腫瘍性異種性、オンコストリーム、および浸潤の空間・分子特性解析のための神経膠腫部分領域のレーザー捕捉微小切除

要約

レーザーマイクロディション(LMD)は、グリオーマの不均一性と侵入を媒介する経路を明らかにするために使用できる、敏感で再現性の高い技術です。ここでは、レーザーLMDを用いて、トランスクリプトーム解析を用いて、グリオーマ組織から離散領域を分離するための最適化されたプロトコルについて述べている。

要約

神経膠腫は、その侵襲性および不均一性を特徴とする原発性脳腫瘍である。例えば、偽官麻痺、微小血管増殖、間葉形転換および壊死などの特定の組織学的パターンは、高級神経膠腫の組織学的不均一性を特徴付ける。我々の研究室は、オンコストリームと名付けられた間葉細胞の高密度の存在が腫瘍悪性腫瘍と相関することを実証した。私たちは、グリオーマの成長と侵略の根本となるメカニズムを理解するためのユニークなアプローチを開発しました。ここでは、レーザー捕捉マイクロディション(LMD)およびRNAシーケンシングを利用して、腫瘍内の異種多細胞構造(すなわち、間葉領域または腫瘍浸潤領域)の微分mRNA発現を解析する包括的なプロトコルについて説明する。この方法は、良好な組織組織組織学およびRNA完全性を維持する。灌流、凍結、埋め込み、切り離し、染色は、形態を保存し、高品質のレーザーマイクロ解剖サンプルを得るために最適化されました。結果は、30%スクロースを使用するグリオーマを担うマウスの灌流が良好な形態およびRNAの質を提供することを示している。さらに、4%クレシルバイオレットと0.5%のエオシンで腫瘍切片を染色すると、RNAの完全性を維持しながら、良好な核染色および細胞染色が行われます。記載された方法は、感受性と高度に再現性が高く、様々な腫瘍モデルにおける腫瘍形態学を研究するために利用することができる。要約すると、固体腫瘍内の異種多細胞構造の分子的特徴を研究するために、シーケンシングのための形態およびRNAの質を維持するLMDを行う完全な方法を説明する。

概要

神経膠腫は中枢神経系の最も積極的な原発腫瘍である。彼らは非常に侵襲的で異質な^1です。腫瘍の細胞および分子成分の分析は、新たな治療標的を明らかにする。

現在利用可能なさまざまな方法の中で、凍結脳腫瘍組織のレーザー捕捉マイクロ解剖(LMD)は、腫瘍組織からの離散解剖学的領域または特異的細胞集団の単離を可能にする費用対効果の高い、信頼性の高い技術であり、その分子プロファイル^22,33を研究する。LMDは、選択した単一細胞または多細胞構造のmRNA遺伝子発現プロファイルの解析を可能^{にする4,5。54}LMDは、腫瘍進行中に起こる分子事象に関する深い機械的な知識を得るために利用することができる。腫瘍組織の処理の改善は、組織形態およびRNA品質⁶の最適な光学分解能を得るために必要である。パラホルムアルデヒド固定は形態学的解析に最適な選択肢ですが、これらの条件下でRNAの品質が影響を受けて分解されるため、RNA-seq解析のRNA品質が低下します。凍結組織切片の使用は、細胞膜を破壊し、細胞内に穴を生成する可能性のある氷の結晶形成を回避し、RNA-Seq分析⁷のための最良の選択肢であり続ける。

ここでは、LMD用の凍結マウス脳腫瘍組織を処理するための最適化されたセクション固定および染色方法について述べている。氷の結晶が組織に形成されるのを防ぐために、我々は30%スクロースの溶液をマウスに浸透させた。この溶液は、極性水分子間の相互作用を破壊し、氷の結晶の形成を防ぎ、組織形態を維持します。組織染色は、腫瘍内の細胞または解剖学的に異なる領域の特定の集団を分化し、得るために必要である。RNAの完全性を維持するために、無害な染料で組織を固定し、染色することが不可欠です。以前に示されているヘマトキシリン/エオシン(H&E)を用いた組織の染色は、RNAの完全性を低下^{させる 8}.エタノール、クレシルバイオレット4%、エオシンY 0.5%溶液で目的の組織を固定し、染色しました。クレシルバイオレットは、細胞核を濃い青色で染色する酸性の色素です。エオシンYは、細胞の基本的な成分を染色する好塩基性染料であり、細胞質と他の細胞構造⁸との区別を提供する。どちらの色素もエタノールに溶け、RNAの品質を低下させない。組織の損傷を避け、細胞構造の高い光学解像度を維持するために、我々はLMD⁹の前に組織切片を取り付けた。

