高分解能X線吸収分光法を用いた極低温でのスペシエーションのための生体試料調製

要約

このプロトコルは、シンクロトロンベースのX線吸収分光法実験のために生物学的クライオサンプルを調製するための詳細な手順を提示する。サンプル調製と凍結保存を最適化するために必要なすべてのステップを、がん細胞と植物プランクトン細胞を用いたプロトコルの例で説明します。この方法は、サンプルクライオ調製の普遍的な標準を提供します。

要約

X線吸収分光法(XAS)による元素の研究は、生物学的システムにおける金属の役割を研究する際に特に興味深い。サンプル調製は、特に生物学的サンプルにとって、重要でしばしば複雑な手順です。X線スペシエーション技術は広く使用されているが、詳細なプロトコルはまだこの技術のユーザに普及していない。さらに、化学状態の改変が懸念されており、細胞または組織の化学的完全性の最大の保存を提供するために、生物学的サンプルをほぼ天然の水和状態で分析するために、クライオベースの技術が推奨されます。ここでは、凍結保存試料に基づく細胞調製プロトコールを提案する。これは、癌細胞におけるセレンの高エネルギー分解能蛍光検出X線吸収分光法研究および植物プランクトン中の鉄の研究において実証されている。このプロトコルは、他の生物学的サンプルおよび照射によって損傷を受ける可能性のある他のX線技術と共に使用することができる。

概要

必須または毒性元素の細胞内変換の研究には、高感度のスペシエーション技術が必要であり、化学種の改変を受けやすいことが多いサンプル調製ステップを最小限に抑える必要があります。

セレンや鉄などの生理学的元素は、その複雑な化学的性質、セレンまたは鉄種の様々な安定性、およびppm(mg / kg)またはサブppm範囲でのそれらの低濃度のために、種分化することが特に困難であることが知られている。したがって、XASによるこれらの元素のスペシエーションの研究は、非常に困難な場合があります。シンクロトロンXAS、特に高エネルギー分解能蛍光検出XAS(HERFD-XAS)は、非常に低いシグナル対バックグラウンド比¹を可能にし、シンクロトロン源で利用可能な、複雑な生物学的マトリックス^2,3中の高度に希釈された元素をスペシエーションする。従来の蛍光XAS測定は、欧州放射光施設(ESRF)⁴のCRG-FAMEビームライン上で、エネルギー帯域幅約150~250eVのエネルギー分解固体検出器(SSD)を使用して実行できますが、HERFD-XAS測定には、ESRF2のCRG-FAME-UHDビームライン上で、約1~3eVのエネルギー帯域幅を持つ水晶分析器分光器(CAS)が必要です。.蛍光光子は、それぞれ電子的または光学的プロセスによってそれらのエネルギーに関して区別される。

サンプルクライオ調製は、構造を維持し、組成化学的完全性を維持するために不可欠であり、したがって、生物学的天然状態⁵に近い分析を可能にする。さらに、液体ヘリウム極低温冷却(LN₂)を使用して10 Kという低い極低温で実施された分析により、放射線損傷が減速し、XASの元素スペシエーションが維持されます。生物学的試料に適用されたXAS技術に関するいくつかのレビューは、極低温条件下で試料を調製および分析する必要性を報告しているが(例えば、Sarretら⁶、Porcaro et ^al.7)、それらのどれも関連する詳細なプロトコルを明確に記述していない。この公報では、極低温での^Se8 および^Fe9 のHERFD−XASスペシエーションについて、癌細胞およびプランクトン微生物の凍結調製方法が記載されている。

最先端のXAS分光法測定中のサンプル調製と環境のための良い習慣は、1)セットアップを必要とします。2)放射線障害の影響を可能な限り制限する分析手順。3)試料(またはモデル化合物参照)をX線光子ビームサイズに対してできるだけ均質にする。第1の項目は、液体ヘリウムクライオスタットを用いて低温で取得を行うことによって考慮される。第2の項目は、梁に対してそれを移動させることによってサンプルの新鮮な領域に対して各取得を行うことによって対処される。最後に、第3の条件を考慮すると、サンプル(ペレット)および参照(粉末)は、気孔率および不均一性を可能な限り制限し、X線プローブされたサンプル表面上のビームサイズに対する粗さを避けるために、プレスバルクペレットにコンディショニングされる。プロトコルがこれらすべての点をどのように処理するかを説明します。

