腸透過性と上皮細胞流れ性能を評価する生体内顕微鏡ベースのアプローチ

要約

生体内顕微鏡を利用して、ここで提示される方法は、生きている動物の腸上皮細胞脱落のリアルタイム視覚化を可能にする。従って、麻酔化マウスの局所染色された腸粘膜(アクリフラビン及びローダミンB-デキストラン)は、共焦点顕微鏡を用いて単細胞分解能まで画像化される。

要約

共焦点イメージングを用いた腸内顕微鏡検査により、生きている動物における上皮細胞脱落やバリア漏れのリアルタイム観察が可能です。したがって、麻酔化マウスの腸管粘膜は、非特異的染色(アクリフラビン)および蛍光トレーサー(rhodamine-Bデキストラン)で局所染色され、生理食い溶液リンスプレートに取り付けられ、共焦点顕微鏡を用いて直接画像化される。この技術は、経口投与トレーサーの経粘膜通過のような腸透過性の漏れを同定する他の非侵襲的な技術を補完することができる。この他に、ここで紹介するアプローチでは、リアルタイムで細胞脱落イベントを直接観察することができます。適切な蛍光レポーターマウスと組み合わせて、このアプローチは、腸上皮細胞の押出を制御する細胞および分子機構、ならびに他の生物学的プロセスに光を流すのに適しています。過去数十年の間に、生体内顕微鏡を用いた興味深い研究は、内皮透過性、免疫細胞腸管ホーミング、免疫上皮通信、および発光成分の侵入に関する知識に寄与してきた。ここで紹介するプロトコルは、上皮細胞押出を制御するメカニズムの理解を深めるだけでなく、他の組織であっても他の非常に動的な細胞プロセスを視覚化する手段として使用される他のアプローチの発達の基礎となる可能性もある。技術的な制限の中で、特定の組織の光学特性、ならびに選択されたイメージング技術および顕微鏡構成は、順番に、撮像作業距離、および取得画像の分解能を決定するであろう。

概要

腸は、競合するプロセス、すなわち栄養と有害な発光物質に対する保護を可能にする厳しく調節された機能を持つ高度に専門化された器官です。腸上皮は、人体と環境の間に内層であり、物理的および免疫学的障壁として作用し^、腸内の粘膜恒常性の維持に寄与^する。上皮完全性の喪失および緊密な接合透過性の増加は、炎症性腸疾患(IBD)3、4、5、6に関連することがよく知られている。^3,4,5,6上皮変化は、IBDにおける慢性腸炎の原因および二次増幅器と考えられる。したがって、IBD患者の腸内の初期上皮変化に対する理解の向上は、信頼性の高い予測とその後のIBD再発の予防のために上皮の完全性を回復するための新しい戦略の開発にとって非常に価値があるだろう。

腸上皮は複雑で厳しく調節されたターンオーバープロセスに従う。陰窩下から、多能性幹細胞に由来する末期分化された腸上皮細胞(IEC)が、上方に移動して、老化/損傷した細胞が内腔⁷に流される。分裂と細胞押出との間の平衡は、腸の上皮細胞数の維持を可能にし、ギャップおよび漏出の形成を回避し、また細胞塊および腫瘍化をもたらす可能性のある上皮細胞の蓄積を^{88、9、109,10}に導く。腸上皮の生理的再生における上皮細胞脱落の重要な役割にもかかわらず、ビロス先端で細胞の押出を駆動する分子メカニズムに関する知識は限られている。したがって、上皮細胞の脱落に関与する分子事象の配列を正確に記述する基礎研究が必要である。

腸粘膜内の異なる細胞型間の複雑な相互作用は、上皮のターンオーバーと腸内恒常性を調節する分子メカニズムを理解する鍵となる。したがって、in vivo研究は、この文脈におけるin vitroおよびex vivoアプローチよりも高い利点を提供する。さらに、リアルタイムイメージング技術により、特定の現象を制御する一連のイベントの記述が可能になります。この文脈では、高度に動的なプロセスの研究は、組織の直接観察のための最適化された高解像度技術の使用を要求する。生体内イメージング技術は、腸内の上皮細胞脱落の研究に適したユニークなツールとして現れます。