プロトコル

実験動物を使用するここで説明するすべての方法は、ミシガン大学の制度的動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。

注:GEMMまたは安定したラインから発生する神経球は、マウス¹⁰における頭蓋内腫瘍生着に使用し、LMDおよびRNAシーケンシングのために処理することができる。これらの細胞はホタルルシメラーゼとGFPタンパク質を構成的に発現し、腫瘍増殖解析および局在化にさらなる利用が見込まれる。

遺伝子組み換えグリオーマモデル由来の神経球から頭蓋内マウスグリオーマモデルの生成

1. 遺伝子操作マウス(GEMM)モデルから神経球細胞の一次培養を生成するには、前述の^{プロトコル10,11,11}を用いる。
2. 記載されているように神経圏培地を調製する:ダルベックコの修飾イーグル培地F-12(DMEM/F12)の500mLは、50x B-27の10mLおよび100x N-2ニューロン培養サプリメントの5mL、100x抗生物質抗ミキサイトの5 mL、ノルモシンの1mLを補った。神経球をめっきする前に、20 ng/mLヒト組換えEGFおよびFGFを培地に添加する。
3. 37°Cで組織培養インキュベーター中の神経球を培養し、頭蓋内腫瘍の生着前に2〜3日間の_CO2を5%とした。
4. 手術当日、神経圏の神経膠腫を採取し、550xgで室温x gで5分間回転させます。細胞ペレットを邪魔することなく上清を慎重に除去する。
5. 神経球を解離するには、細胞ペレットを1mLの細胞剥離液で再懸濁し、37°Cで5%CO2で2〜4分間インキュ₂ベートする。インキュベーション期間後、1 mLマイクロピペットで上下の神経球をピペットし、単一の細胞懸濁液を確保する。
6. 非補充DMEM/F12培地の10 mLで神経球懸濁液を希釈することにより、細胞剥離液を不活性化する。550 x gで、室温で 5 分間回転させます。上清を慎重に取り除きます。
7. セルペレットを、サプリメントなしでDMEM/F12培地の100 μLに再懸濁します。細胞懸濁液を1:50希釈し、50 μLのトリパンブルーを加え、生存細胞を数えます。セルの濃度を決定するには、次の式を使用します。
   セル/mL = [((平方あたり数えられる)/数が数えられる四角形の数] x 50 x 10,000 セル/mL]
8. 細胞数を決定した後、100 μL体積で30,000細胞/μLの目標濃度を達成し、神経球をスピンダウンし、サプリメントを含み DMEM/F12の適切な体積で再中断します。
9. あらかじめラベル付けされた0.6 mLチューブに神経球を氷の上に置きます。
10. 移植前に麻酔、鎮痛薬、麻酔逆転の作業溶液を準備する:ケタミン/デクスメデトミジン麻酔のために、100 mg/mLケタミン塩酸塩の0.6 mLと0.5mg/mLデックスメデトミジン塩酸塩を0.6mLを加えるブプレノルフィン鎮痛薬の場合は、バイアルを含む0.9%NaClの9 mLに0.3 mg/mLブプレノルフィンの1 mLを加えます。アティパメゾール麻酔逆転の場合は、バイアルを含む0.9%NaClの9 mLに5mg/mLアティパメゾールの1 mLを加える。
11. 頭蓋内腫瘍の生着のために6-8週齢のC57BL/6J雌マウスを使用する。