ヒト前立腺細胞株PC-3(転移能が高い)と卵巣細胞株OVCAR-3(卵巣がん症例全体の最大70%を占める)を用いて、セレンナノ粒子(Se-NP)のがん細胞に対する抗増殖特性を調べ、モデル種として Phaeodactylum tricornutum Diatom をモデル種として、植物プランクトン中の鉄隔離を調べました。

プロトコル

セレンスペシエーションのためのヒトPC-3およびOVCAR-3癌細胞ペレットの調製

注:以下のプロトコルは、Weekleyら¹⁰から適合されている。すべてのステップは、無菌技術を使用して、バイオセーフティレベル2の条件および制限の下で細胞培養フードの下で実施されなければならない。

1. マラセス細胞計数室を用いて細胞を計数する。PC-3細胞株についてはフラスコ当たり150,000~200,000細胞を、OVCAR-3細胞株については300,000細胞をシードする。
2. T−75フラスコ中の種子細胞(3連を有するために条件ごとに3つのフラスコ)を層流フードの下の適切な細胞培養培地(表1)に入れた。
3. 細胞培養物を37°Cのインキュベーター内で増殖させ、80%コンフルエントに達するまで5%_CO2 で加湿雰囲気にする。通常、PC-3前立腺癌細胞株は24時間後に倍増し、OVCAR-3卵巣癌細胞株は72時間かかる。フラスコはインキュベーターに残さなければなりません。
4. 一方、治療に用いたSe-NPsを、細胞毒性評価のためのMTT(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド)アッセイにより予め定められたIC20(20%の細胞死を達成するための阻害濃度)に相当する最終濃度に希釈する。これらの濃度は、各Se-NPsタイプに特異的であるが、研究された細胞株にも特異的である。
   1. ナノ粒子ストック溶液(ウシ血清アルブミン[BSA]またはキトサンコーティングSe-NPsの2mg/mL)を室温(RT)で30分間超音波水浴中に置く。
   2. Se-NPs溶液を完全な細胞培養培地中で段階希釈して希釈し、作動濃度に達する。各希釈液の間に、1分間渦を巻き起こす。
5. 治療のために希釈されたセレン塩でセレン陽性対照を調製する。
   1. 亜セレン酸ナトリウム水溶液(1mg/mL)を15mLポリプロピレンチューブに調製する。1mgの亜セレン酸ナトリウム粉末を1mLの超純水と混合する。
   2. 原液を1分間渦巻きにする。
   3. 亜セレン酸ナトリウムストック溶液を完全な細胞培養培地中で段階希釈することによって希釈し、作業濃度に達する。
      注:溶液を均質化するために、各希釈の前に数回ピペッティングすることを忘れないでください。
6. セレン治療に癌細胞をさらします。.
   注:プロトコルのこの部分は、テストされたナノ粒子(NP)ごとに繰り返す必要があります。ここで、NPは、BSAおよびキトサンコーティングされたSe-NPの2つのタイプと、対照からなる。亜セレン酸ナトリウム溶液は陽性対照であり、無処理は陰性対照である。
   1. 層流フード内の細胞を入れた3つのT-75フラスコを開きます。
   2. 培地を除去し、5mLの加温(37°C)リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を穏やかに2x洗浄した。
   3. 穏やかに、細胞層に直接ではなくフラスコの底側に、25mL滅菌プラスチックピペットを備えた自動ピペットを用いて各フラスコに15mLの処理を加える。フラスコに蓋をします。蓋をしっかり閉めないでください。
      注: ステップ 1.3 および 1.4 で説明したように、処理液を均質化するためには、事前に再懸濁しておく必要があります。
   4. 3つのフラスコを37°Cのインキュベーター内に水平に放置し、5%_CO2で24 時間加湿した雰囲気にした。
7. 細胞ペレットの調製
   1. T75フラスコ内で5mLの加温したPBS(37°C)で細胞2xを直接穏やかに洗浄する。
   2. 10mL滅菌プラスチックピペットを備えたピペットボーイを用いてT−75フラスコ内の細胞層上に6mLの加温細胞培養培地(37°C)を加える。
   3. セルスクレーパーを使用して穏やかに掻き取ることによって細胞を集める。フラスコごとに1つのセルスクレーパーを使用してください。
   4. ピペットボーイと10mLピペットを使用して、液体を吸引し、フラスコ表面上の細胞/培地をフラッシュバックして、すべての細胞を回収する。この手順を数回繰り返して、細胞を解離させて個別化します。細胞を含む培地を15mLポリプロピレンチューブに集める。