「生体内顕微鏡」という用語は、高解像イメージング技術(多光子または共焦点顕微鏡)を利用して、生きている動物¹¹内の自在の環境内の細胞および組織を直接可視化する実験的アプローチを指す。それは単一細胞の決断にin vivo情報の実時間獲得を可能にし、静的か低い決断方法より明確な利点を伴う。生体内顕微鏡は補完的な情報を提供し、組織処理による人工物など、古典的な技術やハイエンド技術からいくつかの制限を克服します。対照的に、生体内顕微鏡の主な制限は、組織が顕微鏡に直接さらされるべきであり、ほとんどの場合、手術が必要です。高度なアプローチは、生力性を維持し、画像化された組織(皮膚の外向室およびイメージング窓^)12、13の影響を最小限に抑えるが、ほとんどの場合^、13組織(皮膚フラップ⁾¹⁴の外的化のために単純な皮膚切開が行われる。過去10年間で、これらのアプローチは、以前は不可解であった非常にダイナミックなプロセスに関する重要な証拠を貢献してきました。翻訳的には、リアルタイムイメージングは、幹細胞および白血球ホーミング^15、ならびに癌播種および転移形成^13、16に関する新たな生物学的洞察を提供^した。¹³臨床文脈では、内視鏡検査は現在、癌¹⁷および胃腸疾患の診断ツールとして利用されている、例えばIBD^18、19;,19共焦点モザイク顕微鏡は手術中に急速な病理学ツールとなった^{間 20}.一緒に、生体内顕微鏡は最近、バイオメディカル研究とクリニックでの将来の応用のための貴重で汎用性の高いツールとして浮上しています。

腸上皮漏れのリアルタイム可視化と上皮細胞脱落事象の観察のために、インビタル顕微鏡が実施されています。腸透過性の漏出は、血清²¹における蛍光トレーサーの経口投与の定量化などの生体内非侵襲的技術によって同定することができる。しかし、この技術は、流れ性能の直接的な観察や、パラセルラーとトランスセルラー透過性の間の分離を直接観察することはできません。標準的なトレーサー実験と生体内顕微鏡の組み合わせは、i)腸透過性の障害を同定し、ii)パラ細胞とトランス細胞上皮透過性の間で分離する適切なアプローチを表す。細胞流動以外にも、生体内蛍光標識と組み合わせた生体内顕微鏡検査は、他の細胞および分子機構の研究を可能にする(例えば、蛍光レポーターマウス²² を用いた細胞脱落時の緊密な接合点の再分配または腸粘膜²³内のIECと他の細胞との相互作用)。

ここで提示した方法は、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)を用いて腸粘膜をリアルタイムに観察できるように、生体内顕微鏡の適応を表しています。したがって、GGTAS(ゲラニルゲラニルトランスビセ酵素)の条件付きノックアウトマウスを腸管上皮細胞(Pggt1b^iΔIEC マウス)において用い、重度の腸疾患および上皮透過性の増加に苦しんでおり^ます。マウスの外科的調製および腸粘膜の染色、ならびにイメージング獲得および取得後分析に使用される適切な設定が記載されている。このプロトコルは、腸上皮細胞脱落のダイナミクスと運動学に関する現在の知識に寄与する将来の研究を可能にする可能性がある。さらに、このプロトコルは、腸粘膜の表面、さらには他の組織で起こる他の現象を研究するための様々な適応の基礎として役立つ可能性があります。

プロトコル

次の議定書は、エルランゲン(ドイツ、ヴュルツブルク、レジエルン・フォン・ウンターフランケン)の関連する地方自治体によって承認されています。マウスは、特定の病原体を含まない状態で収容された。

注:ICs内でGGTase媒介性プレニルの阻害は 、Pggt1b^iΔIEC マウス²⁴における腸透過性の深刻な変化を引き起こす。したがって、このマウスモデルは、プロトコルが腸の障壁の欠陥を研究するのにどのように有用であるかを実証するために使用された。しかし、このプロトコルは、他のマウスラインの研究に使用することができます。