12. げっ歯類の生存手術のために承認された部屋で、頭蓋内腫瘍の生着のための無菌供給を設定する。取り外し可能な33G針と殺菌された10 μLハミルトンの注射器が装備されているげっ歯類の立体質フレームの手術を行う。ビーズの殺菌器を利用して、手術の間に工具を殺菌する。
13. ステップ1.11で調製した麻酔液の単一の腹腔内注射(すなわち.p.)でマウスを麻酔する(ケタミン:75.0 mg/kgおよびデクスメデトミジン:0.5mg/kg)。約250μLの麻酔液がマウスの重さ20gに送られます。
14. マウスが深く麻酔状態になったら、滅菌ガソリンを眼に塗布して乾燥を防ぎます。マウスの頭蓋骨に毛皮を剃ります。殺菌するために10%ポビドネ-ヨウ素局所溶液を剃り領域に塗布する。
15. マウスの頭蓋骨を定位フレームに固定します。まず、口を鉗子で慎重に開き、舌をそっと引っ張り、口の片側に動かして窒息を防ぎます。鉗子で口を開いたままにして、立体性フレームの歯棒の鍵穴に上部切歯を置きます。
16. マウスヘッドを耳にかざし、眼窩後の骨に耳棒を置き、固定します。マウスの頭蓋骨が外科用卓上と同じレベルであることを確認します。耳の棒は慎重に頭蓋骨に圧力をかけないで固定します。次に、慎重にノーズバーを固定します。
17. サイズ15メスの刃を使用して、マウスヘッドに沿って切開を行い、頭蓋骨を露出させる。コリリリトラクターを使用して切開部位の皮膚を引き込む。滅菌アプリケーターを使用して、すべての腹蓋組織を除去します。
18. ブレグマを特定し、その上に直接ハミルトン注射器の針を下げます。フレームを使用して、針をブレグマの1mm前に、1.5mm側面に置きます。26G針を使用して、頭蓋骨を採点してこのスポットをマークします。
19. 0.45 mm ドリル ビットを装備したコードレスパワードリルを使用して、ターゲットサイトにバリ穴を作成します。基礎となる硬膜に到達するまでドリル。26G針でバリ穴の残りの骨を慎重に抽出します。
20. ピペットを使用して、細胞を十分に均質化し、7 μLの神経球懸濁液をシリンジに引き出します。シリンジが正常に動作していることを確認するには、70%アルコール浸しパッドに懸濁液の1 μLを分配します。
21. 針を硬膜の表面まで下げます。シリンジを3.5mmの腹側に下げ、0.5mm引き込む。これは、注入時に神経球が沈着するために脳内に0.5ミリメートルの空間を作成します。
22. 圧力平衡のために針を2分間所定の位置に置いておきます。ゆっくりとスムーズに1分間に1μLの細胞を送り出し、細胞が6分間落ち着くことを可能にします。
23. 滅菌生理液を使用して、頭蓋骨の表面を3回洗浄する。70%アルコールパッドに注射器の余分な細胞を分配し、別の70%のアルコールパッドで針をきれいに拭きます。注射器を滅菌PBSでリンスし、針の詰まりを避けます。
24. リトラクタを取り外し、慎重にステレオチックフレームからマウスを取り出します。3-0ナイロン縫合糸、鉗子、およびニードルドライバを使用して切開を閉じます。
25. 20gマウスに対して約100μLのアティパメゾール(1.0mg/kg)を投与する。ブプレノルフィン(0.1mg/kg皮下)を皮下に投与し、20gマウスで約70μLを投与する。術後マウスを清潔な回復ケージに入れ、警告とアクティブになるまで監視します。