   5. RTで250 x g で5分間スピンダウンし、上清を吸引します。
   6. 細胞を5 mLのPBSに再懸濁してすすいでください。
   7. RTで250 x g で5分間スピンダウンし、上清を吸引し、ステップ1.6.5と1.6.6 2xを繰り返して、処理の残りの痕跡をすべて取り除きます。
   8. 細胞を1 mLのPBSに再懸濁し、1.5 mLのポリプロピレンチューブに移す。最後に、それらをRTで5分間250 x g でスピンダウンします。 図1 は、遠心分離して上清を捨てた後に得られた細胞ペレットを表しています。
   9. 200 μLのピペットを使用してすべてのPBS上清を静かに除去します。
      メモ:セルペレットに触れたり傷つけたりしないように注意してください。理想的には、ペレットは高さ2〜3mmまたは厚さで、直径3〜6mmでなければなりません。PC-3 細胞株の場合、アッセイには 9 x 10⁶ ~ 10^{x 106} 個の細胞が必要です。OVCAR-3細胞株の場合、8 x 10⁶–9 x¹⁰⁶ 細胞が必要です(図1)。一部の細胞は、その後のバッファーリンスステップ中に失われる可能性があります。セル数が多いほど、ペレットは良好になります。
8. 細胞ペレットのフラッシュ凍結
   1. ペレットを含む1.5 mLチューブの底部を液体窒素(_LN2)中にセルペレットのレベルまで突っ込む。
   2. 窒素ガスなどの不活性雰囲気で完全にパージされたグローブボックス内で、LN 2冷却銅ブロックの平らな面に1.5 mLチューブを軽く叩いて、セルペレットを収集します(図2)。次いで、ペレットは、細胞損失なしに収集される。
      メモ: LN₂ の取り扱いには、凍結防止装置、ラボコート、閉じた靴、クライオ手袋、フェイスシールドまたは安全ゴーグルを使用してください。
   3. 必要に応じて、LN₂ 冷却針を使用してペレットを取り出すことができます。
      注:得られた凍結細胞ペレットは断片化する可能性があります。これらのステップは数分で実行し、研究者の器用さとスピードに頼らなければなりません。
   4. 凍結ペレットの寸法は、クライオスタットサンプルホルダーに適合する必要があります。上記の装置を使用して、セルペレットの高さが2mmより大きく、XASに使用されるサンプルホルダーの穴よりわずかに小さい場合、サンプルを直接使用することができます。そうでない場合、または分析のために平坦な表面が必要な場合は、バルク円筒形ペレットを調製し、ペレットを凍結状態に保つ必要があります。細胞ペレットが断片化されている場合、以下のステップは、不活性雰囲気で完全にパージされたグローブボックス内で理想的に使用することができる。
9. バルク凍結円筒ペレットの調製
   1. サンプルと接触する手動油圧プレスのすべての部品をLN₂ に浸漬します(図3A、直径3mmまたは5mmのペレットダイ、金型、ピストン/ワイヤ引っ張り)。
   2. 急速凍結したペレット断片を、適切なペレットダイを装填した型に移す(図3B)。
   3. 油圧プレスで素早くペレット化します。直径5mmのペレットに1.5トン、直径3mmのペレットに0.5トンで十分です(図3C)。
      注:油圧プレスによる各ペレット調製後、残りの霜や湿度の問題を避けるために、すべての材料を解凍し、窒素ガスを使用して適切に乾燥させる必要があります。
   4. 凍結細胞のバルクペレットを素早く集め、適切なクライオチューブに入れて保管してください。
   5. 長期保管のためにLN₂ タンクに保管してください。
   6. 分析のためにクライオペレットを移送して取り付けます。LN₂ 冷却クライオチューブに貯蔵されたペレットは、液体_N2 (CRG-FAME-UHDビームラインに使用される図4)の77K予冷クライオスタットサンプルホルダーに移されます。この手順はできるだけ早く実行する必要がありますが、数分かかる場合があります。その後、サンプルホルダーをクライオスタットに移し、XAS分析全体を通して10 Kに維持します。
      メモ: ステップ 1.9.3 および 1.9.6 は、ピストンと金型をふさぐ霜の発生を避けるために迅速に行う必要があるため、困難です。別の方法として、窒素ガスで完全にパージされたプラスチック製のテントの下でこれらの手順を実行することもできます。LN₂クール銅塊により、ペレットを凍結し続けることができます。

