やかな洗剤が必要となる可能性が高いからである。

本報告では、視覚GPCR、ウシロドプシン3、およびミニGoタンパク質44、55との複合体をそれぞれ非活性状態と活性状態を表す洗剤スクリーニング実験に用いる。この界面活性剤スクリーニングは、古典的なアルキルマルトシドおよびグルコシド洗浄剤およびネオペンチルグリコール(NPG)洗浄剤に焦点を当てた。この文脈では、古典的な洗剤は糖頭グループとアルキル鎖から構築され、NPG型洗剤は糖とアルキル鎖66、7、87,の界面で4次炭素によって融合された2つの同一の古典的な洗剤を含んでいる。

実験ワークフローは、異なる洗剤中のロドプシンの精製から始まり、続いてロドプシン-mini-G複合体の形成とo、いくつかの方法を用いた複合体の特性化で終わる(図1)。ロドプシンの不活性状態に関しては、光感受性リガンド9-シスレチの再構成を紫外線可視(UV-VIS)分光法によってモニタリングした。スペクトルは、レチナルの物理化学的状態を明らかにし、ロドプシンのレチナル結合ポケット内のその環境を示しています。サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)は、精製ロドプシンの単分散性とロドプシン-mini-Go複合体の形成を評価するために採用された。SECはタンパク質分子の大きさと形状を区別するため、凝集したタンパク質集団は、空隙体積に溶出して同定することができます。複雑な形成を確認するために、SECからの分画を、ドドプシンとミニGoの両方の存在を確認するために、ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって評価した。

考慮する必要があるもう一つの要因は、膜タンパク質の翻訳後修飾(PTM)です。N-グリコシル化などのPTMは、哺乳類および昆虫細胞発現系で産生される真核細胞膜タンパク質にしばしば観察される。ヒト胚性腎臓293(HEK293)細胞の限定N-グリコシル化株は、N-アセチルグルコサミン転移酵素I(GnTI)をコードする遺伝子の欠失によって開発され、コンセンサス部位Asn-X-Ser/ThrにおいてGlcNAc2Man5による均質なN-グリコシル化を生じた。25N-グリコシル化は、コンセンサス部位でアミノ酸残基を変異させることによって防止できるが、これはまた、タンパク質の機能または折りたたみの効率を変える可能性がある。ウシロドプシンにおいて、N-グリコシル化残基Asn15の変異は、誤った折りたたみとGタンパク質活性化9,1010を減少させる。本報告で用いたロドプシンは、HEK 293 GnTI欠損細胞株で表した。しかし、SDS-PAGEは2種のロドプシンの存在を示した。この不均一性は結晶形成を防ぐことができ、従ってペプチドN-グリコシダーゼF(PNGasee F)およびエンドグリコシダーゼF1(Endo F1)を用いた脱グリコシル化が試験された。脱糖物は、糖質のレベルとその均質性を同定するために、SDS-PAGEと液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)によって特徴付けられていた。