2. 動物の灌流と脳の保存

1. 腫瘍の進行を監視するために、動物が腫瘍の負担の徴候を示すまで生体内イメージングシステムを使用して生体発光を決定する。マウスは10 6~10⁷光⁶子/sの間の信号に達すると安楽死させる。
2. ケタミン(75.0mg/kg)およびデクスメデトミジン(0.5mg/kg)溶液の腹腔内注射(i.p.)で腫瘍負担の徴候を示すマウスを麻酔する。約250μLを20gのマウスに送ります。その後、ペダル反射に反応しないマウスであることを確認します。
3. 鉗子を使用して、腹腔の上の皮膚を保持し、解剖はさみの大きなペアを使用して、腹膜壁を貫通することによって「Y」切開を行い、横隔膜を穿刺し、リブケージを切断する。
4. 鈍い20Gカニューレをマウスの心臓の左心室に挿入します。その後、心臓の右心房を切り取り、排泄を可能にする。
5. 酸素化タイロードの溶液(0.8%NaCl、0.0264%CaCl 2、0.005%NaH₂PO_4、0.1%グルコース、0.1%NaHCO_{3、0.02%KCl)}が、肝臓と肺が除去(5分)のために完全にクリアされるまでマウス循環系を流れるようにします。₂
6. さらに15分間タイロードの溶液に溶解した30%スクロース溶液を動物に浸透させ続けます。灌流の成功を評価するために、首、尾および脚が硬いポスト30%スクロース循環であることを確認する。
7. 解剖はさみの小さなペアを使用して、正中線で頭皮をカットします。後頭部骨から始まり、スナに向かって前進する。これは、頭蓋骨を露出します。
8. 一対の回転器を使用して、後頭部の骨から始まる頭蓋骨を突破し、脳の表面を完全に露出させるために前方に進み続ける。その後、頭の側を上に回し、頭蓋骨からそれを解放するために脳の基部の神経を解剖します。
9. RNaseフリー水で30%スクロース溶液を調製し、40 μmのナイロンメッシュフィルターでフィルター処理してRNAの分解を低減します。
10. スクロース溶液の浸潤を最大化するには、解剖した脳を30%スクロース溶液に入れ、一晩4°Cで保存します。さらに処理する前に、脳がスクロース溶液を含むチューブの底に達することを確認します。

3. 神経膠腫腫瘍を抱える脳の凍結保存

1. 脳を凍結保存する前に、冷たいイソペンタン/2-メチルブタンで満たされた瓶を準備し、液体窒素で満たされた容器に瓶を入れます。溶剤を冷まします。
2. 30%スクロース溶液から脳を取り除き、濾紙で乾燥させます。
3. クリオムオールに永久的なマーカーを付けます。気泡を避けて、約5mLのOCT(最適な切削温度化合物)をクライオムオールの中央に加えます。
4. 所望の向きでOCTを含むクリオマールに脳を置きます.脳が完全に水没するまで、OCTで金型を埋めます。きれいな鉗子を使用して、すぐに冷たいイソペンタン/2-メチルブタンにOCTと脳とのクリオムオールを置きます。
5. OCTが固まったら(30~40s)、脳と共にクリオムオールを取り除き、ドライアイスに入れます。2-メチルブタンに脳を含む型を2分過ぎて放置しないでください。

4. 凍結脳腫瘍組織の切除

1. ラベル 2 μm ポリエチレンナフタレート (PEN) スライドをサンプル情報と共に示します。組織切片は、断面後のこれらのスライドに直接配置される。
2. クライオスタットチャンバの温度を-20~-24 °Cの範囲に設定します。切り離す前に、サンプルブロックをクライオスタットチャンバーに入れ、チャンバー内の温度に平衡させて30〜60分間下さい。
3. 100%エタノールでクライオスタットチャンバーとナイフホルダーを洗浄し、RNase洗浄液と一緒に使用するブラシをスプレーします。クライオスタットチャンバー内で作業し、金型を取り外し、脳を含むOCTブロックをOCTと共にクライオスタット標本ディスクに取り付けます。
4. 使い捨てのブレードを切り離しホルダーに取り付けます。
5. 脳の厚さ10μmで切り離します。組織に筋や傷の線がないことを確認してください。ペイントブラシを使用して、慎重に平らにし、切断面に組織をアンカールします。
6. 脳の切片を含む組織をRNaseフリーPENガラススライドに慎重に取り付けます。正の荷電ガラススライドを指で組織の方向に反転させ、ガラススライドを組織セクションに向かって滑らかに押し下げます。
   注:手の温度は、組織がガラスに取り付けに役立ちます。
7. 脳の切片をスライドに取り付けた後、クライオスタットチャンバー内の箱にスライドを保管し、-80°Cで保管します。スライドを室温に保ちないでください。
   注:組織の折り畳み、および引き裂きが一般的です。正確な後分析のためには、これらのアーティファクトを最小限に抑えることが重要です。