1. 手術準備とマウス腸粘膜染色

注: 手術準備は、前述のプロトコル²⁵に基づいています。麻酔薬を手術中に赤いランプの下に置いて体温の低下を避ける。

1. ケタミン/キシラジンの腹腔内注射によるマウスの麻酔薬(96 mg/kgケタミン;12.8 mg/kgキシラジン)。眼瞼反射の欠如を確認して麻酔を確認します。
2. 綿棒を使用して目の保護クリームを適用します。
3. 標準的な鉗子およびまっすぐな細かいはさみを使用して左腹側区域の切開(1cm)を作る。
4. 腸のセグメント(5〜7cm、およそ)を外装する。
5. 前腸側で電気焼灼することにより、外側に入った腸管セグメントを縦方向に開きます。
6. 粘膜を露出し、すぐに生理食い溶液ですすい、便の内容を除去します。
   注:必要に応じて、蠕動による動きのアーティファクトを避けるために、腸に直接キシラジンを適用します。
7. 腸粘膜の表面をアクリフラビンとローダミンBデキストラン(10kDa)で染色する。
   1. 粘膜に滴下して滴下し、3分間インキュベートして1mg/mLアクリフラビン溶液(100 μL)を塗布します。残りの溶液をPBSで洗い流します。
   2. 2 mg/mL ローダミンデキストラン溶液(100 μL)を粘膜に滴下してピペット化し、3分間インキュベートします。残りの溶液をPBSで洗い流します。
      注:必要に応じて、無菌綿を使用して準備から血液を除去します。
8. 麻酔マウスの上に、あらかじめ温めた生理食液(37°C)ですすいでチャンバーに取り付けられたカバースライドに取り付けます。
   注:開いた腸管セグメントは、カバースライド上の発光表面を下に配置されます。
9. 逆顕微鏡ステージ上に調製物(麻酔用マウス)を置きます。
10. 等温パッド(約37°C)で動物を覆います。
11. すぐに生体内顕微鏡に進みます。
    注:組織および細胞死の脱水を避けるために、手術準備を事前に温めた生理液ですすいで保管してください。

2. 生体内顕微鏡

注:手術の準備を開始する前にステップ2.1を実行し、麻酔、手術、画像取得の間の長い待ち時間を避けてください。必要に応じて、麻酔薬の追加用量は、画像実験のための麻酔下でそれらを維持するために外科的に調製された動物に与えることができる。

1. CLSM顕微鏡を設置します。
   1. 顕微鏡ベースとスキャナーボックスをオンにして、CLSM顕微鏡を起動します。 [スタート ]ボタンを押して、コンピュータの電源を入れます。
   2. アイコンをダブルクリックして画像取得ソフトウェア(例えば、LAS X)を起動します。適切な構成を選択します (構成: マシン;顕微鏡: DMI6000) をクリックし 、[OK] をクリックします。
      1. 適切な解像度を定義します。設定に移動 |ハードウェア |解決策 |ビット深度。12 を選択します。
   3. 取得メニューに移動します。ドロップダウン メニューからイメージ取得モードのxyztを選択します。ドロップオフメニューから目的を選択します(20xまたは40倍)。
   4. 順次取得設定を設計します。 [Seq]をクリックします。追加ボタン(+)をクリックして、2番目のシーケンスを 追加 します。[ フレーム間]を選択します。
      1. シーケンス1(アクリフラビンの検出;416 nm励起;514 nm放出)を構成する。可視レーザーボックスの電源を入れます。PMT1 (オン) をアクティブにします。発光波長ウィンドウ(490~550 nm)を定義します。
      2. 構成シーケンス 2 (ローダミンB-デキストランの検出; 570 nm 励起; 590 nm, 放出).可視レーザーボックスの電源を入れます。PMT2 (オン) をアクティブにします。発光波長ウィンドウ(550-760)を定義します。
   5. 対応するレーザー(488および552)をアクティブにします。設定に移動 |レーザー.488および552 nmレーザーをアクティブにします(オンにします)。
2. 現在の実験の特定の機能に設定を調整します。
   1. 光源をオンにします(電源を入れます)。調製物(チャンバー内の麻酔マウス)を顕微鏡ステージに置き、照射軸が組織調製物に焦点を合わせるまでキシポジションを変更する。
   2. 標準光源と接眼点を使用して、対象のフィールドを選択します。
      1. フィルタ キューブ (I3) を選択します。シャッターを開けろ。マクロとマイクロホイールを使用して腸粘膜の表面に焦点を当てます。XY位置を変更して、視野内で複数の絨毛を視覚化できる領域を検索します。
   3. ローダミンデキストラン染色もその領域に見えるようにしてください。フィルタ キューブ (N2.1) を変更します。接眼点を通して画像を確認してください。
   4. ソフトウェアからCLSMイメージの取得を開始します。2 つのシーケンスの設定を最適化します。
      1. シーケンス 1 を選択します。シーケンス1のレーザーパワー、ゲイン、オフセットを調整します。
      2. シーケンス 2 を選択します。シーケンス2のレーザーパワー、ゲイン、オフセットを調整します。
   5. z スタック範囲を定義します。
      1. Z スタックのドロップオフ メニューを開きます。z軸コントロールを使用して粘膜の表面に焦点を当てます。 を押します。
      2. 信号がまだ検出可能な下限に焦点を当てます。 終了 を押します。
      3. z スタックの数を定義します (10)。2 つの連続したタイム ポイントの 2 分より長い時間経過を避けます。
   6. 時間設定を定義します。 [時刻 ] メニューに移動します。[ 最小化]をクリックします。[ 停止するまで取得 ] を選択します。
   7. ライン平均を定義します。[Seq 1] を選択します。[ライン平均 2] を選択します。[Seq 2] を選択します。[ライン平均 2] を選択します。
3. 対応する画像を取得します。
   1. フォーマット(1024 x 1024)と速度(400)を選択します。スタート を押 します。
   2. 目的の画像取得時間の後に [停止] を押します。
4. ファイルを保存します。 プロジェクトに移動します。対応するファイルを右クリックします。 [名前を付けて保存] を押します。
   1. ファイルに適切な名前を付けます。適切なフォルダを選択してください。 をクリックして保存します。
5. 動物を安楽死させる(子宮頸部脱臼)、必要に応じて下心分析のために組織を収集します。