プロトコル

注:この洗剤スクリーニングのプロトコルは、出発材料としてHEK293細胞ペレットの30 gについて詳述されています。

1. 材料、化学薬品、試薬

注:すべてのソリューションは、25°Cで18.2 MΩ∙cmの抵抗に達するために脱イオン水から精製された分析グレード試薬と超純水を使用して調製されます。

  1. バッファストックソリューション
    1. 10倍のリン酸緩衝生理食塩分(10x PBS)を準備します。
    2. HEPESバッファーを準備する:1 M、NaOHでpH 7.5に滴定する。
    3. 5 M NaClを準備します。
    4. 2 M MgCl2を準備します。
      注:すべてのストックソリューションは、無菌性を維持するために0.22 μmフィルタを通過します。
  2. 洗剤ストックソリューション
    1. ドデシルマルトシド(DDM)、10%(w/ v)を準備します。
    2. デシルマルトシド(DM)、10%(w / v)を準備します。
    3. 6-シクロヘキシルヘキシルマルトシド(Cymal-6)、10%(w/v)を調製します。
    4. 5-シクロヘキシル-ペンチルマルトシド(Cymal-5)、10%(w/v)を調製します。
    5. ノニルグルコシド(C9G)、10%(w/v)を調製する。
    6. ラウリルマルトースネオペンチルグリコール(LMNG)、5%(w/v)を準備します。
    7. デシルマルトースネオペンチルグリコール(DMNG)、10%(w / v)を準備します。
    8. シマル6ネオペンチルグリコール(C6NG)、10%(w /v)を準備します。
    9. シマル-5ネオペンチルグリコール(C5NG)、10%(w /v)を準備します。
    10. オクチルグルコースネオペンチルグリコール(OGNG)、10%(w / v)を準備します。
      注:10%の洗剤ストック液の場合は、1gの洗剤粉末を超純水に緩やかな揺れで溶かし、最終量を10mLに調整します。洗浄剤のストック溶液は、長時間保存時および作業中の氷上で-20 °Cに保つ必要があります。
      注意:ボトル洗剤は、通常、-20°Cの冷凍庫に保管することをお勧めします。洗剤粉末を含むボトルは、開封前に室温まで温める必要があります。洗剤粉末は吸湿性であるため、温度平衡化は、洗剤を濡らす結露の形成を防止します。
  3. その他の化学薬品・試薬
    1. 1D4免疫親和性アガロース樹脂を調製:50%スラリーの10mL。
      注:1D4免疫親和性アガロースは、ペプチドとしてウシロドプシンTETSQVAPAの最後の9アミノ酸を結合するモノクローナルRho1D4抗体と結合したアガロースビーズです。1D4免疫親和性アガロースは、C末端1D4配列を含むタンパク質を捕捉するためのアフィニティー精製材料として機能します。この精製材料は、9、11、11または購入して調製することができる。9
    2. 9-シスのレチ溶液を調製:1 mM、100%エタノールに溶解する。
      注:準備および貯蔵の間に、光がレティナルにさらされるのを防ぎます。
    3. 1D4ペプチド(配列TETSQVAPA)を調製する:800 μM、水に溶解。
  4. バッファー
    注:すべてのバッファーは、ストック溶液から所望の濃度に混合されます。すべてのバッファーは、使用前に4°Cに冷却されます。
    1. バッファ A を準備する: PBS, 0.04% DDM.
    2. バッファBを準備する:20 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl、0.04%DDM。
    3. バッファCを準備する:20 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl、および洗剤を表1に記載されているそれらの作業濃度で。
    4. バッファDを準備する:20 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl。
    5. 溶出バッファーを準備する: 20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 80 μM 1D4 ペプチド, その作業濃度で洗剤.
    6. SECバッファを準備する:20 mMヘペスpH 7.5、150 mM NaCl、0.025%DDM;0.22 μm フィルターを通して濾取される。
  5. LC-MS用溶剤
    1. 溶媒Aを調製:0.1%のギ酸を含有するアセトニトリル。
    2. 溶媒Bを調製:0.1%のギ酸を含む超純水。
    3. 溶媒C:イソプロパノールを調製する。