5. 凍結保存脳組織切片の固定と染色

1. RNAの完全性を保つために、RNase洗浄液と使用するすべての器具をクリーニングしてください。ヒュームフード内の固定と染色プロトコルを進めます。
2. 記載された固定溶液をクリーンRNaseフリー50 mLチューブで準備します。染色の日にRNaseの自由な水ですべての解決を作る。
3. 同日、レーザーマイクロディシスが行われ、100%、95%、70%、50%のエタノール溶液を調製する。ソリューションを室温で密閉チューブに保管してください。
4. 75%エタノール溶液に4%クレシルバイオレットと0.5%のエオシンYを調製します。溶液を1分間激しく渦し、0.45 μmのナイロンフィルターで濾過し、未溶解粉末の痕跡を除去します。
5. 組織スライドを30sの95%エタノールで容器に入れ、75%エタノールを含むチューブにスライドを移す。スライドを30sのためにそこに残します。
6. 50%エタノールにスライドを移し、25 sのためにそこに残します。この時点で、OCT はディゾルブされます。スライドを20sの4%クレシルバイオレット溶液に移し、5sの場合は0.5%のエオシンY溶液に移します。
7. 染料溶液からスライドを取り出し、フィルターペーパーでスライドを乾かします。その後、スライドを25sの50%エタノールに入れ、スライドを25sの75%エタノールに移し、スライドを30sの95%エタノールに移し、スライドを60の100%エタノールに移します。
8. スライドをキシレンですすります。エキシレン付きの容器に移し、3分待ちます。
9. RNaseフリーの水に取り付け媒体(例えば、ピンポイントガム)を準備します。マウスの脳の切片を取り付けるには、RNaseフリー水中の取り付け媒体を1:10の割合で希釈します。
10. RNaseフリーの表面のスライドを室温で10 s乾かします。キシレンが乾く前に、組織切片でスライドを取り付けるに進みます。
11. 滅菌およびRNaseフリーの薄い絵筆でスライド上のティッシュの上に取付け液を穏やかに分散させる。10〜20 sを待ってから、すぐに組織スライドを顕微鏡顕微鏡解剖プラットフォームに移します。
    注:取り付けに使用されるRNaseフリー水に対する取り付け媒体の比率は、目的の組織によって異なります。取り付け媒体/水の比率はRNAの完全性に影響を与えずにレーザーの微小解剖のためのグリオーマ組織形態を維持する。

6. レーザーキャプチャマイクロディシブ

注:レーザーキャプチャマイクロディスセクション顕微鏡は、腫瘍組織内の特定の関心領域をレーザーマイクロディセックするために利用する必要があります。組織レーザーマイクロ解剖の時間を最小限に抑えるために、固定および染色の前にLMD顕微鏡を用意してください。