3. 画像解析:細胞脱落率と腸上皮を決定する

1. セルの脱落率
   1. 画像取得ソフトウェアを起動します。
   2. [プロジェクトを開く] に移動します。適切なファイルを選択します。
   3. 画像取得の合計時間を定義します。
      1. 最後に完了した z スタックを選択します。直前に選択したタイム ポイントから最後の Z 位置を選択します。画面の右下隅の時間(画像取得の合計時間)を読みます。
   4. バイラスを選択します。
      1. 適切な Z スタック位置(villus の表面が、すでにルーメンに存在する細胞や他のコンポーネントとの干渉を避けるために十分な深さ)を選択します。
      2. 基底膜の長さを測定します。ルーラー ツールを選択します。バイラスを数行に分割して、ヴィラスの周囲全体を覆ったり描いたりします。異なる値(基底膜の全長)を追加します。ルーラー ツールのセグメントを削除します。
   5. 画像取得の全期間中に発生したイベントの数をカウントします。
      1. ヴィラスを適切なサイズのセグメントに分割します。異なる時間ポイントを通してバーをスライドさせることによって、イベント/セグメントのシーケンスを分析します。識別されたセル・脱落イベントにコメントを付けます。
   6. 細胞の脱落率を示す基底膜の脱落事象/時間/長さの数を計算します。5絨毛/ビデオ、および少なくとも2つのビデオ/マウスまでカウントします。これらの10の測定値の平均を計算します。
2. 漏れ
   1. バイラスを選択します。
   2. 適切な Z スタック位置(villus の表面が、すでにルーメンに存在する細胞や他のコンポーネントとの干渉を避けるために十分な深さ)を選択します。上皮細胞/絨細胞の総数を数える。
   3. 漏れ点の数を数える(ローダミンデキストランのパラセルラー存在。このイベントは一時的なものであり、以前の下心と下心取得した写真を確認することで確認できます)。
   4. 上皮細胞の漏れ/総数の数を計算します。10種類のvillus/サンプル/ビデオを分析し、漏れと透過性細胞/villusの平均数を計算します。

結果

ここで示すプロトコルは、腸内上皮漏れを可視化し、腸内の細胞脱落性能をリアルタイムで観察するための生体内顕微鏡ベースのアプローチを説明しています。簡単に言えば、マウスは麻酔を受け、小腸粘膜の表面を露出させるために外科用調製物に提出される。IPCは、アクリフラビンの局所適用によって染色されます。一方、ルダミンB-dextranは、内腔から上皮下空?...

ディスカッション

技術的には困難ですが、生体内顕微鏡ベースの方法論は、細胞流動性能など、動的な細胞プロセスをリアルタイムで可視化する独自の実験的アプローチを表しています。これまでのところ、生体内で細胞押出を可視化する代替実験的アプローチはない。このプロトコルは、腸内恒常性の維持に役割を果たす多様な細胞プロセスの記述に寄与できると考えています。

生体?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acriflavine hydrochloride	Sigma Aldrich	A8251	1 mg/mL solution in PBS
Deltaphase isothermal pad	BrainTree	B-DP-PAD	-
Gemini Cautery System	BrainTree	B-GEM-5917	-
Ketamin	WDT	9089.01.00
LAS X	Leica	-	-
LSM microscope SP8	Leica	-	-
PBS	Biochrom	L182
Rhodamine B dextran	Invitrogen	D1824	10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution
Standard forceps (Dumont SS)	Fine Science Tools	11203-23	-
Straight fine scissors	Fine Science Tools	14060-10	-
Tamoxifen	Sigma Aldrich	T5648	50 mg/mL in ethanol
Xylazin	Bayer	1320422