2. 細胞膜可溶化とタンパク質抽出

  1. HEK293 GnTIの30gの解凍-ウシロドプシン変異体N2C/M257Y/D282C3を3発現する細胞ペレット、9を室温に、ダオンホモジナイザーまたは電気ホモジナイザー(13,000rpm)を使用してプロテアーゼ阻害剤カクテルおよびホモジナイズを含む1x PBSバッファーの120 mLを加える。均質化された細胞懸濁液をビーカーに集め、音量を150 mLに調整します。
    注:細胞ペレットの30 gは、2 x 106細胞/mL密度での細胞培養の3 Lに相当します。
  2. 均質化した細胞に10%のDDMを加え、最終濃度1.25%を与えます。氷の上で1時間かき混ぜます。
  3. 4°Cで細胞溶解物を遠心分離し、45分間150,000xgで、不溶化した破片を除去する。 g
  4. 上清を500mLボトルに移し、1D4免疫親和性アガロース樹脂(50%スラリー)を10 mL加えます。可溶化した細胞溶解物と樹脂を4時間または4°Cで一晩穏やかに混ぜます。
  5. 溶出/樹脂混合物を開いたカラムに積み込んで樹脂を回収します。
  6. 洗浄バッファーAの10カラム体積(CV)で樹脂を洗浄します。
    注:列のボリュームは、パックされたボリューム(100%)アガロース樹脂を使用。この場合、1 CVは5mLです。
  7. バッファAの2CVで樹脂を再懸濁します。
    注意: ステップ 2.8 以降、薄暗い赤色光条件下で実行する必要があるステップは、説明の冒頭に「[Dark]」と表示されます。
  8. [暗い]再懸濁樹脂に9-シスのレチナルを加えて、50μMの最終濃度にします。暗闇の中で4〜16時間、4°Cで軽く混ぜます。
    注意:潜伏時間が短い場合、レティナルの再構成が不完全になる可能性があります。
  9. [暗い]列からフロースルーを削除します。20 CVバッファAで樹脂を洗浄し、続いて15個のCVバッファBを洗浄します。
  10. [暗い]2 CVバッファBで樹脂を再懸濁し、その後、樹脂懸濁液を10個の10mL廃棄カラムに均等に分割する。
  11. [暗い]カラムから流れを取り除き、1 mLバッファーCで樹脂を再懸濁し、4°Cで1時間インキュベートします。
  12. [暗い]ステップ 2.11 を繰り返します。
  13. [暗い]カラムから流れを取り除き、各カラムの0.8 mL溶出バッファーで樹脂を再懸濁します。2時間とやさしく混ぜます。
  14. [暗い]2 mLチューブにカラムからの溶出を収集します。
  15. [暗い]各カラムの溶出バッファーの0.7 mLで樹脂を再懸濁します。1時間はやさしく混ぜます。
  16. [暗い]同じチューブにカラムからの溶出を収集します。

3. UV-VIS分光法

  1. 分光光度計を250~650 nmの測定範囲に対応できるように準備します。水または溶出バッファーを使用してベースラインを記録します。
  2. [暗い]溶出したタンパク質をクォーツキュベットにロードします。タンパク質サンプルのスペクトルを測定します。
  3. [暗い]495 nmのロングパスフィルターを通過した光で、キュベット内でタンパク質を2分間直接照らします。
  4. 照らされたサンプルのスペクトルを測定します。
  5. 他の9つの洗剤で精製されたすべてのタンパク質サンプルに対して同じ測定を行います( 暗い状態と照らされた状態の両方)。
  6. X-Y 散布図で曲線(吸光度対波長)をプロットします。

4. ロドプシンとロドプシン-mini-G複合体の自動サイズ排除クロマトグラフィー

  1. [暗い]分子量カットオフ(MWCO)を4°Cで30kDaとしたスピン濃縮器を用いて遠心分離によりタンパク質を100μLに濃縮する。濃縮されたサンプルは、濃縮器またはバッファーCからの流れを使用して希釈することができる。タンパク質サンプル濃度を測定するには、分光光度計を用いて280nmで吸光度を測定します。
    注: ステップ 4.2 以降では、実験は暗い環境を必要としないため、サンプルは通常の光の下で準備できます。
  2. 各洗剤の状態に対して0.7mg/mLで100μLのロドプシンを調製します。
  3. 各洗剤条件に対して100μLのロドプシン(0.7 mg/mL)とミニGo4、12(0.2mg/mL)混合物を調製します。o4,121 mM MgCl 2 で混合物を補います。495 nmのロングパスフィルターからの光で混合物を照らし、30分間インキュベート。
  4. 液体クロマトグラフィー精製器に球状タンパク質の分画範囲10~600kDaの24 mLゲル濾過カラムを取り付けます。SEC バッファでカラムを平衡化しました。
    メモ:液体クロマトグラフィー精製器には、オートサンプラー、複数波長検出器、および分画コレクターが装備されています。
  5. オートサンプラーバイアルにサンプルを移し、サンプルトレイに入れます。各サンプルに対して連続的なSEC実行を自動化するメソッドファイルをプログラムし、オートサンプラーはサンプルの77 μLをカラムにロードし、浄化器は1回のランで0.5 mL/minの流量でSECバッファの24 mLを溶出させます。280 nm および 380 nm で吸光度を記録します。
  6. ロドプシンとロドプシン-ミニG複合体のピーク画分を12.9 mLの保持体積で収集します。
  7. ステップ4.2の左ロドプシンサンプルと、4-12%SDS変性勾配ゲルのロドプシン-mini-Go複合体のピーク画分をクマシーブルー染色で分析します。
  8. 溶出クロマトグラム(A280またはA380対保持量)をプロットします。