1. システムを起動するには、まず電源ストリップをオンにし、次にレーザーをオンにします。次に、顕微鏡コントローラとコンピュータの電源を入れます。LMD ソフトウェアを起動します。
2. [顕微鏡コントロール] で、[10 倍の倍率] を選択します。レーザー制御の下で、組織解剖のためのレーザーパラメータを設定します。最良の切断結果を得るには、レーザー周波数を120 Hzに設定します。必ずレーザー電流を100%に設定してください。
3. 正確なレーザーマイクロディセクショを得るためには、速度を10に、開口設定を2.0~10.0 μmに設定します。レーザーパワーを高い設定で持つことは、ガラスエッチングを引き起こす可能性があります。
4. 解剖後の組織を捕獲する組織コレクタをロードする。2 番目のアンロード ボタンをクリックします。空のコレクタを取り外し、30 μLのリシスバッファーを含むDNase/RNaseフリーの0.5 mL PCRフラットヘッドチューブをコレクターに配置します。コレクターをマシンに戻し、ソフトウェアの「続行」をクリックして続行します。
5. 加工した(固定され染色された)標本を顕微鏡に積み込みます。まず、LMD ソフトウェアの[アンロード]をクリックします。次に、スライドホルダーにサンプルを取り付け、スライドホルダーをステージに置きます。続行するには、ソフトウェアの[続行] をクリックします。
6. [シェイプ の切り取り] ウィンドウで、[描画 + 切り取り]を選択します。顕微鏡コントロールを使用して、対象領域を見つけます。対象領域(ROI)を描画し、デスティネーション コレクター チューブを選択します。複数のROIを描画して、1つのスライドから異なる領域を同時にマイクロ解剖することが可能です。
7. [切り取り開始]をクリックして、組織マイクロ解剖に進みます。関心のある領域を切り離した後、ホルダーからコレクターチューブを取り外し、ドライアイスの上にチューブを置きます。収集したRNA組織サンプルを-80°Cに移し、長期保存します。

7. 微小解剖グリオーマ組織のRNA分離

1. LMD からの RNA 抽出では、小さなサンプルと低い RNA 収量に最適化された RNA 分離キットを使用します (材料表を参照)。製造手順に従います。全ての分離ステップを室温(25°C)で行います。RNAの品質を維持するために、迅速に働きます。製造元の指示に従って、すべてのソリューションを準備します。
2. 1%β-メルカプトエタノールを使用して、サンプルの体積を 350 μL に調整し、リシス バッファーを使用します。40sの試料をボルテックスして、サンプルの粘度を低下させ、RNA溶出スピンカラム効率を高める。
3. サンプル全体を2mLのコレクションチューブに入れたgDNAエリミネータースピンカラムに移します。8,000 x gで30 sのチューブを遠心分離.フロースルーを保存し、遠心分離後のカラムに液体が残らないようにします。
4. フロースルーに350μLの70%エタノールを加え、上下にピペットを入れ、よく混ぜます。サンプルを、2 mLのコレクションチューブに入れたRNA溶出スピンカラムに移します。ふたをそっと閉め、遠心分離機は8,000 x gで15 s.フロースルーを破棄し、列を保存します。
5. RNA溶出スピンカラムに700 μLのRNA洗浄バッファー1(エタノール20%、900 mM GITC、10 mM Tris-HCl pH 7.5)を加えます。蓋をそっと閉め、8,000 x gで15sの遠心分離機をしてスピンカラム膜を洗浄します。フロースルーを破棄します。
6. 遠心分離後、RNA溶出スピンカラムを回収管から慎重に取り出して、カラムがフロースルーに接触しないようにします。
7. スピンカラムに第2RNA洗浄バッファー(エタノール80%、NaCl 100 mM、トリス-HCl 10 mM pH 7.5)の500 μLを加えます。柱の蓋を閉じ、8,000 x gを20 s回転してカラム膜を洗浄します。フロースルーを破棄します。
8. RNA溶出カラムを洗浄するには、80%エタノールの500 μLを加え、8000 x gで8000 x gの遠心分離機の蓋を閉じ、溶出液でチューブを投げ出します。
9. 新しいコレクションチューブを使用し、スピンカラムと遠心分離機の蓋を8000 x gで開け、5分間乾燥させます。溶出管を捨てる。
10. RNA溶出スピンカラムを新しい1.5 mLコレクションチューブに入れる。スピンカラム膜の中心に37°Cで直接加温したRNaseフリー水12μLを加えます。4分間、遠心分離機をフルスピードで1分間待ってRNAを溶出させます。