2. 鉄スペシエーションのためのプランクトン細胞の調製

注:このプロトコルに使用した合成海水は、超純水に海塩、モルホリノプロパンスルホン酸、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム五水和物、リン酸ナトリウム一水和物、ビタミンストック、微量金属ストック、抗生物質ストック、およびHEPES緩衝液をpH=7.9で添加することによって調製した。各成分の濃度は、材料表に示されている。培養に関する詳細はSutakらに見ることができる¹¹。

1. P. tricornutum 珪藻培養物を 50 mL ポリプロピレンチューブで 1,100 x g で 6 分間遠心分離し、ペレットを新鮮な培地でフラスコに移します。
2. 培養物を成長チャンバー内の合成海水中で24時間成長させる。
3. プランクトン培養物を1,100 x g で6分間遠心分離し、ペレットをFe-クエン酸塩(最終培養では1 μM)を含む新鮮な培地に移す。72時間インキュベートする。
4. プランクトン細胞を準備する
   1. 細胞を1,100 x g で3分間遠心分離し、鉄を含まない培地ですすいでください。
   2. ペレットを1.5mLポリプロピレンチューブに移し、超純水で洗浄し、1,100 x gで2xを3分間遠心分離 する。上清を取り除きます。
   3. ステップ1.8で説明したように、ペレットを含む1.5mLポリプロピレンチューブの底部を_LN2 に突っ込む。
   4. 凍結細胞をLN₂ 凍結成形機に移し、ステップ1.9で説明したようにXRFペレットプレス(図3 および 図7)を使用して迅速にプレスします。
   5. ペレットを取り出し、LN₂ タンクに保管して長期保管します。
   6. ステップ 1.9.6 に従います (クライオスタット・サンプル・ホルダーへの転送については、 図 4 を参照してください)。

3. 参考化合物の製造および測定

注:種を代表し、生物学的系中に見出されると予想される参照化合物(固体または液体)は、実験的生物学的試料と比較するためにXASによって調製および分析されなければならない。参照スペクトルはまた、データベース¹²、¹³、¹⁴において見出すことができ、測定条件(例えば^、スペクトル分解能)が実験サンプルに類似していたことを条件として使用することができる。