5. 脱糖分解とLC-MSの研究

  1. LC-MSの研究では、LMNG洗剤で精製されたロドプシンサンプルのみを使用してください。
  2. 1 mg/mL で 200 μL のロドプシンと 0.01 mg/mL の PNGase F13を調製します。よく混ぜて、一晩4°Cでインキュベートします。
  3. 1 mg/mL で 200 μL のロドプシンと 0.01 mg/mL の遠気中F1 13を調製します。よく混ぜて、一晩4°Cでインキュベートします。
  4. SDS-PAGEとクマシーブルー染色による消化結果を分析します。
  5. 濃縮非治療およびEndo F1処理ロドプシンサンプルとバッファーDでSEC精製を受ける。
    注: LC-MS の試験用に、少量の洗剤でサンプルを準備します。緩衝剤Dは、任意の洗剤を含まないが、膜タンパク質14からのLMNGの遅い速度のために、ロドプシンは凝集しないであろう。
  6. 12.9 mLの周囲の保持体積でピーク分率を収集します。スピンコンセントレータ(MWCO 30 kDa)を使用して1mg/mLに濃縮します。
  7. タンパク質10μgをReprosil 200 C18-AQカラムに注入し、表2に記載されている溶媒組成および設定で線形勾配法を使用してカラムを溶出する。流れは質量分析計の場合は25%、UV検出では75%に分割されます。

結果

サンプルの調製と分析の実験ワークフローを図 1にまとめます。オープンカラムを使用して小規模な親和性精製を行い、多くの異なる洗剤条件で同時にサンプルを調製することができました(図1A)。このような小規模な精製セットアップにより、UV-VIS分光法、SECおよびSDS-PAGEを用いたさらなる分析に十分なタンパク質が得られた(図1B-C)。

UV-VIS分光法はロドプシンの安定性を明らかにした
レチナル再構成ロドプシンの安定性は、その光吸光度によって評価した(図2)。暗い状態では、9-シスのレチナルは、原生シフ基地としてLys296に共有結合されている。照明後、9-シスのレチは全トランスアイソフォームに異性化され、シフベースリンクはデプロトン化される。プロトン化された9-シスのレチは488nmで吸収ピークを与え、脱プロトン化された全トランスレチナルは380nmでピークを有する。DDMにおけるロドプシンのUV-VISスペクトルは、9-シスのレチ結合および光活性化ロドプシンの典型的な吸収を示し、そこでほぼ同じ光学密度を有する108nmの青色シフトが明確に観察された(図2A、左上パネル)。ロドプシンが不安定化すると、次に、レチナル変化のための結合ポケットが、その後、レチナル脱プロトネーションおよび解離をもたらす。これが起こった場合、スペクトルは、脱プロトネーションからの貢献だけでなく、retinal15の自由な形態を示しています。そこで、タンパク質(280nm)とレチナル(プロトン化9-シスレチナールの場合は488nm、脱プロトン化全トランスレチナルの場合は380nm)との間の吸光率により、ロドプシンへのレチナル再構成の効率を決定した(図2B)。従来の洗剤で精製されたロドプシンサンプル(DDM、DM、Cymal-6、Cymal-5、C9G)は、同じ光学プロファイルを示す。しかし、NPG洗剤(LMNG、DMNG、Cymal-6NG、Cymal-5NG)で精製されたサンプルは、DDMサンプルと同じ光学プロファイルを与えたOGNG試料を除く、不最適な結束環境を示唆する光学プロファイルを示す。