8. RNAの品質管理、ライブラリーの調製およびRNA-Seq分析

1. RNAの抽出と精製に続いて、RNAを増幅し、メーカーの指示に従ってピコモル濃度でのRNA分離に適した特別なキットを使用してcDNAライブラリを作成します(材料表を参照)。製造元の指示に従ってください。他のPCR製品との汚染やサンプルのヌクレアーゼ分解を避けるためにワークステーションを清掃してください。
2. RNAが4より大きいRIN値を有する場合、RNAは良好な品質または部分的にしか分解されない、断片化ステップを進める。氷の上のすべてのアイテムを準備します。
3. マスターミックスを作成します(表 1)。ヌクレアーゼを含まない薄壁0.2 mL PCRチューブで反応混合物を作成します。熱蓋サーマルサイクラーで94°Cのチューブをインキュベートします。断片化インキュベーション時間は、RNAの品質に依存します。リン≥ 7:4分、リン5-6:3分、リン4-5:2分。
4. インキュベーションに続いて、以前に-20°Cで冷却したPCRチラーラックにチューブを置き、2分間座らせます。
5. RNAサンプルの各チューブについて、最初のストランド合成反応マスターミックスを準備する(表2)。表3に記載の条件下で、ホット蓋サーマルサイクラーでチューブをインキュベートする。cDNA製品は、次のステップに進む前に2週間まで-20°Cで凍結することができます。
6. 表 4に示すように、PCR マスター ミックスを作成します。熱い蓋サーマルサイクラーにチューブを入れ、表5に示す設定でPCR反応を実行します。
7. DNAを精製するために使用されるビーズを室温まで温めます。温めたら、各サンプルにビーズを40μL加えます。チューブを回転させ、チューブの底部に液体を集めるために短時間混ぜてスピンダウンします。DNAがビーズに結合できるように、チューブを室温で8分間インキュベートします。
8. チューブを磁気分離装置に置き、約5分間、または溶液が完全に透明になるまで座らせます。分離装置上のチューブを維持し、ビーズを邪魔することなく慎重に上清を除去するためにピペットを使用しています。
9. チューブを分離装置に保管し、200 μLの作りたての80%エタノールをビーズに加え、ビーズを邪魔することなく洗浄します。80%エタノールを取り除く前に30 sを待ちます。この手順を繰り返します。
10. チューブを簡単に回転させ、分離装置にチューブを戻します。ビーズを邪魔することなく残存80%エタノールを除去します。
11. キャップを5分間開けてチューブを乾燥させます。ビーズが乾燥するので、長く座らせないでください。
12. チューブを分離装置に保管し、52 μLのヌクレアーゼを含まない水を加えてビーズを覆います。分離装置からチューブを取り出し、すべてのビーズが再懸濁されるまでピペットを上下に取り外します。室温で5分でインキュベートします。
13. 溶液が明らかになるまでチューブを分離装置に戻し、約1分で得られた上清の50 μLを8ウェルストリップのウェルに移します。各サンプルに40μLの新しいビーズを加えます。渦を徹底的に混ぜる。室温で8分間インキュベートすることでビーズをDNAに結合させます。
14. このインキュベーション期間中に、サンプル中に存在する任意のrRNAに使用する成分の解凍を開始します。解凍したら、氷の上に置きます。また、サーマルサイクラーを72°Cに予熱する。
15. 溶液がクリアされるまで(約5分)磁気分離装置上にサンプルを置きます。アリコート 1.5 μL のプローブを、冷却 PCR チューブにサンプルあたり。チューブを72°Cの設定で2分間、4°Cの予熱サーサイクラーに入れます。
16. サンプルチューブを磁気分離装置に入れておき、ビーズを邪魔することなくピペットで上清を取り除きます。その後、ビーズを邪魔することなく洗浄するために、ビーズに作りたての80%エタノールの200 μLを加えます。80%エタノールを取り除く前に30s待ちます。この手順を繰り返します。
17. チューブを簡単に回転させ、分離装置にチューブを戻します。ビーズを邪魔することなく残存80%エタノールを除去します。キャップを2分間開けてチューブを乾燥させます。ビーズが乾燥するので、長く座らせないでください。
18. 以下のコンポーネントを記載されている順序で組み合わせることにより、すべてのサンプルのマスターミックスを準備します (表 6)。
19. ボルテックスでマスターミックスを混合し、各サンプルの乾燥ビーズにミックスの22 μLを追加し、再中断するために完全に混合します。室温で5分間インキュベートします。
20. チューブを回転させ、磁気分離装置に1分間、またはサンプルが明らかになるまで置きます。新しいPCRチューブにビーズを邪魔することなく、上清の20 μLを移します。チューブを事前加熱サーマルサイクラーに入れ、表7の設定を下に置きます。
21. 各サンプルの反応に十分な PCR マスター ミックスを準備します。示された表 8のマスター ミックスに次のコンポーネントを追加します。ステップ8.20から各サンプルチューブに80μLのPCRマスターミックスを加え、サーマルサイクラーに次の設定を置きます(表9)。
22. DNAを精製するために使用されるビーズを室温まで温めます。温めたら、各サンプルに100 μLのビーズを加えます。DNAがビーズに結合できるように、チューブを室温で8分間インキュベートします。
23. チューブを磁気分離装置に置き、約5分間、または溶液が完全に透明になるまで座らせます。
24. 分離装置上のチューブを維持し、ビーズを邪魔することなく慎重に上清を除去するためにピペットを使用しています。
25. チューブを分離装置に保管し、200 μLの作りたての80%エタノールをビーズに加え、ビーズを邪魔することなく洗浄します。80%エタノールを取り除く前に30 sを待ちます。この手順を繰り返します。
26. 簡単に言えば、チューブを回転させ、分離装置にチューブを戻します。ビーズを邪魔することなく残存80%エタノールを除去します。
27. キャップを5分間開けてチューブを乾燥させます。ビーズが乾燥し過ぎるように長く座らせないでください。ピペット20μLのトリスバッファーを乾燥ペレットにする。分離装置からチューブを取り外し、ピペットと十分に混ぜてビーズを再中断します。室温で5分間インキュベートします。
28. チューブを分離装置に2分間置くか、溶液が明確になるまで置きます。上清を獲得し、新しいチューブに移します。その後、収集した溶液を-20°Cに保存します。
29. 品質と量の制御のための最終的なライブラリの必要を確認してください。製造元の推奨プロトコルに従って、サンプルをクラスター化し、組み合わせエンド 50 nt 読み取りとしてシーケンスします。