1. 水溶液中での参照のために、嫌気的条件下または不活性雰囲気下で粉末または液体形態の初期化合物を秤量する。酸化還元反応を回避し、周囲空気中で反応性が高く不安定である化合物の化学的完全性を維持するために、不活性雰囲気中(すなわち、嫌気性グローブボックス内またはシュレンクライン内、 図5 および 図6を参照)で酸化還元感受性リファレンスを調製する)。ここで、全てのセレン参照は、シュレンクラインを用いて調製し、超純水を脱気した(図6)。液体Fe^III−リンゴ酸塩およびフェリチンを周囲空気中で調製した。
2. 蛍光モードでの収集のために、研究された元素(すなわち、セレンまたは鉄)の1%重量最終濃度に達するために適切な溶液と混合する。
   注:超純水は、XASリファレンスを準備するために最も頻繁に使用されるソリューションです。グリセロール(15%~20%)の添加は、氷結晶によるX線回折から生じるアーチファクトを防止し、固体検出器で収集されたXASシグナルの品質を維持するために、標準的なXAS蛍光を使用して測定された液体に必要です。しかしながら、HERFD-XASの場合、グリセロールは必須ではない。固体検出器の代わりに結晶分析器分光計を使用して、エネルギーを極めて高い分解能で選択し、氷結晶によって誘導される回折は、研究元素¹のデータ収集に影響を与えない。
3. 調製した溶液を密閉されたシュレンクバルーン(図5)または1.5mLポリプロピレンチューブに保存し、サンプルと同じ条件で測定するまで保管する。
4. 固体参照の場合は、セレンまたは鉄モデル化合物粉末を周囲空気またはグローブボックス内で計量します(種が酸化還元に敏感である場合)。ここでは、固体FeII参照(^FeII-酢酸塩およびビビアナイト)を気体状の_N2グローブボックス内で調製し、^FeIII(Fe(OH)₃、および^{FeIII-リン酸}塩)を周囲空気中で調製した。
5. 高純度窒化ホウ素粉末を秤量し、研究元素の最終濃度を1%重量に達するようにモデル化合物粉末と混合する(図7A)。
6. 乳鉢を用いて少なくとも15分間微粉末に粉砕する。
7. 粉体混合物を成形機に入れ、油圧プレス機でペレットを調製した(図7B、試料ペレットについては 図3A と同様)。
8. 成形機をピストンで閉じます(図7C、サンプルペレットの 図3B と同様)。
9. プレスしてバルクペレットを得た(図7D、試料ペレットについては 図3C と同様)。
10. 調製したバルクペレットを、サンプルと同じ条件で分析されるまでグローブボックスに保管します。
    注:バルクペレットは、例えば、粉末の相溶性に応じて、ピストンに付着することがあります。それを壊さずに柔らかく取り除くのは難しいかもしれません。その場合、ポリイミドを用いた以下の手順(例えば、カプトン)ディスクを使用しなければならない。
11. 粉末と接触するピストンの両側にエタノールの滴を入れます(図8A)。
12. ピストンより少し小さい直径のポリイミドディスクを2枚用意します。ポリイミドの厚さは10~25μmにする必要があります(薄いほど操作が難しく、厚いほど分析中にX線光子を吸収しすぎます)。
13. ディスクをピストンの上に置きます。毛細管現象によって固執します(図8B)。
14. 成形機をピストンで取り付け、粉末を加えて、2番目のピストンに入れます(図8C)。
15. を押して(ステップ3.11を参照)、圧縮バルクペレットをピストンから取り出します。
    メモ:固体リファレンスは、サンプルと同様にクライオスタット固有のサンプルホルダに取り付けることができます(ステップ1.8.6を参照)。液体リファレンスは、クライオスタット固有のサンプルホルダーに取り付けることができます。CRG-FAMEクライオスタットサンプルホルダーについては、 図9A を参照してください。同じ手順は、 図4Dに示すCRG-FAME-UHDサンプルホルダーを使用して、次の手順を使用して適用できます。
16. クライオスタットサンプルホルダーへの液体リファレンスの取り付け。
    1. RTでサンプルホルダーの穴の片側を密封するために、ポリイミド(例えば、カプトン)テープ(厚さ25μm)をセットします(図9B)。
    2. シリンジを使用して、空洞を上部に達するまでゆっくりと溶液で満たします。泡を避けてください。リザーバは満たされている必要があります(図9C、左)。
    3. キャビティの反対側をテープで密封します(図9C、右)。
    4. 密閉されたサンプルホルダーをLN₂ に突っ込みます(図9D、T₀~_T3)。
    5. 熱反応は_LN2バブリングを誘導する。バブリングが止まるまで待って、反応の終了を知らせます(図9D、_T3-T5)。
    6. データ収集を開始する前に(図9D、_T6)、またはLN₂ Dewarに格納する前に、77Kのサンプルホルダーをビームラインのクライオスタットに転送します。
       注:凍結溶液はキャビティ内によく広がり、均一で均質なペレットを形成する(図9D、_T7)。