サイズ排除クロマトグラフィーは、サンプル純度およびタンパク質単分散性を示した。
SECは、調製およびスクリーニング中にタンパク質サンプルを評価するための効率的で堅牢な分析ツールです。これは、前の精製段階からのサンプル純度とタンパク質分子の単分散性を検証します。ロドプシン及びそのmini-Go複合体については、試料の品質を280nmおよび380nmの吸収曲線から解釈した(図3A)。280nmの痕跡はタンパク質の存在を示し、380nmのトレースは、レチンの存在を示した。空隙容量に現れるシグナル(このカラムを使用すると約8mL)は、タンパク質凝集体に起因していた。したがって、古典的な洗剤で調製されたサンプルは、凝集体の一部が現れたC9Gを除いて単分散状態であることを示した。これに対し、NPGタイプの洗剤を用いて調製したサンプルには、C9Gサンプルよりもはるかに多くの凝集体が含まれていた。LMNGおよびCymal-6NGは最も凝集体形成につながったが、DMNGおよびCymal-5NGでは少ない凝集物が観察された。例外は OGNG で、DDM と同様のプロファイルを示しました。空隙体積で溶出するタンパク質凝集体も、135kDaに相当する約12.9mLの保持体積でピークに比べて増加していたA280/A380比で示されるように、レチナール占有率も低かった。280もう一つ、ロドプシンとロドプシン-mini-Goが同じ保持量を中心に溶出したのも、もう一つの特徴を見た(図3B)。洗剤結合ロドプシンの見かけの分子量は120kDaであり、ロドプシン-mini-G-o 144 kDaの分子量は驚くべきことではない。したがって、SECデータから複雑な形成を確認することはできなかったため、Sec精製サンプルをさらに分析するためにSDS-PAGEを使用しました。

SDS-PAGEが複雑な形成を確認
SDS-PAGEは、サンプル中のタンパク質成分を同定するための標準的な方法です。濃縮ロドプシン(SEC精製前)をSDS-PAGEで分析して純度を確認し、37kDa付近の2つのバンドと50kDa以上のスミアバンドを示した(図4A)。下の2つのバンドは、後に異なるN-グリコシル化状態を有することが確認された。50kDa以上のバンドは、SECまたは他のいずれの検出方法でもこれらの凝集体が観察されなかったため、SDS-PAGEサンプルバッファーによって誘導された凝集ロドプシンオリゴマーと解釈された。SECのデータでは複雑な形成を確認できなかったため、SECはロドプシン-ミニGoサンプルから分画を溶出し、SDS-PAGEを用いて分析した。SDS-PAGEは、すべての洗剤条件においてロドプシンとミニGoの両方のタンパク質バンドを示し、洗浄剤の選択に関係なく複合体が形成されたことを示唆した(図4B)。

LC-MS分光法は、ロドプシンにおけるN-グリコシル化パターンを同定した
アフィニティ精製とSECの両方からのロドプシンサンプルは、24mLカラムを使用する場合にSECによって分離することができなかったSDS-PAGEゲル上の約37 kDaの見かけの分子量で移動した2つのタンパク質バンドを示した。HEK 293 GnTI由来の異種発現ロドプシン上のN-グリコシル化の異なるパターンが最も可能性の高い説明であった。そこで、2つの酵素、PNGase FおよびEndo F1は、ロドプシンを脱グリコシル化する能力について試験した。SDS-PAGEのデータから、遠東F1は両方のタンパク質バンドの分子量を単一の製品に減らし、PNGase F消化は依然として2つの集団を与えた(図5A)。未消化およびEndo F1処理サンプルをLC-MS分析を用いて分析し、異なる種の質量を同定した。データは、HEK 293 GnTIで産生されたロドプシンが1つまたは2つのNグリカンを含み、1014±1 Da. Endo F1処理ロドプシンはN-グリカンを含みなく、2027±1 Daの質量差を有することを示した。これらの結果は、ロドプシンを発現させるために使用される細胞株中の酵素N-アセチルグルコサミン性転移酵素Iの存在と一致し、これはGlcNAc2Man5、(質量1014 Da)の構造を有するすべてのN-グリカンをもたらす。2