結果

当研究室では、睡眠美容トランスポザーゼシステムを用いて遺伝子操作マウスモデル(GEMM)を生成しました(図1A)。このシステムは、新生児マウスの神経前駆細胞のゲノムに特異的な遺伝的変化を組み込む。これらの変化した前駆細胞は内因性グリオーマ腫瘍を形成する。腫瘍を発生させるために使用されたプラスミド配列は次の例: (1...

ディスカッション

神経膠腫の不均一性と侵略の根底にある分子メカニズムを理解することは、新しい治療標的¹³を発見するために非常に重要である。本稿では、レーザー捕捉マイクロディション(LMD)に続いて、微小化解析を行い、それに続いて神経膠腫の不均質性と浸潤の分子景観を解析するための詳細かつ最適化された方法を説明する。

レーザー捕捉マイクロディショ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase Cell Detachment Solution	Biolegend	423201
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Antibiotic-Antimycotic (100X)	Gibco	15240062
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044
Buffer RLT	Qiagen	79216
Corning PCR Tubes	Sigma Aldrich	CLS6530
Cresyl Violet Acetate	Sigma Aldrich	C5042
DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12	Gibco	11330057
Eosin Y	Sigma Aldrich	E4009
HiSeq 4000	Illumina	N/A
Laser Microdissection (LMD) System	Leica	LMD7000
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502048
Normocin - Antimicrobial Reagent	Invivogen	ant-nr-1
Peel Away Disposable Embedding Molds	Electron Microscopy Sciences	70182
PEN Membrane Glass Slide (2 µm)	Lieca	1150518
Pinpoint Solution	Zymo Research	D3001-1
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B-1MG
Research Cryostat	Leica	CM3050s
RNaseZap RNase Decontamination Solution	Fisher Scientific	AM9780
RNeasy Plus Micro Kit	Qiagen	74034
SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian	Takara Bio	634411
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571