4. HERFD-XAS:測定手順

1. 目的の蛍光線エネルギーに対してブラッグ条件でCASからのすべての結晶を最適化します。この手順は、濃縮された参照化合物を用いて行うことができる。
2. 吸収端のエネルギー位置がわかっている基準(典型的には純粋な金属箔)を使用して、入射単色ビームエネルギーを較正する。この基準は、得られたスペクトルごとに較正をチェックし、最終的にそれらを処理後に整列させることができるように、二重透過モードにおいて、試料の後の第2ステップに配置することができる。
3. ステップ1.9.6で説明した適切な手順に従って、生物学的サンプル用の液体ヘリウムクライオスタットにサンプルを配置します。
4. シンクロトロン安全規則に従って実験ハッチを閉じます。
5. 選択した吸収エッジをカバーするエネルギー範囲でXAS集録を実行します。
6. 各スペクトル取得後、新しい集録を開始する前に、サンプルをビームサイズの少なくとも2倍のビームサイズでモーション方向に移動させます。
   注:この場合、Fe_Ka 1線を選択するためにGe(440)結晶を使用し、Se _Ka1線を選択するためにGe(844)結晶を使用して測定を行った。サンプル上のビームサイズは200 x 100 μm²(H x V全幅半値)であった。各取得間のサンプル運動は、構造の均質性を調査し、毎回以前の放射線損傷の可能性のない新しい領域を分析するために、両方向に500μmであった。個々のスペクトルは、ノイズ内で重ね合わせ可能な場合に比較およびマージされます。マージされたスペクトルの品質が正しい場合、特定のサンプルの測定は停止します。その後、データ解析は、XAS解析専用の任意のソフトウェア、特に正規化されたスペクトルの線形結合フィッティングを可能にするもの、例えばAthenaとArtemis(Demeterソフトウェア群)¹⁵、SixPack¹⁶、またはViper¹⁷を使用して実行することができる。XAS分析の完全かつ詳細な説明は、このプロトコルの範囲外であり、最近の論文¹⁸、¹⁹に見出すことができ、そのうちのいくつかは^、より具体的には生物学的試料²⁰に捧げられている。セレンXANES基準スペクトルは、SSHADEスペクトルデータベース²¹に既に収集されている。

結果

これらの調製物の主な目的は、セレンナノ粒子(Se-NP)と癌細胞との間の相互作用、ならびに植物プランクトンにおける鉄結合および隔離を調査することであった。

初期状態(BSA Se-NPs)および栄養培地中でインキュベートした細胞(24時間インキュベーション後のBSA Se-NPs)におけるセレンのHERFD-XANESスペクトルを図10に示す。その結果、初期のSe-NP中のセレ?...

ディスカッション

このプロトコルは、X線吸収分光法によって生物学的サンプル中のセレンおよび鉄の化学的形態を研究するために使用された。これは、生物学的サンプルおよび参照化合物のクライオ調製および保管、ならびにHERFD-XAS測定に焦点を当てています。

クライオ調製および貯蔵
バルク生物学的試料ペレットの凍結調製は、試料中に存在する種の化学的完全性の保?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium nitrate	Sigma-Aldrich	A3795	NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water
Anaerobic chamber	Coy Laboratory, USA		equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)
Antibiotic stock	Sigma-Aldrich	A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate	1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)
Boron nitride powder	Sigma-Aldrich	255475
Cell counting chamber			Neubauer or Malassez
Cell scraper
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	GIBCO	14190-094	Without Calcium, Magnesium, Phenol Red
Eppendorf tubes			0.5 mL and 1.5 mL
Falcon tubes			15 mL and 50 mL
Ferric citrate Fe/citrate = 1/20	Sigma-Aldrich	F3388	aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5
Fetal Bovine Serum	GIBCO	A31604-02	Performance Plus, certified One Shot format, US origin
Flasks	Sigma-Aldrich	Z707503	TPP 150 cm2 area
Growth chamber	Sanyo	Sanyo MLR-352	at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	H4034	1 g/L of milliQ water HEPES
High grade serous, OVCAR-3	ATCC, Rockville, MD	HTB-161	Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Incubator			Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2
Insulin solution from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I0516	10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture
Manual hydraulic press	Specac, USA
Marine diatom Phaeodactylum tricornutum	Roscoff culture collection	RCC69	http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69
Morpholinepropanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	M3183	MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)
Optical microscope
PC-3	ECCAC, Salisbury, UK	90112714	Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Pipette-boy			25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes
Plankton culture products, Mf medium: Sea salts	Sigma-Aldrich	S9883	40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg
Plastic tweezers	Oxford Instrument	AGT 5230
RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification)	GIBCO	A10491-01	Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use
Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	Se50-BS-1	BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	11. Se50-CS-1	Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Sodium metasilicate pentahydrate	Sigma-Aldrich	71746	Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water
Sodium nitrate	Sigma-Aldrich	S5022	NaNO3, 75 mg/L of milliQ water
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S5011	NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water
T-75 flasks
Tissue culture hood
Trace metal stock	Sigma-Aldrich	M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857	1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)
Trypan Blue Solution (0.4%)	GIBCO	15250061
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	GIBCO	25300-054
Vitamin stock	Sigma-Aldrich	T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12	1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)
Water bath 37°C