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図1:洗剤スクリーニング実験のサンプル調製と特性評価(A)精製中の異なる洗剤中のロドプシンサンプルの調製(B) プロトコルで使用される方法: UV-VIS分光法、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、SDS-PAGEおよび液体クロマトグラフィー質量分析法(LC-MS)。(C) ロドプシン、ロドプシン-mini-Go、およびロドプシンの脱グリコシル化産物の特性評価のための実験的ワークフロー。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-4328
図2:ロドプシンのUV-VIS分光法(ロドプシンの UV-VIS スペクトル)暗黒状態の9-シス・レチ結合ロドプシンのスペクトルは、青色の曲線で示されている。照射後、9-シスのレチナルは脱プロトン化され、異性体は全トランスレチナルに、照らされたロドプシンのスペクトルは赤い曲線として示される。各洗剤の化学構造は、差し込みとして示されています。(B)A280/A488(青い棒)とA280/A380(赤いバー)の比率は、それぞれ暗い状態と明るい状態でのロドプシンの安定性を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-4934
図3:ロドプシンとロドプシンのサイズ排除クロマトグラフィープロファイル-10種類の洗剤で精製されたミニGo複合体。 A右パネルは、NPG型洗剤で精製されたサンプルのSECプロファイルを表します。標準マーカータンパク質のプロファイルは、DDMサンプルと共にオーバーレイとして示されます。ピークプロファイルの解釈はDMNGのために示され、DDM、DM、Cymal-6、Cymal-5およびOGNGに対して見られる理想的なシナリオ(凝集なし)が見られる。(B)12〜14 mLの保持体積におけるOGNGサンプルの拡大プロファイル。すべてのサンプルを、Superdex200昇給10/300 GLカラムを用いて分析した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-5609
図4:ロドプシンとロドプシン/ミニゴー複合体のSDS-PAGE分析(A)洗剤で精製されたロドプシンサンプル。50kDaを超えるスミアバンドは、SDS-PAGEサンプルバッファーによって誘導される凝集ロドプシンオリゴマーに起因する。(B) ロドプシン/ミニゴー複合体のSEC精製サンプル。1と2のN-グリカンとミニGoを持つロドプシンが描かれています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-6119
図5:ロドプシンにおけるグリコシル化の同定(A)PNGase FおよびEndo F1を用いた脱糖性ロドプシンのSDS-PAGE分析(B) ロドプシンのLC-MSスペクトル(上パネル)を含まず、Endo F1(下パネル)による脱グリコシル化を有する。結晶化のためのロドプシン-ミニGo複合体を調製するために、遠東F1が1種のロドプシンを送達したため、PNGase Fよりも遠東F1を選びました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

洗剤作業濃度 (%)クリティカルミセル濃度(%)
Ddm0.0250.0087
Dm0.120.087
シマル-60.050.028
シマル-50.20.12
C9G0.50.2
LMNG0.010.001
DMNG0.010.0034
シマル-6NG0.015使用できません。0.056 より低くする必要があります
キマル-5NG0.020.0056
OGNG0.150.058

表1:バッファC洗剤濃度。

時間 (分)溶剤A (%)ソルベントB (%)溶剤C(%)流量(ml/分)
009550.5
109550.5
5207550.6
25851050.6
2690550.6
3090550.6

表2:カラム溶出パラメータ

ディスカッション

タンパク質の結晶化の成功は、タンパク質サンプル、特に洗剤による合併症による膜タンパク質とその複合体に強く依存しています。本レポートでは、GPCR-mini-Gタンパク質シグナル伝達複合体のサンプル品質の洗剤スクリーニングと評価を行う。膜蛋白質の生化学的性質を研究するために幅広く用いられている様々な方法が、例えば、蛍光色素16、17を用いた熱安定性アッセイ、17トリプトファン蛍光シグナル18の変化を測定して複合体形成を検出する結合アッセイ、またはバイオセンサ19による共鳴エネルギー伝達を測定する。19しかし、これらの方法で使用される化学環境は、結晶化試料を調製するための環境とは全く異なり、タンパク質は蛍光ベースの測定のために1000倍低い濃度にあるか、またはタンパク質が脂質二重層または1つの固定洗剤状態に埋め込まれている。このプロトコルでは、結晶化前の大規模なサンプル調製法でも使用法が標準化されている。したがって、最適化されたパラメータは、さらなる主要なスクリーニングおよび最適化なしに結晶化スケール調製のために容易に移すことができる。

このプロトコルの目的は、X線結晶学による蒸気拡散結晶化と構造決定のための安定した均質なGPCR-mini-Gタンパク質複合体の調製を最適化することです。このプロトコルは、ロドプシン-mini-Go複合体の調製中に、洗剤と脱糖剤の影響を定性的に評価するための一連の方法を統合しています。トランスデュシンペプチドの有無にかかわらず結合した不活性状態および光活性化状態でのロドプシンは、オクチルグルコシド(C8G)20、21、22,21および22C9G23、24の洗剤で精製された23,24際に結晶化されている。20C8GとC9Gで精製されたロドプシン-ミニGo複合体は結晶を生み出さなかったので(データは示さない)、我々は説明した戦略を用いて他の洗剤のより広い範囲を探求した(図1)。ロドプシンの光感度を利用することで、280nm以外の波長でのレチナルの再構成に非常によく従うことができました。UV-VIS分光法とSECの両方で、380 nmまたは488nmのいずれかでレチンを検出しました。しかし、ほとんどの膜タンパク質は、精製中の機能性に従うような便利な発膜を有していない。他の選択肢は、光検出可能な色素色素を添加することによって、または放射性リガンド結合および熱シフトアッセイ25を用いて、リガンドを検出可能にすることであろう。

ロドプシンは40kDaの分子量を有する。洗浄剤の質量のためにそれが結合し、SEC上のその見かけの分子量は約120 kDaである。したがって、120 kDaと144 kDaの見かけの質量を有するタンパク質の分化を必要とするため、SEC上でmini-Go(24 kDa)の結合が容易に検出されなかったことは驚くべきことではありません。SDS-PAGEによるSEC画分の分析は、サンプルの純度および複雑な形成を確認するために使用された。SECプロファイルが複雑な形成時に明確なシフトを示したとしても、SDS-PAGE分析を行い、他の共精製タンパク質汚染物質ではなく、正しい結合パートナーとの複合体形成を確認することが推奨されます。

ロドプシンとミニGoの両方をミリグラム量で精製し、SEC中のUV-VIS吸収およびSDS-PAGEゲルのコンマシーブルー染色などの複合体の低感度検出を使用することを可能にした。サンプルが限られている場合、タンパク質からのトリプトファン信号(280 nm励起、350nmの放出)およびSDS-PAGEゲルの銀染色を追跡するために蛍光検出器を装備したLC浄化器など、より敏感な検出を使用する必要があります。もう1つのアプローチは、緑色蛍光タンパク質(GFP)などの蛍光タンパク質を目的のタンパク質に融合させることであり、タンパク質発現26中でも検出を可能にするが、結晶化する前に除去する必要がある。

精製されたタンパク質が可変PTMから生じる不均一性も含まないことを保証することが不可欠です。ここで説明した場合、SDS-PAGEゲル上で観察されたロドプシンの2つの集団は、1つまたは2つのN-グリカンのいずれかを有すると特徴付けられていた。タンパク質の可変的な修飾は、潜在的によく拡散性の結晶の形成を妨げるので、我々は脱グリコシル化ロドプシンを。このEndoグリコリシダーゼのEndo F1は、試験した最も効果の高い末グリコシダーゼであり、治療は単一種の無糖化受容体につながり、PNGase Fはロドプシン上のグリカンを部分的に除去し、ロドプシンの混合物を完全に無糖化または1つのN-グリカンで残した。脱糖酵素処理を行わないロドプシンは33、27、28、27,28およびロドプシンAsn15上のN-グリカンを結晶化することは、これらの場合に結晶接触を形成するために重要である。ロドプシン-ミニGoの場合、結晶を得るためには、Endo F1によるN-グリカンを除去する必要があります。結晶化前に目的のタンパク質を脱糖する規則は標準化されていませんが、タンパク質が広範な結晶化試験の後に結晶化に失敗した場合は、異種のPTMの除去を考慮する必要があります。

ここで説明したデータと方法論は、小さなミセルサイズと複合体を安定化させる能力により、ロドプシン-mini-G複合体の結晶化に最も好ましい洗浄剤としてOGNGを選択するよう導いた。また、精製ロドプシンが均質な種であることを確認するために、Endo F1を使用しました。その後結晶が得られ、その結晶構造は、GPCR-Gタンパク質シグナル伝達複合体14,2929の3番目の結晶構造である~3.1Å4と決定した。4

パートナータンパク質の有無にかかわらず結合する膜タンパク質の場合、それらは2つの異なるタンパク質と見なされるべきです。異なる機能状態のタンパク質は、異なる立体構造を有し、異なるエネルギーレベルにある。したがって、非アクティブ状態のパラメータとして機能状態ごとに準備プロトコルを最適化することが推奨され、アクティブ状態に完全に移行できない場合がある。また、パートナータンパク質と結合することで複雑なタンパク質特性の変化は言うまでもない。このプロトコルは、結晶化サンプルを調製するために標準化された方法を使用して、異なる洗剤で不活性膜タンパク質を調製し、続いてタンパク質活性化と複雑な形成を行い、タンパク質の品質を特徴付けます。したがって、このプロトコルは、他の膜タンパク質およびその複合体に容易に一般化して、軽微な改変を伴う構造研究を行うことができる。

開示事項

CGTは、Soseiヘプタレスの科学諮問委員会のコンサルタント兼メンバーです。他のすべての著者は開示するものは何もありません。

謝辞

ゲブハルト・F・X・シャートラー教授の長期的な支援、ロジャー・J・P・ドーソン博士、ホフマン・ラ・ロシュ教授の細胞培養支援に感謝します。この研究は、スイス国立科学財団(GFXSへの助成金210030_153145と310030B_173335)、欧州研究評議会(EMPSI、339995)および医学研究評議会(MRC U105197215)からのCGTへの資金提供によって後援されました。FPは、国立研究分子超高速科学技術能力センター(NCCR MUST)およびETHフェムト秒・アト秒科学技術(ETH FAST)プログラムを通じてETHチューリッヒを認めています。FP、JM、AB、CJTは、ポール・シェラー研究所からの長期的な財政支援を認めています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1D4 peptidePeptide2.0Under request
9-cis retinalSigma-AldrichR5754
Autosampler A-900GE HealthcareDiscontinued
C9GAnatraceN324
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor coctailRoche5056489001
Cymal-5AnatraceC325
Cymal-5NGAnatraceNG325
Cymal-6AnatraceC326
Cymal-6NGAnatraceNG326
DDMAnatraceD310
DMAnatraceD322
DMNGAnatraceNG322
Econo columnBio-Rad7372512
Ettan LCGE HealthcareDiscontinued
FRAC-950GE HealthcareDiscontinued
HPLC Water 2795 Separation ModuleWaters AG720000358EN
InstantBlue Protein StainExpedeonISB1L
LCT Premier mass spectrometer (ESI-TOF)Waters AG-
LMNGAnatraceNG310
Monitor UV-900GE Healthcare18110835
Nanodrop 1000Witec AG/ThermoFisherDiscontinued
NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm, 15 wellThermoFisherNP0323BOX
NuPAGE MES SDS buffer (20x)ThermoFisherNP0002
OGNGAnatraceNG311
PAGEr Minigel ChamberLonza59905
Reprosil 200 C18-AQ columnMorvay Analytik GmbH#s1503
Superdex 200 Increase GL columnGE Healthcare28990944
Tabletop centrifuge 5424REppendorf5404000413
Ultracentrifuge Optima XE-100Beckmann CoulterA94516
ULTRA-TURRAX T25IKA WERKE0003725003
UV-VIS spectrophotometerShimadzuUV-2401PC
Waters 2487 Dual λ Absorbance DetectorWaters AG-

参考文献

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